方法文章

从构造到晶体 - 迈向β桶外膜蛋白的结构解析

DOI：

10.3791/53245

⸱

2016年7月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β桶外膜蛋白 （OMP） 在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜内发挥多种功能。在这里，我们希望通过提出生产足够数量的β桶 OMP 的方案来缓解结构研究中已知的瓶颈，以便通过 X 射线晶体学或 NMR 波谱进行结构测定。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膜蛋白在细胞中发挥着重要功能，例如营养物质运输、运动、信号传导、存活和毒力，但仅占已知结构的 ~1%。膜蛋白有两种类型，α 螺旋和 β 桶。虽然 α 螺旋膜蛋白几乎可以在所有细胞膜中找到，但 β 桶膜蛋白只能在线粒体、叶绿体和革兰氏阴性菌的外膜中找到。一般来说，膜蛋白结构研究的一个常见瓶颈是获得足够的纯样品进行分析。为了帮助那些有兴趣解决他们最喜欢的β桶外膜蛋白 （OMP） 结构的人，提出了在可用于通过 X 射线晶体学和/或 NMR 波谱确定结构的水平上生产目标β桶 OMP 的通用方案。在这里，我们概述了天然表达和表达到包涵体中的构建体设计，使用亲和标签进行纯化，以及使用去污剂筛选、bicelle 和脂质立方相技术进行结晶。这些方案已经过测试，发现对革兰氏阴性菌的大多数 OMP 有效;然而，有一些靶标，特别是线粒体和叶绿体，可能需要其他表达和纯化方法。因此，此处的方法应适用于涉及革兰氏阴性菌 OMP 的大多数项目，但纯化样品的表达水平和量将根据目标 OMP 而变化。

引言

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β桶的OMPs只能在线粒体，叶绿体外膜中找到，和革兰氏阴性菌1-3。而他们服务相似的角色为α螺旋的蛋白质，它们有非常不同的褶皱包括中央膜包埋β桶结构域范围从8-26反平行β链与各链被紧密连接到两个相邻的股线的（ 图1和2）。的β桶结构域的第一个和最后一个链，然后与另一个在反平行的方式进行交互，几乎完全（除线粒体VDAC），以关闭和从周围膜密封β桶结构域。所有β桶的OMPs具有不同序列和长度的胞外环从而起到配体的相互作用和/或蛋白质 - 蛋白质接触中起重要作用，与这些环有时是75个残基，如在奈瑟氏菌转发现结合亲大蛋白A（TBPA）4。 β桶外膜蛋白也可以有哪些作为其他域的蛋白质的功能性用途的N端或C端周质的扩展（ 例如，巴马5-7，FimD 8,9，法德勒10）。而存在11许多类型的β桶的OMPs的，两种较常见的类型在下面描述为用于那些不太熟悉的领域中，（1）的TonB依赖性转运和（2）autotransporters例子。

的TonB依赖性转运（ 例如，FEPA，TBPA，BtuB，CIR， 等 ）是用于营养进口基本与包含一个N-末端插头域选自由被发现夹着内侧的22链β-C-末端〜150个残基的桶域嵌入到外膜12（ 图3）。虽然这种插头域防止基板从自由穿过枪管域，底物结合诱导插头域第内的构象变化在导致孔形成（通过插头重排或插头的部分/完整喷射）然后可以促进跨外膜衬底输送到周质。的TonB依赖性转运是革兰氏阴性细菌的一些致病菌株的存活特别重要，如已经进化出劫持营养素如来自人类宿主蛋白质4,13,14铁直接专门转运脑膜炎奈瑟氏球菌 。

Autotransporters属于革兰氏阴性菌的V型分泌系统，是指带有一个β桶结构域（通常为12-链与ESTA和ESPP）的是任一分泌或提出了在β-桶外膜蛋白和一位乘客域单元15,16（ 图3）的表面上。这些β桶的OMPs往往成为在细胞存活和毒力的重要作用与服务于乘客域或者作为蛋白酶，粘附，和/或其它EFfector介导的发病机制。

