一种从小鼠脾脏中分离与扩增不变的自然杀伤T细胞的优化方法

摘要

本文介绍了一种经过优化的实验方案，可用于从小鼠脾脏中大量生成小鼠不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）。该方案详细阐述了富集、分离和扩增脾脏iNKT细胞的方法。 体外 使用有限数量的动物和试剂。

摘要

快速分泌细胞因子的能力是不变的自然杀伤T（iNKT）细胞谱系在受到刺激时的一种功能性特征。因此，iNKT细胞被表征为一类能够激活并调控适应性免疫应答的先天性T细胞群体。小鼠iNKT细胞培养与扩增技术的不断改进，有助于深入研究iNKT细胞生物学 体外 和 体内 模型系统。本文描述了一种优化的小鼠脾源性 iNKT 细胞分离与扩增实验方案。

从 C57Bl/6 小鼠中取出脾脏，进行解剖和过滤，所得细胞悬液铺于密度梯度介质上。经离心后，收集脾脏单个核细胞（MNCs），并分选其中 CD5 阳性（CD5⁺) 使用磁珠富集淋巴细胞。CD5亚群中的iNKT细胞⁺ 随后用负载αGalCer的CD1d四聚体对组分进行染色，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行纯化。分选后的iNKT细胞随后进行初始培养 体外 使用重组小鼠细胞因子与板结合的T细胞受体（TCR）刺激物联合处理，随后在小鼠重组IL-7存在条件下扩增。采用该技术，可获得约10⁸ iNKT 细胞可在培养 18–20 天内获得，之后可用于功能检测 体外，或用于 体内 小鼠中的转移实验。

引言

小鼠不变的自然杀伤T（iNKT）细胞是一类独特的先天性T淋巴细胞亚群，其在胸腺中由表达CD1d的皮质胸腺细胞所选择^1,2。iNKT细胞表达一种T细胞受体（TCR），该受体由不变的Vα14-Jα18 TCR链与Vβ8、Vβ7或Vβ2 TCR链之一配对组成³，能够识别在CD1d分子背景下呈现的内源性及外源性脂质抗原。例如，小鼠iNKT细胞可识别一种名为异球三己糖神经酰胺（iGb3）的内源性脂质抗原并被其激活⁴，也可被海洋海绵中分离出的糖脂α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）激活^5,6。依赖TCR的iNKT细胞激活可促进适应性免疫应答的启动，因此研究表明iNKT细胞在多种病理过程的改善或发展中发挥功能性作用，包括风湿性疾病⁷和癌症⁸。目前，合成的iNKT细胞配体正成为有前景的新型疫苗佐剂，可能具备调控多种免疫病理状态的能力。

已有研究表明，iNKT细胞可以被诱导产生 体外 然而，在从小鼠组织分离后，许多研究采用初级抗原呈递细胞（APCs）和/或细胞系 ⁹Vα14 TCR 转基因（Tg）小鼠 ¹⁰或胸腺瘤用于生成iNKT细胞来源的杂交瘤 ^11,12此外，大量小鼠的使用、高剂量的试剂（如负载αGalCer的CD1d二聚体）以及漫长的培养时间，使得某些已发表的实验方案在伦理和经济上缺乏吸引力。 ^9,13.

