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方法文章

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

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DOI：

10.3791/53245

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2016年7月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

本文内容

摘要

β-桶状外膜蛋白（OMPs）在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜中具有多种功能。本文旨在通过提供相关实验方案，解决结构研究中已知的一个瓶颈问题，即大量制备β-桶状OMP蛋白，以满足通过X射线晶体学或核磁共振波谱法进行结构解析的需求。

摘要

膜蛋白在细胞中发挥着重要的功能，如营养物质运输、运动性、信号传导、存活和毒力，但其已知结构仅占所有已知蛋白质结构的约1%。膜蛋白分为两类：α-螺旋型和β-桶型。α-螺旋膜蛋白几乎存在于所有细胞膜中，而β-桶膜蛋白仅存在于线粒体、叶绿体和革兰氏阴性细菌的外膜中。总体而言，膜蛋白结构研究中的一个普遍瓶颈是难以获得足够纯度的样品用于分析。为了帮助那些希望解析其感兴趣的β-桶外膜蛋白（OMP）结构的研究人员，本文提供了可用于X射线晶体学和/或核磁共振波谱法进行结构解析的、目标β-桶OMP的通用制备方案。本文概述了天然表达及形成包涵体表达的构建设计、利用亲和标签进行纯化，以及通过去垢剂筛选、bicelle（双层磁盘状胶束）和脂质立方相技术进行结晶的方法。这些方案已在多种来自革兰氏阴性细菌的OMP上测试并证实有效；然而，某些目标蛋白，特别是来自线粒体和叶绿体的OMP，可能需要其他表达与纯化方法。因此，本文所述方法适用于大多数涉及革兰氏阴性细菌来源OMP的研究项目，但不同目标OMP的表达水平和最终纯化产量会有所差异。

引言

β-桶状外膜蛋白（OMP）仅存在于线粒体、叶绿体和革兰氏阴性细菌的外膜中1-3。尽管它们的功能与α-螺旋蛋白相似，但其折叠结构截然不同，由一个跨膜的中央β-桶状结构域构成，该结构域包含8至26条反向平行的β-链，每条β-链均与相邻的两条β-链紧密连接（图1和图2）。β-桶状结构域的首条和末条β-链通常以反向平行方式相互作用（线粒体VDAC除外），从而将β-桶状结构域闭合并与周围膜环境隔离。所有β-桶状OMP均具有长度和序列各异的胞外环区，这些环区在配体相互作用和/或蛋白质-蛋白质接触中发挥重要作用，有时可长达75个残基，例如淋球菌转铁蛋白结合蛋白A（TbpA）中所见4。β-桶状OMP还可具有N端或C端的周质延伸区，作为蛋白质功能所需的额外结构域（例如，BamA5-7、FimD8,9、FadL10）。尽管存在多种类型的β-桶状OMP11，以下将介绍其中两种较为常见的类型，以帮助对该领域不太熟悉的读者理解：（1）依赖TonB的转运蛋白和（2）自转运蛋白。

依赖TonB的转运蛋白（例如，FepA、TbpA、BtuB、Cir 等）对营养物质的摄入至关重要，其结构包含一个位于N端的“塞子”结构域，该结构域由约150个残基组成，并嵌入到C端一个由22条β链构成的β-桶状结构域中，后者锚定于外膜12（图3）。该塞子结构域通常阻止底物自由通过桶状结构域，但当底物结合后，会诱导塞子结构域发生构象变化，从而形成孔道（通过塞子重排或部分/完全排出），促进底物穿过外膜进入周质空间。依赖TonB的转运蛋白对某些革兰氏阴性致病菌株的存活尤为重要，例如脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis），这类细菌进化出了特化的转运蛋白，能够直接从人体宿主蛋白中劫取铁等营养物质4,13,14。

自转运蛋白属于革兰氏阴性菌的V型分泌系统，是一类β-桶状外膜蛋白（OMP），由一个β-桶状结构域（通常为12条β链，如EstA和EspP）和一个被分泌至胞外或呈递于细胞表面的乘客结构域组成15,16（图3）。这些β-桶状外膜蛋白通常在细胞存活和毒力中发挥重要作用，其中乘客结构域可作为蛋白酶、黏附素和/或其他介导致病过程的效应分子。