结构的方法，如X射线晶体学，核磁共振光谱，和电子显微镜（EM）允许我们确定在原子分辨率可反过来用于破译它们外膜内究竟如何发挥作用的外膜蛋白的模型。然后可用于药物和疫苗的开发，如果适用本宝贵信息。例如，转铁蛋白结合蛋白A（TBPA）被奈瑟氏球菌的表面上发现的和所需的发病机制，因为它直接结合人转铁蛋白，然后提取并导入铁为自身的生存。无TBPA， 奈瑟不能从人类宿主清除铁和呈现非致病。势必TBPA 4人转铁的晶体结构得到解决之后，它成为更清晰的两种蛋白质如何相关，哪些区域TBPA介导的相互作用，什么残基为铁提取重要由TBPA，和怎么一会开发针对脑膜炎奈瑟氏疗法针对跨界保护区。因此，给定的β桶的OMPs的革兰氏阴性菌的生存和发病机制中的重要性，以及在线粒体和叶绿体功能，以及需要了解这个唯一的类膜蛋白的额外的结构信息，并且其中它们的功能的系统，一般的协议都带有表达和结构方法在高位纯化的目标外膜蛋白为特征的总体目标。

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方案

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1.克隆与表达

注意:为了使结构研究，高度纯化的蛋白质的足够的数量必须准备，这通常与目标β桶外膜蛋白在大肠杆菌中的克隆和表达（OMP）开始大肠杆菌 （ 图4）。迄今为止，所有的β桶的OMP结构，包括那些结构线粒体VDAC，已经从细菌表达的蛋白11的。这里，一般协议提出了克隆，并直接表达β桶的OMPs为（1）天然表达到细菌膜和（2）表达成包裹体在体外复性17。