在本报告中，我们描述了一种改进的用于分离和纯化特定细胞类型的实验方法。该方法结合了机械解离与酶消化技术，以提高目标细胞的得率和活力。首先，将组织样本置于预冷的缓冲液中进行清洗，去除血液和碎片。随后，使用精细剪刀将组织剪切成约1 mm³的小块，并加入含有胶原酶Ⅳ和DNA酶Ⅰ的消化液，在37 °C下振荡孵育30–45分钟。每10分钟轻柔吹打一次以促进组织解离。消化完成后，加入含10% FBS的完全培养基终止反应，并通过70 μm细胞筛过滤获取单细胞悬液。收集滤液后，以300 × g离心5分钟，弃上清。细胞沉淀用红细胞裂解液重悬以去除红细胞污染，冰上孵育5分钟，随后再次离心并用PBS洗涤两次。最终细胞沉淀重悬于适当的培养基或缓冲液中，用于后续流式细胞分析、培养或冻存。本方法适用于多种实体组织，具有操作简便、重复性好、细胞活性高等优点。 关键词：细胞分离，酶消化，机械解离，单细胞悬液，胶原酶Ⅳ，DNA酶Ⅰ，红细胞裂解 体外 从小鼠脾脏扩增iNKT细胞。更具体而言，本方案描述了一种从小鼠脾脏富集iNKT细胞的方法，该方法可减少荧光激活细胞分选（FACS）所需的实验小鼠、试剂和时间，并提出了一种优化的策略用于扩增经分选的脾脏iNKT细胞 体外

方案

本研究使用成年（6-8周龄）雌性C57Bl/6小鼠。小鼠的饲养和繁殖均依照根特大学动物实验中心的指南进行。所有动物实验程序均经机构动物护理与伦理委员会批准。

1. 小鼠脾脏单个核细胞（MNCs）的制备

1. 通过颈椎脱位处死小鼠。
2. 将小鼠背部朝下放置于解剖板上，并用镊子固定后肢和前肢。
3. 用70%（体积/体积）乙醇/H₂O对皮肤表面进行消毒。
4. 沿腹部中线切开皮肤至胸部，使用无菌外科器械暴露脾脏。
5. 去除周围脂肪组织后，将脾脏放入含有1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板中，置于室温。
6. 使用无菌手术刀解剖脾脏，并将组织块转移至置于50 ml离心管上的70 µm尼龙滤膜中。
7. 用2 ml注射器活塞轻轻研磨脾脏组织，使其通过细胞筛滤器，并用5 ml 1×PBS冲洗。
8. 在15 ml离心管中加入3 ml Ficoll-Paque，然后将5 ml细胞悬液缓慢铺于密度梯度介质上方。
9. 在室温下以400 × g离心20分钟，不启用刹车。
10. 将界面层转移至新的15 ml离心管中，加入10 ml冷的1×PBS，于4 °C以300 × g离心10分钟。
11. 将细胞重悬于2 ml含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1×PBS（FACS缓冲液）中。取10 µl细胞悬液转移至小离心管，与10 µl 0.4%