X射线晶体学、核磁共振波谱法和电子显微镜（EM）等结构研究方法使我们能够以原子分辨率确定外膜蛋白（OMP）的结构模型，进而揭示它们在外膜中发挥功能的具体机制。如果适用，这些宝贵的信息还可用于药物和疫苗的研发。例如，转铁蛋白结合蛋白A（TbpA）存在于Neisseria的表面，是其致病所必需的蛋白，因为它能够直接结合人转铁蛋白，并从中提取铁元素供自身生存利用。缺乏TbpA时，Neisseria无法从人类宿主中获取铁，因而失去致病能力。在解析了人转铁蛋白与TbpA结合的晶体结构4后，人们更加清楚地了解了这两种蛋白如何相互作用、TbpA中介导该相互作用的区域、TbpA提取铁所依赖的关键残基，以及如何针对Neisseria的TbpA开发治疗药物。因此，鉴于β桶状外膜蛋白在革兰氏阴性菌的存活与致病过程中的重要性，以及其在线粒体和叶绿体功能中的作用，同时考虑到目前仍需获得更多关于这类独特的膜蛋白及其功能系统的结构信息，本文提供了通用实验方案，旨在高效表达并纯化目标外膜蛋白，以便通过结构生物学方法对其进行表征。

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方案

1. 克隆与表达

注意：为了进行结构研究，必须制备足量且高度纯化的蛋白质，这通常始于在大肠杆菌中克隆并过表达目标β-桶状外膜蛋白（OMP） E. coli (图4). 迄今为止，所有β桶状外膜蛋白（OMP）结构（包括线粒体VDAC的结构）均来源于细菌表达的蛋白质11此处提供了克隆和表达β-桶状外膜蛋白（OMPs）的通用实验方案，包括（1）直接在细菌膜中进行天然表达，以及（2）表达至包涵体中用于后续纯化和重构 体外 复性17.