  1. 设计表达构建
    1. 获取或购买的密码子优化的目标OMP基因。
    2. 购买或获得含有一个周质定位信号序列的T7表达载体（i）中，N末端6X组氨酸标签，并在体内表达于膜或（ii）在不进行表达，以包涵体在体外复性周质定位信号序列的TEV蛋白酶位点4,18,19。
      注意:N-末端蛋白酶可切割的6倍或10倍，组氨酸标签将用于纯化的简单方法。与可溶性蛋白，变化亲和标签（组氨酸，链球菌，GST 等 ），亲和标记的位置，和蛋白酶位点的包容（TEV，肠激酶，凝血酶等 ）的选择用于后续标签去除。
    3. PCR扩增用合适的引物和亚克隆到表达载体中的靶序列。使用独立结扎的克隆（LIC）20,21或常规克隆技术（限制性内切酶/连接）进行亚克隆。然而，LIC可以促进高吞吐量，允许广大各种结构（截断，各种标签，多种启动子）的并行克隆更多容易。
  2. 体内膜定位的表达
    1. 使用序列分析来验证目标β桶的OMP的下游克隆并在帧与信号序列（ 即，规划环境地政局，OmpA的）中的表达构建体。
      注意:信号序列指导新生链的二段易位子用于分泌到周质和随后组装成外膜。
    2. 变换构造成细菌表达的表达菌株吹打1.0微升质粒入50μl的BL21（DE3）化学感受态细胞，并通过上下抽吸轻轻混匀。在冰上孵育30分钟。
    3. 在42ºC加热脉冲用于使用30秒的水浴，然后放回冰上1分钟。
    4. 加入1ml预热SOC培养基和使用台式摇床培养箱以1,000rpm于37ºC振摇1小时。
    5. 板100微升细胞在LB琼脂平板含有适当抗菌素IC和孵育过夜在37ºC反转。
    6. 通过接种5ml的LB +抗生素文化与单个菌落进行小规模试验的表达。重复5-10殖民地。
      注意:由于β桶OMP的潜在毒性和对基础表达水平的依赖的，集落到集落变性有时观察到。因此，筛选多个殖民地，建议对每个结构进行测试。对于小规模的表达试验，而不是传统的5毫升培养，生长在125ml带挡板锥形瓶中25毫升培养建议。这些条件往往更好地反映了大规模增长会发生什么。此外，这是一个好主意，还筛选各类文化传媒（TB，LB，的2xYT，M9 等 ），因为不同水平的成功都依赖于靶蛋白上的报道。
      1. 在37ºC增长振荡至〜0.6的OD 600。
      2. 通过广告诱导靶OMP的表达丁5微升的1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）到每个培养管中，并允许生长额外1-2小时。
      3. 通过使用离心在15000 XG离心1毫升各种文化（中〜0.6 OD 600）1分钟比较为所有殖民地的表达水平。
      4. 除去上清液和重悬细胞于200μl1×SDS-PAGE上样缓冲液中。热，在100ºC为5分钟，然后离心再次以15,000×g离心5分钟。
      5. 吹打20微升到10％凝胶的各孔分析使用SDS-PAGE的样品。在恒定200V。运行凝胶35分钟
        注意:这将是在这一点上有利，以便能够确定该蛋白靶标被正确折叠的或没有。这通常可以通过这样做的小规模纯化或通过测定热可修改来实现。
    7. 选择出最能表达殖民地和执行使用12-24 L培养基的大规模表达。
      注意:常规方法典型地生长在37ºC培养振摇至0.6〜的OD 600，然后用适当的诱导物诱导（ 即，0.1-1毫为IPTG或〜为阿拉伯糖0.2％）额外2-4小时。如果需要的话，前向感应，温度降低到低至20℃，延长诱导时间。
      1. 对于泄露表达方法，同比增长25毫升，37接种文化 ℃下在LB培养基含有适当抗生素（S），直至OD 600达到〜0.6。然后，加入1ml接种到TB培养基加抗生素（多个）十二1升烧瓶中并在20℃下生长至饱和（〜3天）。
    8. 收获离心将细胞在6000×g离心10分钟。
    9. 继续进行纯化步骤2.1节或在-80ºC冻结在用于长期贮存液氮细胞沉淀。
  3. 表达包涵体体外 Refol丁
    1. 使用序列分析来验证表达构建体不包含信号序列。没有信号序列的直接将靶蛋白在胞质溶胶中作为包涵体累积。
    2. 变换表达构建成细菌表达的表达菌株。对于包涵体表达，最好是控制感应（ 即 IPTG，阿拉伯糖等 ）的表达，以尽量减少可能的毒性作用。
    3. 板100微升转化细胞在含有合适的抗生素的LB琼脂平板上并在37过夜ºC反转。
    4. 通过接种5ml的LB +抗生素文化与单个菌落进行小规模试验的表达。
    5. 重复步骤1.3.4 2-4额外的殖民地。
    6. 在37ºC增长振荡至〜0.6的OD 600。
    7. 用1-2小时的适当诱导剂诱导。
    8. 比较表达水平对所有t他菌落使用SDS-PAGE分析（参见1.2.6步）。选择出最能表达殖民地和执行使用12-24 L培养基大规模的表达。
      1. 生长在37℃下将细胞以0.6-0.8的OD 600，并在37℃下诱导3-5小时。而表达包涵体是比其他类型的表达的更稳健，与所有的蛋白表达的实验中，表达可以通过改变生长培养基，诱导时间，诱导温度，诱导剂的浓度来提高。
    9. 收获离心将细胞在6000×g离心10分钟。
    10. 继续进行纯化步骤2.2节或在-80ºC冻结在用于长期贮存液氮细胞沉淀。

