体外 肠道囊泡法评估胃肠道疾病模型中的黏膜通透性

摘要

本方案描述了使用离体肠组织制备物或“肠囊”作为肠道屏障功能的离体模型。ex vivo 模型可用于评估消化系统疾病动物模型中特定肠段上皮屏障和黏液凝胶层的完整性。

摘要

上皮屏障是胃肠道的第一道先天防御屏障，可选择性调控物质从管腔向深层组织区域的转运，限制小分子物质跨上皮转运，并几乎完全阻止大分子物质的上皮转运。这种选择性由黏液凝胶层决定，该层限制脂溶性分子的通过，同时受上皮细胞顶膜受体以及紧密连接蛋白复合物的调控。 体外 上皮细胞培养模型虽然使用方便，但作为模型系统，其缺乏微生物群、黏液凝胶、上皮层与免疫系统之间相互作用的复杂性。另一方面， 体内 可进行肠道吸收或通透性的评估，但这些检测方法仅能测量整个胃肠道的总体吸收情况，无法指示特定部位的吸收特征。 离体 使用通透性检测 "肠段" 是测量肠道整体完整性或特定分子相对转运能力的快速且灵敏的方法，具有可针对肠道特定部位的优势。本文描述了用于通透性研究的肠囊制备方法及表观通透性系数（P_应用程序) 分子穿越肠屏障的过程。该技术可用于评估药物吸收，或在胃肠道疾病动物模型中研究特定区域上皮屏障功能障碍。

引言

成人胃肠道的肠上皮屏障是一片黏膜表面区域，其面积估计约为 400 m²。因此，该屏障持续暴露于微生物、摄入的药物、营养物质以及细菌毒素的挑战之下。宿主不仅必须区分可耐受的共生菌与潜在的致病菌，还需阻止这些微生物及其分泌的分子穿过上皮屏障，同时允许营养物质的吸收。因此，肠上皮的作用是作为管腔内容物的选择性屏障¹。这一功能部分通过黏膜部位的固有上皮防御系统实现，该系统由组成型和可诱导型机制构成，形成一种可响应的生物系统²。

上皮屏障功能的丧失是多种胃肠道疾病的特征性病理表现。体内评估上皮屏障功能可通过口服灌胃示踪分子并随后进行血清分析来实现³。然而，该技术无法指示屏障功能障碍的具体部位。利用Transwell系统³和Ussing腔室^4,5分别进行的体外和离体跨上皮电阻检测，常被用作上皮屏障功能的替代指标，但缺乏动物模型中所包含的疾病生理学因素⁶。在本方案中，我们描述了一种离体组织制备模型，该模型可实现对肠道完整性的直接且定位的评估，并可用于在多个层面检测黏膜屏障功能。重要的是，该技术可应用于疾病动物模型，也可通过药理学干预进行调控，从而深入探究黏膜屏障功能障碍的机制。

方案

本方案中的所有动物实验均严格遵循纽卡斯尔大学动物伦理委员会批准的程序进行。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 将 TC199 培养基（Media 199）或杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）预热至 37 °C。用 95% O₂/5% CO₂ 混合气体通入培养基进行预氧合。检查培养基的最终 pH 值是否为 7.3。
2. 按每个囊袋准备两段 5 cm 的缝线。将缝线打成未闭合的环形结备用。

2. 消化道的解剖与制备

1. 安乐死前 12 小时撤除固体食物。如有需要，可在该期间给予动物营养凝胶补充剂。
2. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（[200 mg/kg]）实施小鼠安乐死，随后根据机构伦理规程进行颈椎脱位，并在腹部和胸部喷洒 70% 乙醇。
3. 使用剪刀在腹部中央做一横向切口，暴露腹膜。
4. 通过在幽门括约处剪断上段小肠与胃的连接，并在肛缘处剪断大肠，继续分离并移除胃肠道。用镊子轻轻去除肠系膜。将肠段置于预温并充氧的培养基中。
5. 确定用于评估通透性的肠段部位（图 1），并将其从其余肠管中剪下。
   1. 为保持动物间的一致性，十二指肠和空肠的取样部位应相对于胃进行测量，结肠和回肠的取样部位应相对于盲肠进行测量。
   2. 选择组织片段时，注意观察是否存在黏膜相关淋巴组织，例如派尔集合淋巴结。这些结构可在管腔浆膜侧辨认为小结节。
   3. 使用 1 ml 注射器，用预热的 PBS（37 °C）轻柔冲洗肠段内的管腔内容物至培养皿中。这些粪便内容物可根据需要丢弃或储存于 -80 °C 以备后续分析。

3. 肠囊制备

1. 准备一支1 ml注射器，内含300 µl待测化合物或分子。为评估黏膜完整性，可使用浓度为1 mg/ml、分子量为4,400的FITC-葡聚糖溶液。为提高检测灵敏度，也可使用分子量范围在4,400–70,000 Da之间的探针。将小型动物血管导管牢固地安装在注射器上。
2. 从肠段开口处量取5 cm，用缝合线环在此位置将肠段牢固结扎关闭。在肠管开口处轻轻套上预先打结的缝合线环，插入钝头导管。拉紧线环以固定肠段，并从注射器向肠腔内注入300 µl溶液，确保全部液体完全注入。
3. 在撤出导管的同时，同步收紧缝合线环，以确保肠囊闭合严密。将肠囊从肠管上剪下，放入盛有20 ml已预热至37 °C的充氧培养基的50 ml锥形管中。

4. 通透性测定

1. 将装有肠段的锥形管置于设定为37 °C的恒温水浴中。在0、30、60、90和120分钟的时间点，从锥形管中取100 µl样品并转移至96孔板中，每次取样后立即补充100 µl新鲜培养基。
2. 最后一次取样后，沿缝合处及肠段长度方向剪开肠段，暴露黏膜表面。
3. 测量每段肠组织的长度和宽度。如需要，可将肠段快速冷冻后于-80 °C保存，用于蛋白质或生化分析；或者 alternatively，将其保存于RNA稳定溶液中用于分子检测。
4. 构建FITC标记分子的标准曲线，稀释梯度为1至1 × 10^-6的对数稀释系列。
5. 使用荧光酶标仪检测样品及标准品的FITC信号，FITC激发/发射波长为495 nm/519 nm。

5. 每个单独肠囊表观渗透系数的计算

1. 将时间单位转换为秒。
2. 对于每个时间点，计算累积浓度 Q
   
   Q_t = (C_t*V_r) + (Q_{t sum}* V_s)，其中：
   
   Q_t = 时间 t 时的累积浓度
   C_t = 时间 t 时的浓度
   V_r = 接收侧体积
   Q_{t sum} = 所有先前 Q_t 值的总和
   V_s = 取样体积
    
3. 绘制 Q 随时间 (T) 变化的曲线，并计算斜率：δQ/δt
4. 计算表观渗透系数 (P_app)
   
   P_app = (δQ/δt)/(A*Co)，其中：
   
   A = 组织面积
   C₀ = 初始浓度

结果

本方案可用于研究胃肠道疾病动物模型中肠屏障功能的区域性变化。通过测量细胞旁路探针在胃肠道不同区域黏膜表面的通量⁷，可评估上皮紧密连接的完整性。此外，通过改变细胞旁路探针的大小（图2）或疏水性（图3），也可评估上皮层的扰动程度或黏液凝胶层的完整性。使用分子量较大的标记物可更灵敏地检测黏膜细胞旁通透性的细微变化，这些变化可能在跨上皮电阻（TEER）等电生理测量中不明显，但已足以引起细胞旁运输（图2）。黏膜炎症可能导致杯状细胞丢失，并减少通常覆盖并保护上皮界面的保护性黏液凝胶层。利用疏水性探针，也可评估肠道黏液凝胶层的完整性（图3）。此外，通过制备来自不同肠段的肠囊，可对屏障功能的区域性完整性进行分析。在不同的疾病动物模型中，屏障功能的区域性变化各不相同，因此与口服灌胃探针后进行血清检测相比，使用肠囊可实现对肠道屏障功能的局部评估（图4）。

讨论

本文详细介绍了用于评估离体状态下黏膜屏障功能的肠段分离与制备方法。ex vivo 肠囊制备技术主要应用于药物研发领域，用于研究候选药物在肠道中的吸收情况。然而，该检测方法同样适用于肠道疾病的研究。肠道通透性在不同区域可能存在显著差异，对特定部位通透性的评估有助于更深入理解黏膜完整性在消化系统疾病中的区域性作用。该方法稳定性良好，在适当的生理条件下，离体组织在死亡后最长可维持活性达6小时。在实施安乐死后，组织制备的速度至关重要，应尽快将肠内容物冲洗干净，并迅速转移至含氧培养液中。为确保动物个体间的实验一致性，准确识别正确的肠段位置十分关键（图1）。建议结肠和回肠节段以盲肠为起点进行测量，而十二指肠和空肠节段则应从胃部开始测量。由于不同品系、疾病模型或转基因动物的体型可能更大，其消化道长度也可能更长，因此在开展通透性检测前，建议先明确所用动物模型各肠段的平均长度。

除了区域一致性外，还需确保每个肠囊被切割成相同的长度，并向肠囊内注入正确体积的液体。这些因素的不一致将导致不同实验之间黏膜扩张程度不均。肠段扩张不足不仅会减少管腔内容物与黏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
德卡特尔  不可吸收丝线缝合线	布雷因特里科学公司	SUT-S 116
199 培养基（TC199）	Life Technologies	11043-023	不含酚红，因其会干扰荧光检测
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	21063-045	不含酚红，因其会干扰荧光检测
N-乙酰半胱氨酸	Sigma Aldrich		在培养基中使用浓度为 10 mM
小型动物血管导管：Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 4,400 分子量	Sigma Aldrich	FD-4
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 20,000 分子量	Sigma Aldrich	FD-20
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 70,000 分子量	Sigma Aldrich	FD-70