  1. 设计表达载体
    1. 获取或购买密码子优化的目标OMP基因。
    2. 购买或获取一种T7表达载体（i），该载体包含周质定位信号序列、N端6x组氨酸标签和TEV蛋白酶切割位点4,18,19 用于 体内 表达至膜外或 (ii) 不含周质定位信号序列，从而表达至包涵体中 体外 复性
      注意：N端蛋白酶可切割的6x或10x组氨酸标签可为纯化提供简便方法。与可溶性蛋白相同，可调整亲和标签的选择（组氨酸、Strep、GST、 等等。），亲和标签的位置，以及蛋白酶切位点（TEV、肠激酶、凝血酶）的引入 等等。）以用于后续的标签去除。
    3. 使用适当的引物对目标序列进行PCR扩增，并亚克隆至表达载体中。采用连接酶无关克隆（LIC）方法20,21 或使用传统克隆技术（限制性内切酶/连接酶法）进行亚克隆。然而，LIC技术可促进高通量操作，更便于平行克隆大量不同类型的构建体（截短体、多种标签、多种启动子）。
  2. 在体 内 膜靶向表达
    1. 使用测序分析验证目标β-桶状外膜蛋白（OMP）已克隆至信号序列下游且读框正确即， pelB、OmpA）作为表达载体中的信号肽。
      注意：信号序列将新生肽链引导至Sec转位子，以分泌到周质空间，并随后组装到外膜中。
    2. 将1.0 μl质粒通过移液加入50 μl BL21(DE3)化学感受态细菌中，轻轻吹打混匀，将构建体转化至表达菌株中。冰上孵育30 min。
    3. 使用水浴在 42 ºC 下热激 30 秒，然后放回冰上 1 分钟。
    4. 加入1 ml预热的SOC培养基，在台式摇床培养箱中于37 ºC、1,000 rpm条件下振荡培养1小时。
    5. 将100 μl细胞接种至含有适当抗生素的LB琼脂平板上，37 ºC倒置培养过夜。
    6. 通过挑取单菌落接种至5 ml LB加抗生素培养基中，进行小规模表达检测。对5-10个菌落重复此操作。
      注意：由于β桶状外膜蛋白（OMP）可能存在毒性，且依赖于基础表达水平，有时会观察到菌落之间的变异。因此，建议对每个待测构建体筛选多个菌落。对于小规模表达测试，建议使用125 ml带挡板的锥形瓶培养25 ml培养液，而非传统的5 ml培养液。这些条件通常更能反映大规模培养时的情况。此外，还建议同时筛选多种类型的培养基（TB、LB、2xYT、M9）。 等等。），因为不同靶蛋白的实验成功率存在差异。
      1. 在37 ºC、振荡条件下培养至OD600 约 0.6。
      2. 通过向每根培养管中加入5 μl的1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导目标OMP的表达，并继续培养1–2小时。
      3. 通过离心各培养物1 ml（OD）来比较所有菌落的表达水平600 使用微量离心机在15,000 x g条件下离心约0.6密度单位1分钟。
      4. 移除上清液，将细胞重悬于200 μl 1x SDS-PAGE上样缓冲液中。100 ºC加热5分钟，然后在15,000 x g离心5分钟。
      5. 使用移液器将20 μl样品加入10%凝胶的每个加样孔中，通过SDS-PAGE分析样品。在恒定200 V电压下电泳运行35分钟。
        注意：此时能够确定目标蛋白是否正确折叠将非常有益。这通常可通过小规模纯化或热变性可调性检测来实现。
    7. 选择表达效果最佳的菌落，使用12-24 L培养基进行大规模表达。
      注意：常规方法通常在37 ºC、振荡条件下培养菌液至OD600 约为 0.6，然后加入适当的诱导剂进行诱导（即， 0.1–1 mM IPTG 或约 0.2% 阿拉伯糖）继续培养 2–4 小时。如需要，可在诱导前将温度降至 20 °C，并延长诱导时间。
      1. 对于渗漏表达法，将25 ml接种培养物在37℃下培养 °C 的含适当抗生素的 LB 培养基中培养至 OD600 达到约 0.6。然后，向十二个含 TB 培养基及抗生素的 1 L 三角瓶中各加入 1 ml 菌种，在 20 °C 下培养至饱和（约 3 天）。
    8. 通过离心收集细胞，6,000 × g 离心 10 分钟。
    9. 进入纯化步骤2.1，或在液氮中冷冻细胞沉淀，于-80 ºC长期保存。
  3.  包涵体表达 体外 复性
    1. 使用测序分析验证表达载体不含信号序列。缺乏信号序列将导致目标蛋白在细胞质中积累，形成包涵体。
    2. 将表达质粒转化至表达菌株中进行表达。对于包涵体表达，最好通过诱导来控制表达即， IPTG，阿拉伯糖 等等。以尽量减少可能的毒性作用。
    3. 将100 μl转化后的细胞接种至含有适当抗生素的LB琼脂平板上，倒置后于37 ºC过夜培养。
    4. 通过挑取单菌落接种至5 ml LB+抗生素培养基中，进行小规模表达测试。
    5. 对另外 2-4 个菌落重复步骤 1.3.4。
    6. 在37 ºC下振荡培养至OD600 约 0.6。
    7. 使用适当的诱导剂诱导1-2小时。
    8. 通过SDS-PAGE分析比较所有菌落的表达水平（参见步骤1.2.6）。选择表达效果最佳的菌落，使用12–24 L培养基进行大规模表达。
      1. 在37 °C下培养细胞至OD600 在37 °C下诱导3-5小时，OD600值为0.6-0.8。虽然包涵体表达比其他类型的表达更高效，但与所有蛋白表达实验一样，通过调整培养基、诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度，可进一步优化表达效果。
    9. 通过离心在 6,000 x g 下离心 10 分钟收集细胞。
    10. 进入纯化步骤2.2，或在液氮中冷冻细胞沉淀，于-80 ºC长期保存。