2.净化

  1. 从膜组分分离
    注意:相对于可溶性蛋白，整合膜蛋白嵌入到脂质双层，因此需要洗涤剂提取它们用于进一步纯化和分析（ 图5）。下面的表达式，在β桶OMP的纯化的第一步是从膜级分萃取。
    1. 以5毫升/克细胞糊的比例重悬细胞在裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH值7.4，200mM的氯化钠，10mM的MgCl 2的50微克/毫升AEBSF，5微克/毫升DNA酶I）。
    2. 裂解用法国压机或细胞匀浆细胞。旋裂解的细胞以15,000 xg离心30分钟，在4℃到除去未裂解的细胞和细胞碎片。
    3. 在4ºC高速（200,000 XG）再次转移上清至干净的试管离心1小时。所得粒料的膜部分含有感兴趣的蛋白质。
    4. 使用Dounce匀浆，重悬膜部分，第一转印膜，然后加入增溶缓冲液（50mM KH 2 PO 4 pH为7.5，200 mM氯化钠，20mM咪唑的，pH值8.0）（每个20 G细胞50ml）中以2倍浓度，不用洗衣粉。
    5. 倾将再悬浮的膜入一个小烧杯，并添加洗涤剂（ 即，正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM），月桂基二甲基-N-氧化物（LDAO），正辛基β-D-吡喃葡糖苷（OG），曲通X-100 等 ）慢慢倍至10倍的临界胶束浓度（CMC）的〜终浓度。
    6. 加水，直至1×增溶缓冲液的终浓度。搅拌0.5-16小时，在4ºC，这取决于如何容易目标蛋白质从膜中提取。
      注:洗涤剂用来慢慢溶解的膜，以提取目标蛋白质。有3种类型的洗涤剂，可以用在这里:离子（SDS，脱氧胆酸），非离子（Elugent，TWEEN，曲拉通X-100，OG，DDM），和两性离子（LDAO，CHAPS）。蛋白质 - 去污剂复合物，在纯化步骤是稳定的，单分散性将膜蛋白crystallizat的成功极大地帮助离子。关于洗涤剂，其属性，CMC的信息，以及它们在膜蛋白和其他应用的纯化使用的更多信息可以在商业供应商的网站上找到。
    7. 在4ºC离心溶解的样品30万XG 1小时。上清现在包含洗涤剂溶解的目标β桶OMP。
    8. 第2.3节进行概述如下。
  2. 从包涵体复性
    注意:对于体外复性，目标β桶OMP是直接表达成包涵体。这里的一个优点是，这些蛋白质可以以高的水平来制备。然而缺点是复性往往是低效率的，并从一个折叠试验到下一个而变化。不过，也有已经成功重折叠用于结构研究蛋白质的许多例子。下面的表达式成包涵体，人们现在必须隔离包涵体重折叠实验秒。
    1. 悬浮细胞在裂解缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH值7.4，200mM的氯化钠，10mM的MgCl 2的50微克/毫升AEBSF，5微克/毫升DNA酶I，4毫摩尔2-巯基乙醇（BME））（5毫升，每G细胞粘贴）。裂解使用一个法国记者，超声处理，或细胞匀浆。
    2. 沉淀通过低速旋包涵体以6000 xg离心10分钟，4ºC。
    3. 通过使用Dounce匀浆在25毫升的1.0M尿素再悬浮洗涤包涵体。再由低速旋转在6000 xg离心在4ºC沉淀10分钟。
    4. 重复步骤必要2.2.3。
    5. 悬浮洗涤包涵体至10毫克的终浓度/ ml的用含8.0 M尿素缓冲液（或6.0米胍盐酸盐（GdCl））以2倍的CMC或更高加洗涤剂（ 即，DCM或LDAO）。
      注:如果需要的话，对于含有一个组氨酸标签膜蛋白靶，固定化金属亲和层析（IMAC）纯化可使用变性共进行nditions（在8.0 M尿素或6.0米GdCl），为类似于第2.3节概述如下的初始步骤。
    6. 执行由缓慢（过夜）通过透析缓冲液中除去变性剂缺乏变性剂的重折叠反应。
      注意:这可能需要透析缓冲液的一些变化做到这一点。或者，如果包涵体首先结合到IMAC柱，可以执行重折叠反应，同时仍通过缓慢交换缓冲剂以除去变性剂结合到柱上。在这两种情况下，请记住，这是一种膜蛋白，因此，洗涤剂必须存在以稳定靶。此外，如果所用的去污剂是可透析，它必须被添加到透析缓冲液（S），以及。