2. 小鼠iNKT细胞的富集、检测与纯化

1. 小鼠脾脏 CD5阳性（CD5⁺淋巴细胞
   1. （可选）染色 10⁵ 细胞与FITC标记的抗CD5抗体（4 µl，1:30稀释/10⁶ 细胞）在4 °C避光孵育30分钟，用200 µl FACS缓冲液洗涤，并重悬于500 µl FACS缓冲液中。用1× PBS配制20 µM的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）工作液，取1 µl加入10⁵ 在FACS缓冲液中孵育细胞，室温下孵育5分钟。采集10⁴ 流式细胞仪上的预富集细胞。
      1. 使用 FCS-H 和 FCS-W，对 FSC-W 进行电子门控^lo 细胞以排除双细胞和聚集体（图1A）。然后通过电子门控去除DAPI⁺ FSC-W 中的（死亡）细胞^lo 种群（图1B），并使用SSC-A和FSC-A通过细胞大小对淋巴细胞群体进行电子选群（图1C).
      2. 使用淋巴细胞门内的细胞，绘制SSC-A与CD5的散点图，并对CD5进行电子门控⁺ 如图所示的淋巴细胞 图1D在流式细胞仪上获取剩余的预富集样品。
   2. 调整细胞数量至10⁷ 每90 µl FACS缓冲液中加入10 µl抗CD5微珠。
   3. 4 ºC 孵育 15 分钟，用 4 ml FACS 缓冲液洗涤一次，重悬于 500 µl 冷 FACS 缓冲液中。富集 CD5⁺ 根据制造商的建议，使用磁性细胞分离（MACS）柱分离淋巴细胞。
   4. （可选）染色 10⁵ CD5-FITC抗体（4 µl，1:30稀释/10⁶ 细胞）以及DAPI，如2.1.1节所述。采集10⁴ 在流式细胞仪上检测富集的淋巴细胞，并验证2.1.1步骤中设置的电子门是否选中CD5⁺ 富集细胞组分中的淋巴细胞。采集10⁵ 使用流式细胞仪检测细胞，并分析CD5阳性细胞的百分比⁺ 如图所示，富集组分中存在的淋巴细胞 图1E-H.
2. 通过流式细胞术检测和分离小鼠 iNKT 细胞
   1. 重悬富集的CD5⁺ 浓度约为10的淋巴细胞⁶ 每20 µl FACS缓冲液中的细胞数，缓冲液中含抗CD16/CD32（4 µl，1:50稀释/10）⁶ 细胞）和 PE 标记的 αGalCer/CD1d 四聚体（1 µg/10⁶ 细胞）。
   2. 室温避光孵育30分钟。
   3. 稀释小鼠单克隆抗体（mAbs）抗-CD3ε V500（4 µl，1:20 稀释/10⁶ 细胞）、抗CD19 e450（4 µl，1:50稀释/10⁶ 细胞）和抗CD8α e450（每10 µl使用4 µl，1:50稀释）⁶ 细胞）加入FACS缓冲液中，然后加入CD5⁺ 淋巴细胞，并在4 °C避光孵育30分钟。
   4. 用 1 ml FACS 缓冲液重悬细胞，于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，然后重悬于 4 ml FACS 缓冲液中，终浓度为 10⁷ 细胞/毫升
   5. 通过30 µm细胞滤网过滤细胞，并将细胞置于冰上。
   6. 根据制造商的建议对流式细胞仪进行细胞分选校准 ^14,15.
      注意：流式细胞仪用于细胞分选前的校准需要经过培训，应由经验丰富的操作人员或受过训练的技术人员完成。
   7. 每10 µl中加入10 µl浓度为20 µM的DAPI工作液⁶ 细胞，并在室温下孵育5分钟。采集约10⁴ 富集的 CD5⁺ 在流式细胞仪上对淋巴细胞进行分析。在电子门控中选择FSC-W^lo 细胞以排除双细胞和细胞聚集体（图 2A）。然后通过电子门控去除DAPI⁺ CD8⁺CD19⁺ 细胞（倾卸通道）在FSC-W内^lo 种群（图2B），并使用 SSC-A 和 FCS-A 通过电子方式选择淋巴细胞（图2C）如 2.1.1.1 所述。
      1. 将αGalCer/CD1d四聚体按CD3ε绘图，并对αGalCer/CD1d四聚体进行电子门控⁺CD3ε⁺ 如图所示的iNKT细胞  图2D. 获取不超过 2 x 10⁵ CD5⁺ 富集淋巴细胞以确定αGalCer/CD1d四聚体阳性细胞百分比⁺CD3ε⁺ 富集细胞组分中存在的iNKT细胞。
   8. 使用2.2.7中构建的电子门，对αGalCer/CD1d四聚体进行FACS分选⁺CD3ε⁺ 使用70 µm喷嘴，在70 psi压力下通过流式细胞仪分选iNKT细胞，流速设为“1.5”。将分选后的iNKT细胞收集至含有1 ml 100% FCS的FACS管中。随后用10 ml RPMI 1640培养基冲洗FACS管壁上的细胞，于4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
   9. 将分选的iNKT细胞重悬于1 ml RPMI 1640培养基中，取40 µl上流式细胞仪检测分选iNKT细胞的纯度。选择FSC-W^lo DAPI^- 淋巴细胞，如2.2.7节所述。图 2E-G以及电子门控αGalCer/CD1d四聚体⁺CD3ε⁺ 如图所示的iNKT细胞 图 2H.