2. 纯化

  1. 膜组分的分离
    注意：与可溶性蛋白不同，内在膜蛋白嵌入脂质双分子层中，因此需要使用去垢剂将其提取出来，以便进行后续的纯化和分析图5）。表达完成后，β-桶状外膜蛋白纯化的第一步是从膜组分中提取。
    1. 用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，200 mM NaCl，10 mM MgCl₂）重悬细胞2，50 µg/ml AEBSF，5 µg/ml DNase I）按每克菌泥5 ml的比例加入。
    2. 使用法国压滤器或细胞匀浆器裂解细胞。将裂解后的细胞在4 ºC、15,000 x g条件下离心30分钟，以去除未裂解的细胞和细胞碎片。
    3. 将上清液转移至洁净离心管中，在4 ºC条件下以高速（200,000 × g）再次离心1小时。所得沉淀为膜组分，其中含有目标蛋白。
    4. 使用Dounce匀浆器重悬膜组分，先转移膜组分，然后加入溶解缓冲液（50 mM KH2PO4 pH 7.5，200 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8.0）（每 20 g 细胞使用 50 ml，2 倍浓度，不含去垢剂）
    5. 将重悬的膜样品倒入一个小烧杯中，并加入去垢剂（即， 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、十二烷基二甲基氧化胺（LDAO）、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）、Triton X-100 等等。）缓慢至终浓度约为临界胶束浓度（CMC）的10倍。
    6. 加水至终浓度为1x裂解缓冲液，4 ºC下搅拌0.5–16小时，具体时间取决于目标蛋白从膜中提取的难易程度。
      注意：使用去垢剂可缓慢溶解膜以提取目标蛋白。此处可选用三类去垢剂：离子型（SDS、脱氧胆酸）、非离子型（Elugent、TWEEN、Triton X-100、OG、DDM）和两性离子型（LDAO、CHAPS）。在纯化过程中，若蛋白-去垢剂复合物保持稳定且呈单一分散状态，将极大有助于膜蛋白结晶的成功。有关去垢剂的更多详细信息，包括其性质、临界胶束浓度（CMC）数据及其在膜蛋白纯化及其他应用中的使用，可参阅各商业供应商的网站。
    7. 在 4 ºC 条件下，以 300,000 x g 离心溶解后的样品 1 小时。上清液中 now 含有去污剂溶解的目标 β-桶状外膜蛋白（OMP）。
    8. 按照下文所述进行第2.3节操作。
  2. 从包涵体中复性
    注意：对于 体外 复性，目标β-桶状外膜蛋白直接表达进入包涵体。此处的一个优势是这些蛋白可实现高水平表达。然而缺点在于复性过程通常效率较低，且不同复性实验之间的结果往往存在差异。尽管如此，已有大量蛋白成功复性并用于结构研究的实例。在包涵体表达完成后，必须首先分离包涵体，以用于后续的复性实验。
    1. 在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，200 mM NaCl，10 mM MgCl₂）中重悬细胞2，50 µg/ml AEBSF，5 µg/ml DNase I，4 mM 2-巯基乙醇（BME））（每克菌泥使用5 ml）。使用高压破碎仪、超声处理或细胞匀浆器进行裂解。
    2. 在4 ºC下以6,000 × g离心10分钟，沉淀包涵体。
    3. 用Dounce匀浆器将包涵体在25 ml 1.0 M尿素溶液中重悬，洗涤。在4 ºC下以6,000 x g离心10分钟，再次沉淀包涵体。
    4. 根据需要重复步骤 2.2.3。
    5. 将洗涤后的包涵体重新悬浮于含有8.0 M尿素（或6.0 M盐酸胍（GdCl））和去污剂的缓冲液中，使终浓度为10 mg/ml即， DDM 或 LDAO，浓度为 2 倍临界胶束浓度（CMC）或更高。
      注意：如有需要，对于含有组氨酸标签的膜蛋白靶标，可采用变性条件（8.0 M 尿素或 6.0 M GdCl）进行固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，作为初始步骤，具体操作类似于下文第 2.3 节所述。
    6. 通过透析去除变性剂：在不含变性剂的缓冲液中缓慢（过夜）透析，以实现复性反应。
      注意：此过程可能需要多次更换透析缓冲液才能完成。或者，若包涵体已先结合至IMAC柱，则可在柱上进行复性反应，通过缓慢置换缓冲液以去除变性剂。无论采用哪种方法，需注意这是膜蛋白，因此必须添加去垢剂以稳定目标蛋白。此外，若所使用的去垢剂可透析，则也必须将其添加至透析缓冲液中。
    7. 在 4 ºC、200,000 × g 条件下离心复性样品 1 小时。上清液中含有复性后的去垢剂溶解的目标 β-桶状外膜蛋白（OMP）。