    7. 旋复性的样品为20万XG 1小时，4ºC。上清包含复性洗涤剂溶解的目标β桶OMP。
    8. 第2.3节进行概述如下。
  3. 纯化，用我MAC，离子交换和凝胶过滤
    注意:假定蛋白已被工程改造用组氨酸标签，无论是本地表达或复性使用体外方法，则固定化金属亲和层析（IMAC）的纯化进行很像组氨酸标签的可溶性蛋白，但洗涤剂必须保持在所有后续的缓冲器，以防止溶解和稳定的目标β桶OMP。
    1. 准备1-5毫升IMAC柱或使用预装列。在4℃下执行后续层析步骤。用清水冲洗，以去除防腐剂的任何痕迹。如果使用自动净化系统，根据制造商的说明安装柱。
    2. 制成500毫升之IMAC缓冲液A（50mM的K 2 HPO 4，pH为7.5，200 mM氯化钠，0.1％DDM）和250毫升IMAC缓冲液B（50mM的K 2 HPO 4，pH为7.5，200 mM氯化钠，0.1％的DDM，和1.0M咪唑）。
      注意:可以使用的我的其它洗涤剂nclude Cymal-6（0.05％），曲拉通X-100（0.03％），和LDAO（0.05％）。
    3. 平衡用IMAC缓冲液A的10倍柱体积的IMAC柱
    4. 到蛋白质样品添加咪唑至25mM的终浓度并充分混合。以2毫升/分钟加载样品到平衡的IMAC柱。收集通过的流动。
    5. 与每个增加使用缓冲液B的咪唑浓度的5倍柱体积洗涤IMAC柱（ 即 25毫米，50毫米，100毫米）。收集在2ml级分的洗涤。
    6. 洗脱用250毫为5倍柱体积的最终浓度的样品。收集在2ml级分洗脱的样品。
    7. 通过分析的流动，洗涤级分，并使用SDS-PAGE分析洗脱的级分的基础上在280nm其吸光度（参考步骤1.2.6）。池含有靶β桶的OMP如通过SDS-PAGE分析证实的级分。
    8. （根据除去通过加入TEV蛋白酶的合并样本的6×组氨酸标签制造商的协议），并在4ºC温和摇动温育过夜。
    9. 再次装入样品/蛋白酶溶液到一个IMAC柱从切割的标签和任何未切割的样品中分离目标β桶OMP（流过）。流通过将包含缺乏标记的切割样品。
      注意:这也将消除任何蛋白酶像TEV-His的，其中也有一个非切割的6×组氨酸标签本身。否则，将需要其他方法消化后，除去蛋白酶。
    10. 任选地，进行离子交换色谱进一步纯化所述样本。按照制造商的说明使用的列，请务必提供在所有的缓冲区洗涤剂。
    11. 到结晶制备，将样品上的凝胶过滤柱加载到包含所述洗涤剂的缓冲液可用于结晶，例如25毫的Tris-HCl，pH值7.5，200mM的氯化钠，1％OG。
    12. 收集1- ml的组分分析USING SDS-PAGE分析（见 基于在280nm的吸光度步骤1.2.6）。用在280nm处的吸光度池馏分，因为它们含有的目标蛋白质。浓缩至〜10毫克/毫升。
      请注意:如果需要的话，适当的折叠可使用热修改性测定如下所述进行评估。
  4. 热火修改性分析
    注意:一种方法来监控纯化的β桶的正确折叠外膜蛋白是执行使用半天然SDS-PAGE 22热修改性测定。这里，被正确折叠的未加热的样品一般将迁移不同于那些热变性。这家酒店是唯一的β桶外膜蛋白，并广泛用于研究该家族的膜蛋白。
    1. 在此之前的样品制备，组装胶设备。首先，将缓冲罐成一个冰桶和冰完全包围。插入一个内部的铸造或商业天然梯度凝胶插入支架和放置到罐中。填写ŧ他完全罐用冷的1×MES运行缓冲液（50mM 2- [N-吗啉代]乙磺酸，50毫摩尔Tris碱，1mM EDTA中，0.1％SDS，pH7.3）中。
    2. 吸管0.25微升样品（10毫克/毫升）的成2个1.5 ml离心管中。标记一个作为"煮沸"，另一个为"RT"。
    3. 添加9.75微升样品缓冲液为每吹打混合。到两个样品，加10微升2×SDS上样缓冲液（100mM的Tris-HCl，pH值6.8，2％SDS，0.2％溴酚蓝和20％甘油）中，并通过移液轻轻混匀。
    4. 熬'水煮'样品在95°C下5分钟，同时保持在室温的"RT"样本。旋'水煮'样本简要介绍。
    5. 负载20微升两个样本的上预装的天然凝胶。在恒定150 V. 60分钟运行中取出凝胶，并在染色溶液中浸泡，以可视化的结果。