3. 小鼠iNKT细胞的培养与扩增

第0天

1. 用纯化的抗CD3ε抗体（3 µg/ml）在室温下对平底96孔板进行包被，每孔加入1小时。用200 µl 1x PBS洗涤两次，再用200 µl完全RPMI 1640培养基（含10% vol/vol FCS、100 U/ml青霉素-链霉素、5.5 µM β-巯基乙醇）洗涤一次。
2. 使用0.4%台盼蓝染色法按1.11步骤计数活的分选后的iNKT细胞数量 ，在4 °C下以300 × g离心10分钟，然后重悬于含重组小鼠IL-2（10 ng/ml）、重组小鼠IL-12（1 ng/ml）和可溶性抗小鼠CD28抗体（5 µg/ml）的完全RPMI 1640培养基中，细胞浓度为5 × 10⁵ 个细胞/ml。将分选后的iNKT细胞以每孔10⁵个细胞的密度接种至已包被抗CD3ε抗体的孔板中，在37 °C、CO₂培养箱中培养2天。

第2天 

3. 将细胞转移至新的未包被的平底96孔板中，在37 °C、CO₂培养箱中，用完全RPMI 1640培养基静置培养2天。

第4天 

4. 通过轻柔吹打将细胞从培养板上吹下，并将细胞转移至新的15 ml离心管中。在4 °C下以300 × g离心10分钟，用含重组小鼠IL-7（5 ng/ml）的完全RPMI 1640培养基重悬细胞至浓度为5 × 10⁵ cells/ml ，然后将10⁵个细胞/孔接种于平底96孔板中，在37 °C、含CO₂的培养箱中培养4天。

第8天

5. 将细胞收集至新的离心管中，在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，然后用含可溶性抗 CD28（5 µg/ml）的完全 RPMI 1640 培养基重悬，调整细胞密度为 5 × 10⁵ 个细胞/ml。
6. 用纯化的抗 CD3ε 抗体（每孔 3 µg/ml）包被平底 96 孔板，洗涤步骤同 3.1。将 10⁵ 个细胞/孔接种至抗 CD3ε 包被的孔板中，于 CO₂ 培养箱中 37 °C 培养至第 11 天。

第11至18天

7. 重复步骤 3.4 至 3.6。

第19-20天

8. 将细胞转移至新的15 ml离心管中，在300 × g条件下离心，然后用完全RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为5 × 10⁵ 个细胞/ml。
9. 将细胞以每孔10⁵个细胞的密度接种于平底96孔板中，置于37 °C、CO₂培养箱中静置培养2天，待实验时使用。

4. 使用CD1d包被板法测定小鼠iNKT细胞的细胞因子产生

1. 在96孔平底板的每孔中加入100 µl重组小鼠CD1d（10 µg/ml溶于1×PBS），37 °C孵育1小时。
2. 用 200 µl 1×PBS 洗涤四次，每孔加入 200 µl 含 2% FCS 的 1×PBS（封闭液），37 °C 孵育 2 小时。
3. 除去封闭液，每孔加入 200 µl αGalCer（5 ng/µl），37 °C 孵育 16 小时。[αGalCer 溶液的配制：将溶于含 96 mg/ml 载体的 55 µg αGalCer 中加入 1,085 µl 1x PBS] 蔗糖，10 mg/ml 脱氧胆酸钠和 5 mg/ml Tween 20
4. 孵育后，弃去αGalCer溶液，先用200 µl 1× PBS洗涤2次，再用200 µl完全RPMI 1640培养基洗涤1次。
5. 收集 体外 第21天扩增的iNKT细胞，于4 °C下以300 × g离心10分钟，弃上清后重悬于完全RPMI 1640培养基中，调整细胞浓度至0.5 × 10⁶/mL⁶ 细胞/毫升
6. 每孔加入 200 µl iNKT 细胞重悬液，于 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 72 小时₂ 培养箱
7. 收集上清液，根据试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测目标细胞因子。