    8. 按照下文所述进行第2.3节操作。
  3. 使用IMAC、离子交换和凝胶过滤进行纯化
    注意：假设该蛋白质已通过组氨酸标签进行改造，无论其为天然表达或使用复性方法获得 体外 方法，然后进行固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，其原理与组氨酸标签可溶性蛋白的纯化类似，但后续所有缓冲液中均需保留去垢剂，以维持目标β桶状外膜蛋白的溶解性与稳定性。
    1. 准备一个1-5 ml的IMAC柱，或使用预装柱。后续层析步骤在4 °C下进行。用水冲洗以去除任何防腐剂残留。若使用自动化纯化系统，按照制造商说明安装色谱柱。
    2. 配制 500 ml IMAC Buffer A（50 mM K2HPO4，pH 7.5，200 mM NaCl，0.1% DDM）和250 ml的IMAC Buffer B（50 mM K2HPO4，pH 7.5，200 mM NaCl，0.1% DDM，和 1.0 M 咪唑
      注意：其他可使用的去垢剂包括 Cymal-6（0.05%）、Triton X-100（0.03%）和 LDAO（0.05%）。
    3. 使用10个柱体积的IMAC缓冲液A对IMAC柱进行平衡。
    4. 向蛋白样品中加入咪唑，使其终浓度为 25 mM，并混匀。以 2 ml/min 的流速将样品上样至已平衡的 IMAC 柱，收集穿流液。
    5. 用缓冲液B以5个柱体积依次洗涤IMAC柱，逐步增加咪唑浓度（即， 25 mM、50 mM、100 mM）。将洗涤液收集为每份2 ml的组分。
    6. 用250 mM的最终浓度洗脱液洗脱样品，共洗脱5个柱体积。将洗脱下来的样品收集到2 ml的组分中。
    7. 使用 SDS-PAGE 分析（参见步骤 1.2.6）检测流穿液、洗涤组分和洗脱组分在 280 nm 处的吸光度。根据 SDS-PAGE 分析结果，合并含有目标 β-桶状外膜蛋白（β-barrel OMP）的组分。
    8. 按照说明书将TEV蛋白酶加入合并的样品中，以去除6x-His标签，在4 ºC轻柔摇动条件下孵育过夜。
    9. 再次将样品/蛋白酶溶液上样至IMAC柱，以分离目标β-桶状外膜蛋白（流穿组分）与已切割的标签及任何未切割的样品。流穿组分将包含去除了标签的切割后样品。
      注意：这也会去除任何带有不可切割的6x-His标签的蛋白酶（如TEV-His）。否则，在消化反应完成后，将需要使用其他方法去除蛋白酶。
    10. 可选地，进行离子交换层析以进一步纯化样品。按照所用层析柱的制造商说明操作，并确保所有缓冲液中均含有去污剂。
    11. 为进行结晶准备，将样品上样至凝胶过滤柱，并使用含有用于结晶的去垢剂的缓冲液，例如 25 mM Tris-HCl，pH 7.5，200 mM NaCl，1% OG。
    12. 收集1 ml组分，并使用SDS-PAGE分析进行检测（参见 步骤1.2.6）根据其在280 nm处的吸光度进行分析。合并在280 nm处具有吸光度的组分，因其含有目标蛋白。浓缩至约10 mg/ml。
      注意：如有需要，可按照下述热变性检测法评估正确折叠情况。
  4. 热变性修饰性检测
    注意：一种监测纯化β桶状外膜蛋白（β-barrel OMPs）正确折叠的方法是利用半非变性SDS-PAGE进行热变性修饰实验。22此处，正确折叠的未加热样品通常会表现出与加热变性样品不同的迁移行为。这一特性为β-桶状外膜蛋白（β-barrel OMPs）所特有，且被广泛用于研究这类膜蛋白家族。
    1. 在制备样品前，先组装凝胶装置。首先，将缓冲液槽放入装有冰块的冰桶中，并用冰完全包围。将自制或商用的天然梯度凝胶插入凝胶支架中，然后放入缓冲液槽内。用预冷的1×MES电泳缓冲液（50 mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸，50 mM Tris碱，1 mM EDTA，0.1% SDS，pH 7.3）完全充满缓冲液槽。
    2. 将0.25 µl样品（10 mg/ml）移液至两支1.5 ml微量离心管中。将其中一支标记为“Boiled”，另一支标记为“RT”。
    3. 向每个样品中加入9.75 µl上样缓冲液，用移液器吹打混匀。向两个样品中各加入10 µl 2x SDS上样缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油），轻轻吹打混匀。
    4. 将“Boiled”样品在95 °C下煮沸5分钟，同时将“RT”样品置于室温下。短暂离心“Boiled”样品。
    5. 将20 μl的两种样品分别上样至预制的非变性凝胶中。以恒定150 V电压电泳60分钟。取出凝胶后置于染色液中浸泡，以显色观察结果。

3. 结晶

注意：对于可溶性蛋白和膜蛋白靶标的结晶，标准操作是最大限度地提高样品纯度和稳定性（即最佳去垢剂，配体，辅因子 等等。）。目前针对膜蛋白靶标结晶的常规方法主要包括三种，以满足双层膜中嵌入蛋白的两亲性需求：（1）去垢剂法，（2）bicelle法，（3）脂质立方相（LCP）法。图6)23建议在可能的情况下使用纳升级结晶机器人，以增加给定样品体积下可筛选的条件数量，并利用近年来为辅助结构解析而开发的工具进展。图7).

  1. 使用去垢剂进行结晶
    1. 获取浓度约为 10 mg/ml 的去垢剂溶解蛋白样品。可选地，将添加剂 1,2,3-庚三醇直接加入样品中，终浓度为 3%，以减小去垢剂胶束的尺寸。
    2. 使用0.22 µm离心滤膜过滤样品，以去除颗粒物和沉淀。
    3. 使用结晶机器人，通过商品化的96孔板筛选试剂盒，采用悬滴或坐滴蒸气扩散法进行广泛的矩阵式结晶筛选，液滴成分为约200 nl蛋白质样品和约200 nl结晶缓冲液。
    4. 将结晶板置于约 21 °C 条件下孵育。每周使用体视显微镜检查板内晶体生长情况。
    5. 通过系统性地改变结晶条件的组分（增加或降低盐或沉淀剂浓度、缓冲液pH值、孵育温度和/或蛋白质浓度），优化结晶先导条件。
  2. 使用双层胶束进行结晶
    注：Ujwal 和 Abramson 之前已对bicelle技术进行了更为详细的描述24.
    1. 根据已发表的实验方案，制备或购买由DMPC:CHAPSO按2.8:1比例组成的35%双脂质层微粒（bicelle）混合物25其他浓度以及其他脂质和去垢剂也可根据需要进行测定。
    2. 获取浓度约为 10 mg/ml 的去垢剂溶解蛋白样品。
    3. 将bicelle混合物在冰上以4:1 v/v（蛋白:bicelle）的起始比例加入例如， 将10 µl双脂质层混合物加入40 µl蛋白质中，用移液器快速混匀。
    4. 冰上孵育30-60分钟。
      注意：蛋白-双脂质体溶液应保持基本澄清，但常会略微变浑浊。然而，若蛋白-双脂质体溶液变为乳白色，表明已发生沉淀，则应检测其他变量即， 去垢剂，缓冲液 等等。）。对于新样品，建议先进行小规模测试（8 µl 蛋白和 2 µl 双脂质颗粒），以验证其稳定性，再进行放大实验，避免不必要的样品损失。
    5. 使用结晶机器人，采用商品化的96孔筛选板，通过悬滴或坐滴蒸气扩散法进行广泛的矩阵式结晶筛选，液滴组成为约200 nl蛋白样品和约200 nl结晶缓冲液。
    6. 将结晶板置于约 21 °C 条件下孵育。每周使用体视显微镜检查板内晶体生长情况。
    7. 通过系统性地调整结晶条件的组分（增加或降低盐或沉淀剂浓度、缓冲液pH值、孵育温度和/或蛋白质浓度），优化结晶初筛结果。
  3. 使用立方相脂质的结晶方法
    注：Liu 和 Cherezov 之前已对 LCP 技术进行了更为详细的演示26,27.
    1. 获取浓度约为 20 mg/ml 的去垢剂溶解的蛋白质样品。
    2. 将单油酸甘油酯预热至约 40 ºC。取 60 µl 单油酸甘油酯加入一支气密性 100 µl 注射器中，另取 40 µl 蛋白质样品加入另一支注射器中。
    3. 使用混合连接器连接注射器，注意避免引入空气。
    4. 轻轻推动注射器活塞，交替施加压力，将混合物完全从一个注射器推入另一个注射器，直至样品变为半透明且均匀。
    5. 使用专为LCP方法设计的结晶机器人，采用市售的96孔筛选板（三明治式结晶板，孔厚0.1 mm），进行广泛的矩阵结晶筛选，每滴由100 nl蛋白样品和750 nl结晶缓冲液组成。
      注意：如有需要，可调整液滴比例。此外，使用实心盖子（即， 建议使用玻璃或厚塑料材质的器皿，因其可很好地支撑液滴，避免使用易导致液滴在操作过程中于孔内移动的薄层材料。
    6. 将结晶板在约 21 °C 条件下孵育。每周使用体视显微镜检查板内晶体生长情况。
    7. 通过系统性地调整结晶条件的组分（增加或降低盐或沉淀剂浓度、缓冲液pH值、孵育温度和/或蛋白质浓度），优化结晶先导条件。

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结果

YiuR 是一种依赖 TonB 的铁转运蛋白，是针对 Yersinia pestis 的潜在疫苗靶点。它最初通过微阵列实验被鉴定出来。本文概述了利用 X 射线晶体学测定 YiuR 结构的步骤（图 9）。在克隆过程中，从基因组 DNA 中通过 PCR 扩增获得 YiuR 的 DNA 序列（去除 N 端信号序列），并亚克隆至一个含有 N 端 pelB 信号序列和 10×组氨酸亲和标签的载体中，其后接 TEV 蛋白酶切割位点。在表达过程中，将含有 YiuR 的质粒转化至 BL21(DE3) 感受态细胞中，并用单克隆接种 5 ml 起始培养液，培养至 OD600 ~0.5。随后，将 12 个装有 750 ml TB 培养基的锥形瓶各接种 1 ml 起始培养液，在 20 ºC 下振荡培养 3 天（转速为 220 rpm）。然后收集细胞，共获得约 150–200 g 湿菌体，迅速在液氮中冷冻，并于 -80 ºC 保存备用。

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讨论

β-桶状外膜蛋白（OMP）在革兰氏阴性细菌、线粒体和叶绿体中发挥着关键作用，是结构分析的重要靶点，能够提供关于这些细胞器外膜上重要分子机制的丰富信息。然而，获得足够量的样品用于结构分析并不总是容易实现，因此本文提供了一条通用的实验流程，用于制备足量的目标β-桶状OMP以进行结构解析，并详细阐述了从构建体到晶体的全过程。尽管这些实验方案已在多数来自革兰氏阴性细菌的OMP中经过测试并证明有效，但仍存在一定的局限性，即某些靶点（特别是来自线粒体和叶绿体的蛋白）可能需要采用其他方法进行表达与纯化。因此，本文所述方法适用于大多数涉及革兰氏阴性细菌来源OMP的研究项目，但具体表达水平和纯化所得样品的产量将因目标OMP的不同而有所差异。

用于结构研究的β-桶状外膜蛋白（OMP）表达主要有两种通用方法：（1） 体内 直接表达至外膜，以及(2)表达至包涵体 体外 复性。对于 体内 表达方法，β-桶状外膜蛋白被靶向至外膜 E. coli 其中它们天然折叠并直接从膜中分离。将目标蛋白表达至膜上是首选方法，因为这样更有可能获得正确折叠...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢法国国家科学研究中心（CNRS）的 Herve Celia 提供紫外图像，以及普渡大学化学系的 Chris Dettmar 和 Garth Simpson 提供 SONICC 图像。感谢美国国立糖尿病与消化及肾脏疾病研究所和美国国立卫生研究院院内研究计划提供的经费支持。此外，我们还感谢美国国立普通医学科学研究所（A.M.S. 和 C.J.）、美国国立过敏与传染病研究所（N.N. 1K22AI113078-01）以及普渡大学生物科学系（N.N.）提供的额外经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
结晶机器人TTP Labtech, Art Robbins-除LCP结晶外，任何型号均可使用
PCR扩增仪Eppendorf, BioRad-
培养基摇床New Brunswick, Infors HT-
紫外-可见分光光度计Eppendorf-
SDS-PAGE电泳装置BioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE及天然凝胶BioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
微量离心机Eppendorf-
离心机（低-中速）Beckman-Coulter-
超速离心机（高速）Beckman-Coulter-
SS34转子Sorvall-
Type 45 Ti转子Beckman-Coulter-
Type 70 Ti转子Beckman-Coulter-
Dounce匀浆器Fisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
透析袋SigmaD9652
LCP工具Hamilton, TTP Labtech-
VDX 24孔板Hampton ResearchHR3-172
三明治板Hampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace结晶片Grace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR色谱柱GE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose色谱柱GE Healthcare17-0510-01
结晶筛选试剂盒Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
气密注射器（100 ml）Hamilton 

参考文献

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