3.结晶

注意:对于两者的结晶可溶性和膜蛋白的目标，这是标准的协议，以最大限度地提高样品纯度和稳定性（ 即 ，最好洗涤剂，配体，辅因子等 ）。对于一般结晶膜蛋白靶现行方法包括满足双层包埋蛋白质的两亲要求三个主要的方法:（1）洗涤剂，（2）bicelle，和（3）脂质立方相（LCP）（ 图6）23。强烈建议一个纳升结晶机器人的使用时可能以增加的可筛选对于给定的样品体积的条件在旨在帮助结构测定（ 图7）的工具的数量，以及，利用最新进展。

  1. 使用清洁剂结晶
    1. 得到的洗涤剂增溶的蛋白质样品是在〜10毫克/毫升浓度。任选地，直接添加添加剂1,2,3- heptanetriol到样品的最终浓度为3％，以减少deterg耳鼻喉科胶束大小。
    2. 使用0.22微米的离心过滤器以除去颗粒和沉淀过滤样品。
    3. 使用结晶机器人，执行广泛的基质结晶使用市售的96孔的屏幕无论是通过悬挂或坐滴汽化法〜200 NL蛋白质样品和〜200 NL结晶缓冲组成滴筛选。
    4. 在〜21℃培养结晶板。检查每周用于使用立体显微镜晶体生长平板。
    5. 通过改变在一个系统的方式在结晶条件部件优化结晶引线（增加/减少的盐或沉淀剂浓度，缓冲液pH值，培养温度，和/或蛋白质浓度）。
  2. 结晶使用Bicelles
    注:bicelle技术的更详细论证先前已经由Ujwal和艾布拉姆森24描述。
    1. 准备或购买35％bicelle混合物由DMPC的:CHAPSO以2.8比:根据公布的协议25 1。其他浓度也可以被检测，以及，其它脂质和去污剂，如必要的。
    2. 得到的洗涤剂增溶的蛋白质样品是在〜10毫克/毫升浓度。
    3. 添加bicelle混合物，在冰上，以4为起始比:1体积/体积（蛋白质:bicelle）（ 例如，加10微升bicelle混合物至40微升的蛋白质，并通过移液快速混合）。
    4. 在冰上孵育30-60分钟。
      注:蛋白质:bicelle的解决方案应该主要留清楚，但往往会略有不透明。但是，如果该蛋白:bicelle溶液变为乳白色，表明沉淀，然后其他变量应该测定（ 即，洗涤剂，缓冲液等 ）。对于新的样品，做小规模的测试（8微升蛋白质和2微升bicelles）建议，以验证稳定扩大，以防止不必要的样品损失之前。
    5. 使用结晶机器人，执行广泛的基质结晶使用市售的96孔的屏幕无论是通过悬挂或坐滴汽化法〜200 NL蛋白质样品和〜200 NL结晶缓冲组成滴筛选。
    6. 在〜21℃培养结晶板。检查每周用于使用立体显微镜晶体生长平板。
    7. 通过改变在一个系统的方式在结晶条件部件优化结晶引线（增加/减少的盐或沉淀剂浓度，缓冲液pH值，培养温度，和/或蛋白质浓度）。
  3. 结晶使用脂质立方相（LCP）
    注:LCP技术的更详细论证先前已经由刘和Cherezov 26,27描述。
    1. 得到的洗涤剂增溶的蛋白质样品是在约20毫克/毫升浓度。
    2. 预暖油酸酯到〜40ºC。加载60微升油酸单甘油酯成一个气密100微升注射器和40微升蛋白质样品到另一个。
    3. 使用混合耦合器，连接注射器，小心不要引入空气。
    4. 通过在注射器柱塞从一个针筒推混合物到另一个完全直到样品变成半透明且均匀施加交替压力轻轻混匀。
    5. 使用结晶机器人专为LCP方法，进行广泛的基质结晶使用市售的96孔屏幕，三明治式结晶板（0.1毫米的厚度也）用100 NL蛋白样品和750 NL结晶缓冲组成滴筛选。
      注:如果需要的话删除比率可被调节。此外，固体覆盖（ 即，玻璃或厚塑料）建议支持液滴很好，而不是薄膜，这往往使滴移动有关以及将板处理。
    6. 孵育结晶p在鲈〜21℃。检查每周用于使用立体显微镜晶体生长平板。
    7. 通过改变在一个系统的方式在结晶条件部件优化结晶引线（增加/减少的盐或沉淀剂浓度，缓冲液pH值，培养温度，和/或蛋白质浓度）。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YiuR是一个依赖的TonB铁转运即对鼠疫耶尔森菌一个假定的疫苗的目标。使用微阵列分析它最初鉴定。这里，被送往确定利用X射线晶体YiuR的结构的步骤概述（ 图9）。用于克隆，YiuR的（去掉N端信号序列）的DNA序列进行PCR从基因组DNA扩增并亚克隆到含N-末端PELB信号序列和10×组氨酸亲和标签后跟一个TEV蛋白酶位点的载体。对于表达，含YiuR质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞，并用来生长5ml的起子培养单个菌落至OD 600〜0.5。含750毫升TB培养基十二烧瓶然后用1ml的发酵剂培养物接种，并让其在20°C 3天生长（以220rpm振荡）。然后收获细胞，产生约150-200g总细胞糊的，这是闪冷却在液氮中，并储存在-80ºC直至使用。

为YiuR的纯化，将20g单元的方式进行（1.8毫KH 2 PO <...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β桶的OMPs服务于革兰氏阴性菌，线粒体和叶绿体重要作用，并且用于结构分析，提供了大量关于在这些相应的细胞器的外膜基本分子机制信息的重要目标。然而，对于结构分析产生足够样品并不总是直截了当，因此，一般的管道提出了生产足够数量的目标β桶的OMPs结构测定的，详细说明从构建体晶体的过程。虽然这些协议已被测试，发现从革兰氏阴性细菌最外膜蛋白工作，有其局限性，有一些目标，特别是对线粒体和叶绿体，这可能需要用于表达和纯化的其他方法。因此，这里的方法应适用于该从革兰氏阴性细菌包括外膜蛋白大多数项目，但表达水平纯化样品S和量将取决于目标OMP变化。

有对β桶的OMPs的用于结构研究的表达两种常用的方法，（1） 在体内的表达直接进入外膜和（2）表达的包涵体在体外重折叠。对于体内表达方式，β桶外膜蛋白有针对性地E.外膜大肠杆菌在那里它们被本地折叠并直接从膜分离。表达的膜是优选的方法，因为目标是更可能被正确折叠。虽然这种方法通常产生整体蛋白质的水平较低，它避免了有时在体外复性相关的并发症。许多...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢 CNRS 的 Herve Celia 提供 UV 图像，感谢普渡大学化学系的 Chris Dettmar 和 Garth Simpson 提供 SONICC 图像。我们要感谢美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所以及美国国立卫生研究院校内研究计划的资助。此外，我们还要感谢来自美国国家普通医学科学研究所 （A.M.S. 和 CJ）、美国国家过敏和传染病研究所 （N.N. 1K22AI113078-01） 和普渡大学生物科学系 （N.N.） 的额外资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
结晶机器人TTP Labtech，Art Robbins-Any应该在这里工作，除了 LCP 结晶
PCR 热循环仪Eppendorf、BioRad-Media
ShakerNew Brunswick、Infors HT-UV-VIS
光谱仪Eppendorf-SDS-PAGE
仪器BioRad1645050、1658005
SDS-PAGE 和天然凝胶BioRad、Life Technologies4561084、EC6035BOX （BN1002BOX）
AkTA PrimeGEHealthcare-AkTA
净化GE Healthcare-
微量离心机Eppendorf-
离心机（低-中速）Beckman-Coulter-Ultracentrifuge
（高速度）Beckman-Coulter-SS34
转子Sorvall
型 45 Ti 转子Beckman-Coulter
型 70 Ti 转子Beckman-Coulter-Dounce
均质器Fisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
透析管SigmaD9652
LCP 工具Hamilton，TTP Labtech-VDX
24 孔板Hampton ResearchHR3-172
夹心板Hampton Research，分子维度HR3-151，MD11-50 （MD11-53）
Grace 结晶板Grace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR 色谱柱GE Healthcare17-1167-01
Q-琼脂糖凝胶柱GE Healthcare17-0510-01
结晶筛选Hampton Research， Qiagen， 分子尺寸-
气密注射器 （100 ml）汉密尔顿 
器

参考文献

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