结果

采用密度梯度法分离脾脏单个核细胞约需1小时，且无需使用裂解红细胞（RBCs）的试剂。该方法可获得高产量的活细胞，并在组织过滤过程中去除产生的碎片。通常，脾淋巴细胞群体中iNKT细胞的频率占总T淋巴细胞的1%至5%，但该比例可能因实验动物的年龄、性别和健康状况而有所差异。从3只小鼠合并的脾脏中可获得约10⁶个iNKT细胞，而6至8周龄小鼠的脾脏中iNKT细胞的产量最高。

使用小鼠抗CD5磁珠可显著富集脾脏单个核细胞（MNC）组分中的iNKT细胞，除少量表达CD5抗原的B淋巴细胞外，通过该方法分离获得的绝大多数细胞均为CD5⁺淋巴细胞。例如，在CD5富集后获得的MNC中，约有5-8%为CD5阴性细胞（图1H）。在进行iNKT细胞的FACS分选时，联合使用αGalCer/CD1d四聚体与抗小鼠CD3ε抗体，可获得高于98%的iNKT细胞纯度；然而，建议在分选过程中使用针对脾脏B细胞和CD8 T细胞的FACS弃选通道（dump channel），以去除“黏连性”淋巴细胞群体。此外，应排除在CD5富集步骤中可能形成...

讨论

当前方案中的关键步骤包括CD5的分离及后续富集⁺ 淋巴细胞（第1节） & 2）、FACS 分选（第 3 节）以及 iNKT 细胞的初始铺板（第 4 节）。在第 1 节所执行的步骤中，需注意将脾细胞悬液小心地铺在密度梯度介质上方，以便离心后形成清晰的细胞界面。随后进行 CD5 富集⁺ 通过磁性细胞分离法富集淋巴细胞（第2节）可最大限度减少染色及FACS分选iNKT细胞（第3节）所需的试剂和时间，有助于提高分选后iNKT细胞的得率。最后，接种细胞数量应不超过10⁵ 培养的前2天，每孔接种的iNKT细胞数量应适中（第4节），因为接种密度过高可能导致细胞凋亡。

在修改和/或优化本实验方案时，需考虑若干重要因素：首先，所用动物的年龄至关重要。动物若年龄过大，或存在伴随感染，可能会影响从脾脏中分离、鉴别和通过流式细胞术分选获得足够数量细胞的能力。其次，在使用αGalCer/CD1d四聚体进行染色时，应保持细胞重悬于PBS缓冲液中的体积较小，因为过大的体积会稀释αGalCer/CD1d四聚体的染色效率，进而降低流式...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
重组小鼠 IL-2	eBiosciences	14-8021
重组小鼠 IL-12	eBiosciences	39-8122-65
重组小鼠 IL-7	eBiosciences	14-8071
纯化的抗小鼠 CD3e（145-2C11）	eBiosciences	16-0032-86
纯化的抗小鼠 CD28（37.51）	eBiosciences	16-0281-85
e450 标记的抗小鼠 CD19（eBio1D3）	eBiosciences	48-0193-82
e450 标记的抗小鼠 CD8α（53-6.7）	eBiosciences	48-0081-82
FITC 标记的抗小鼠 CD5（53-7.3）	eBiosciences	11-0051-81
V500 标记的抗小鼠 CD3ε（500A2）	BD biosciences	560771
抗小鼠 CD5（Ly-1）磁珠	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
纯化的抗小鼠 CD16/32（2.4G2）	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS 柱	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
台盼蓝，0.4%（wt/vol）	Gibco	15250-061
RPMI 1640 培养基	Gibco	12633-020
1× PBS	Gibco	10010-056	[不含 Ca2+/Mg2+]
胎牛血清	Gibco	10270
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-123
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
设备
96 孔 F 型底板	Greiner-bio one	657-160
24 孔板	Greiner-bio one	665-180
6 孔板	Greiner-bio one	655-180
15 ml 离心管	Greiner-bio one	188-271
50 ml 离心管	Greiner-bio one	227-261
70 µm 滤膜	Greiner-bio one	542-070
30 µm 滤膜	Millipore	SVGP01050
MiniMACS 分离器	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS 柱	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
水套式 CO2 培养箱	VWR
血细胞计数板	VWR
解剖工具包	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences