方法文章

从小鼠脾隔离和扩大不变的自然杀伤T细胞的优化方法

DOI：

10.3791/53256

⸱

2015年10月29日

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Laboratory for Molecular Immunology and Inflammation, Ghent University Hospital, 2VIB Inflammation Research Center, Ghent University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一种适应性方案，可用于从小鼠脾脏生成大量小鼠不变的自然杀伤 T 细胞。该方案概述了一种方法，通过该方法，可以使用有限数量的动物和试剂在体外富集、分离和扩增脾 iNKT 细胞。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

刺激后迅速分泌细胞因子的能力是不变的天然杀伤T（的iNKT）细胞谱系的功能特性。因此iNKT细胞的特征是一种天生的T细胞群体能够激活和转向适应性免疫应答。的改进的技术用于小鼠的iNKT细胞的培养和扩大发展能促进的iNKT细胞生物学中的体外和体内模型系统研究。这里，我们描述了分离和扩增的鼠脾iNKT细胞的优化过程。

从C57BL / 6小鼠脾脏被除去，解剖和紧张，将所得细胞悬浮液被层叠在密度梯度介质。离心后，脾单核细胞（MNCs）被收集和CD5阳性（CD5 +）淋巴细胞富集使用磁珠。是在CD5 +分数在iNKT细胞随后用^5;神经酰胺加载的CD1d四聚体和通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化。 FACS分选iNKT细胞然后最初在体外培养的小鼠重组IL-7存在下被扩展之前使用的重组鼠细胞因子和板结合的T细胞受体（TCR）的刺激的组合。使用这种技术，大约可以在18-20天的培养，之后可用于功能测定法在体外 ，或在小鼠体内转移实验，他们会产生10 8 iNKT细胞。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鼠不变的自然杀伤T（iNKT细胞）细胞是由CD1d的表达皮质胸腺细胞1,2在胸腺选择的先天T淋巴细胞的独特群体。 iNKT细胞表达由一个不变的Vα14-Jα18TCR链配对任Vβ8，Vβ7或Vβ2TCR的3，其能够识别内源性以及外国脂质抗原的CD1d的上下文中的T细胞受体（TCR）。例如，鼠iNKT细胞识别并通过内源性脂质抗原称为isoglobotrihexosylceramide（iGb3）4，以及α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）5,6-，糖脂自海绵中分离被激活。 TCR依赖性iNKT细胞的活化促进适应性免疫应答的引发，并作为其结果，iNKT细胞已被证明是功能上参与的范围病状包括风湿性疾病7和癌症的改善或发展 8。目前，合成的iNKT细胞的配体构成有希望的新的疫苗佐剂可以是能够调节的一些免疫病理状况。

先前已经证明，iNKT细胞可以在体外从以下然而小鼠组织分离来产生;许多研究中采用的使用主要抗原呈递细胞（APC）和/或细胞系9，Vα14TCR转基因（Tg）为10只小鼠，或胸腺瘤为的iNKT细胞衍生的杂交瘤11,12的产生。此外，大量的老鼠，大批量试剂如αGalCer加载CD1d的二聚体，和漫长的文化时代使一些出版协议不太道德和经济上的吸引力9,13。

在本报告中，我们描述了用于分离和在 iNKT细胞的小鼠脾脏体外扩增的方法适于。更具体地，协议描述了一种方法富集从小鼠脾脏这减少了所需的用于FACS细胞分选小鼠，试剂和时间，并提出了在体外扩展排序脾iNKT细胞的优化方法iNKT细胞。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这项研究中，成年（6-8周）雌性C57BL / 6小鼠。小鼠根据根特大学动物饲养的指导原则安置和饲养。所有动物的程序获得批准的机构动物护理和伦理委员会。

1.准备单核从小鼠脾细胞（跨国公司）的

  1. 通过颈脱位牺牲鼠标。
  2. 把鼠标放在解剖板背下来，并修复后和前肢与引脚。
  3. 消毒皮肤表面，用70％（体积/体积）乙醇/ H 2 O
  4. 切割沿腹部中线到胸部皮肤和使用无菌手术器械暴露脾脏。
  5. 修整周围脂肪组织后，将脾脏成24孔板含1ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下。
  6. 用无菌手术刀解剖脾脏和部分转移到70微米的尼龙过滤器放置在50毫升的浴缸即
  7. 采用2毫升注射器活塞，轻轻捣烂脾片通过细胞过滤和洗涤用5毫升1X PBS。
  8. 加入3 ml的菲可帕克的至15ml管中并覆盖与5 ml的细胞悬浮液的密度梯度介质。
  9. 离心在400×g离心20分钟，在RT下无制动。
  10. 相间转移到新鲜15ml试管，加入10毫升冷的1×PBS和离心机在300×g离心10分钟，在4℃。
  11. 重悬在2ml的1×PBS含有0.5％牛血清白蛋白（BSA）和1mM乙二胺四乙酸（EDTA）（FACS缓冲液）中的细胞。转移10微升细胞悬浮液到一个小管，混合，用10微升0.4％的

2.富集，检测和鼠标iNKT细胞的分离纯化

  1. 富集的小鼠脾脏CD5positive（CD5 +）淋巴细胞。
    1. （可选的）染色10 5个细胞与FITC缀合的抗CD5（4微升1点半稀释液/ 10 6个细胞）30分钟，在4℃下在黑暗中，洗净用200μlFACS缓冲液重悬在500μlFACS缓冲液。准备的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在1×PBS中20μM的工作溶液中，加入1微升其至10 5个细胞在FACS缓冲液，并在室温下孵育5分钟。获得10 4个预富集细胞上的流式细胞仪。
      1. 使用FCS-H和FCS-W，电栅极上的FSC-W 罗细胞以排除细胞双峰和聚集物（ 图1A）。然后，电子门出DAPI +（死）了FSC-W 罗群（ 图1B）内的细胞，并使用SSC-A和FCS-A按大小（ 图1C）电子选择淋巴细胞群。
      2. 使用淋巴细胞门控内的细胞，画出SSC-A与CD5和如图1D电子栅极CD5 +淋巴细胞。获取的流式细胞仪的预富集的样品的剩余部分。
    2. 调整细胞计数，以每90微升10 7个细胞在FACS缓冲液，并添加10微升抗CD5微珠。
    3. 孵育4ºC15分钟，用4ml FACS缓冲液重悬在500μl冷FACS缓冲液洗一次。富集CD5 +使用磁性细胞分离（MACS）淋巴细胞根据制造商的建议列。
    4. 可选）染色10 5个细胞与FITC缀合的抗CD5（4微升1:30稀释/ 10 6个细胞）和DAPI作为2.1.1。收购10 4富集淋巴细胞的流式细胞仪，并验证电子门2.1.1创建的。选择CD5 +淋巴细胞中富集的细胞部分。获得10 5个细胞的流式细胞仪分析的比例存在于富集馏分CD5 +淋巴细胞如图1E - 小时。
  2. 检测和小鼠的iNKT CE隔离LLS用流式细胞仪。
    1. 重悬富集CD5 +淋巴细胞在约10 6个细胞每20微升在含有抗CD16 / CD32的FACS缓冲液（4微升1:50稀释/ 10 6个细胞）和PE缀合的αGalCer的浓度/ CD1d的四聚体（1微克/ 10 6个细胞）。
    2. 下室温温育30分钟，在黑暗中。
    3. 稀释小鼠抗体（mAbs）的抗CD3εV500（4微升1:20稀释/ 10 6个细胞），抗-CD19 E450（4微升1:50稀释/ 10 6个细胞）和抗CD8αE450（4微升1:50稀释/ 10 6个细胞）在FACS缓冲液中，添加到CD5 +淋巴细胞和在黑暗中温育30分钟，在4℃。
    4. 通过在300×g离心FACS缓冲液离心10分钟，在4℃下重悬在4毫升，以10 7个细胞/ ml的终浓度清洗细胞用1ml的FACS缓冲液中。
    5. 通过30微米的细胞滤网过滤细胞，然后将细胞在冰上。
    6. 校准流式细胞仪对细胞根据制造商的建议14,15排序。
      注意:流式细胞仪的细胞分选的校准需要培训，并且可以由有经验的操作者，或受过训练的技术人员进行。
    7. 加入10微升的DAPI每10 6个细胞20μM的工作溶液，并在室温下孵育5分钟。获得大约10 4富集CD5 +淋巴细胞上的流式细胞仪。上FSC-W 罗细胞电子门，以排除细胞双峰和聚集物（ 图2A）。然后，电子门出DAPI + CD8 + CD19 +细胞 （转储通道）的FSC-W 罗群（ 图2B）内，并使用SSC-A和FCS-A作为2.1.1.1中描述的电子选择淋巴细胞（ 图2C） 。
      1. 剧情αGalCer/ CD1d的四聚体由CD3ε和电子门αGalCer/ CD1d的如图2D四聚体+CD3ε+ iNKT细胞。获得不超过2×10 5个CD5 +富集的淋巴细胞，以确定百分比αGalCer/ CD1d的四聚体+CD3ε+ iNKT细胞存在于富集细胞部分。
    8. 利用在2.2.7中创建的电子门。使用70微米的喷嘴处的'1.5'的流速，FACS排序αGalCer/ CD1d的四聚体+CD3ε+ iNKT细胞上的流式细胞仪，在70磅。收集在含有1ml 100％FCS一FACS管排序iNKT细胞。接着用10ml RMPI 1640培养基和离心将细胞在300×g离心10分钟，在4℃下冲洗从FACS管侧排序iNKT细胞。
    9. 重悬排序iNKT细胞在1ml的RPMI 1640培养基中，并获得40微升其上的流式细胞仪评估排序iNKT细胞的纯度。选择FSC-W LO DAPI -淋巴细胞参考译文]在2.2.7所述。 （ 图2E - G）和电子栅极αGalCer/ 如图2H的CD1d四聚体+CD3ε+ iNKT细胞。

3.文化和扩展鼠标iNKT细胞

0天

  1. 外套平底96孔板中，每孔纯化的抗CD3ε（3微克/毫升）处理1小时，在室温。用200μl的1×PBS和一次用200μl的完全RPMI 1640培养基（10％体积/体积的FCS，100U / ml青霉素 - 链霉素，5.5μMβ巯基乙醇）洗涤两次。
  2. 计数使用0.4％血球作为可行排序iNKT细胞（步骤2.2.8）的数量在1.11，离心机在300×g离心10分钟，在4℃，重悬在5×10 5个细胞/在完全RPMI 1640培养基毫升含有重组鼠IL-2（10毫微克/毫升），重组鼠IL-12（1纳克/毫升）和可溶性抗小鼠CD28（5微克/毫升）。薄板S在抗CD3ε涂层钢板orted iNKT细胞在10 5个细胞/孔，并在 CO 2培养箱中在37℃下进行2天。

第2天

  1. 在 CO 2培养箱转移细胞到一个新的未涂覆的平底96孔板中并培养静止的条件下将细胞在完全RPMI 1640培养基中，在37℃下进行2天。

第4天

  1. 通过温和移液移走从培养板上的细胞，将细胞转移到一个新的15ml试管。离心机在300×g离心10分钟，在4℃下，悬浮在5×10 5个细胞/在完全RPMI 1640培养基毫升含重组鼠IL-7（5毫微克/毫升），和板10 5细胞/孔在将平在 CO 2培养箱底的96孔板4天，在37℃。

8天

  1. 收集细胞的新管，离心300×g于4℃下用含有可溶性抗CD28（5微克/毫升）10分钟，并重新悬浮于5×10 5细胞/ ml，在完全RPMI 1640培养基。
  2. 外套平底96孔板中，每孔纯化的抗CD3ε（3微克/毫升）洗如3.1。板10 5个细胞/孔抗CD3ε包被的板并在37℃孵育在 CO 2培养箱直到11天。

第11天 - 18

  1. 重复步骤3.4至3.6。

19-20日

  1. 转移细胞到一个新的15ml试管中，离心以300×g离心，重悬在5×10 5细胞/ ml，在完全RPMI 1640培养基。
  2. 板的细胞在10 5个细胞/孔在平底96孔板中，并允许细胞休息2天，在37℃在一个实验使用之前CO 2培养箱。

4，细胞因子生产用鼠标iNKT细胞使用的CD1d开发平台电子商务结合的分析

  1. 外套平底96孔板用100μl重组鼠的CD1d的（在1×PBS中10微克/ ml）的每孔，孵育1小时，在37℃。
  2. 用200μl的1×PBS洗涤四次，在1×PBS（封闭溶液），每孔加入200微升2％FCS的孵育2小时，在37℃。
  3. 除去封闭溶液，每孔添加200微升αGalCer（5毫微克/微升），孵育所述板在37℃下16小时。 [对于制备αGalCer溶液，加1085μ1×PBS中至55微克αGalCer的溶于含96毫克/毫升蔗糖，10毫克/毫升的脱氧胆酸钠和5毫克/毫升吐温20的车辆。
  4. 温育后，弃去αGalCer溶液和洗两次以及用200μl1×PBS中，随后通过加入200μl的完全RPMI 1640培养基。
  5. 收集在体外扩增的 iNKT细胞在第21天，离心将细胞在300×g离心10分钟，在4℃下重悬在完成RPMI 1640培养基以0.5×10 6细胞/ ml的浓度。
  6. 加入200μl每孔的细胞的iNKT再悬浮并在 CO 2培养箱中孵育72小时，在37℃。
  7. 通过根据制造商的协议酶联免疫吸附试验（ELISA）收集感兴趣的上清液并测量细胞因子。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用密度梯度脾的单核细胞的分离需要大约1小时，并消除了使用以裂解红血细胞（红细胞）所需的试剂的。使用这种方法和碎屑的脏器应变被去除期间产生得到一种高收率的活细胞。通常，iNKT细胞的脾淋巴细胞池内的频率总T淋巴细胞的1至5％的范围内然而，这可以根据所使用的动物的年龄，性别和健康状况而变化。大约10 6 iNKT细胞可以从3只小鼠的合并脾和产量最高iNKT细胞来获取从6-8周龄小鼠脾脏被获得。

使用小鼠抗CD5磁珠显著丰富的脾MNC级分中iNKT细胞，除此表达该CD5抗原的B淋巴细胞的未成年人口，多数细胞使用这一步骤中分离构成CD5 +淋巴核细胞。例如，CD5浓缩后获得的跨国公司5-8％的CD5阴性（ 图1H）。为的iNKT细胞的FACS分选，结合αGalCer/ CD1d的四聚体和抗小鼠CD3ε产生的iNKT细胞纯度在98％以上然而，流式细胞仪转储通道脾B和CD8 T细胞应用于消除排序期间"粘性"的淋巴细胞群。此外，栅极指出可能在CD5富集步骤形成的任何双峰。使用这种流式细胞仪的设置，我们在99％（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在当前协议关键步骤包括分离和CD5 +淋巴细胞（第1和2）的随后的富集，FACS分选（第3节）和iNKT细胞的初始接种（第4节）。第1节执行的步骤，切记要仔细层中的脾细胞悬浮液密度梯度介质，使得不同的细胞相间的离心后产生的。随后的富集CD5 +淋巴细胞通过磁性细胞分离（第2部分）最大程度地减少染色所需的试剂和时间和FACS分类iNKT细胞（第3节），这有助于增加的iNKT细胞产量后的排序。最后，种子每孔不超过10 5 iNKT细胞的第2天的培养（第4节）作为接种井具有更高数目的iNKT细胞可导致细胞凋亡是重要的。

修改和/或troubleshoo时，许多因素都是重要的婷这个协议:首先，所用动物的年龄是非常重要的。动物是太旧，或有附件的感染，可能会阻碍你的能力来分离，区分和流式细胞仪排序足够的细胞从脾。其次，与αGalCer/的CD1d四聚体染色时，它保持细胞悬浮于PBS的体积缓冲液低过高的体积稀释了αGalCer/ CD1d的四聚体，这又减小四聚体的聚类的染色效率是重要+ iNKT细胞用流式细胞...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.E. 和 M.B.D. 是根特大学多学科研究平台 （MRP） 的成员，也是根特炎症性疾病中未折叠蛋白研究人员 （GROUP-ID） 联盟的成员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
重组鼠 IL-2eBiosciences14-8021
重组鼠 IL-12eBiosciences39-8122-65
重组鼠 IL-7eBiosciences14-8071
纯化的抗小鼠 CD3e （145-2C11）eBiosciences16-0032-86
纯化抗小鼠 CD28 （37.51）eBiosciences16-0281-85
e450 偶联的抗小鼠 CD19 （eBio1D3）eBiosciences48-0193-82
e450 偶联的抗小鼠 CD8&α;（53-6.7）eBiosciences48-0081-82
FITC偶联的抗小鼠CD5 （53-7.3）eBiosciences11-0051-81
V500偶联的抗小鼠CD3&ε;（500A2）BD biosciences560771
抗小鼠 CD5 （Ly-1） 微珠Macs Miltenyi Biotec130-049-301
纯化的抗小鼠 CD16/32 （2.4G2）Macs Miltenyi Biotec130-092-575
MACS MS 色谱柱Macs Miltenyi Biotec130-042-201
台盼蓝，0.4%（重量/体积）Gibco15250-061
RPMI 1640培养基Gibco12633-020
1x PBSGibco10010-056[Ca2+/Mg2+ - 游离]
胎牛血清Gibco10270
L-谷氨酰胺Gibco25030-123
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4458-100ML
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-100MG&
beta;-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
乙二胺四乙酸 Sigma-AldrichEDS-1KG
Ficoll-Paque plusGE Healthcare71-7167-00 AF
设备
96 孔板 F 底Greiner-bio 一个657-160
24 孔板Greiner-bio 一个665-180
6 孔板Greiner-bio 一个655-180
15 ml falcon管Greiner-bio one188-271
50 ml falcon tubeGreiner-bio one227-261
70 µm 过滤器Greiner-bio one542-070
30 µm 过滤器MilliporeSVGP01050
MiniMACS 分离器Macs Miltenyi Biotec130-042-102
MS 色谱柱Macs Miltenyi Biotec130-042-201
水套式 CO2 培养箱VWR
血细胞计数器VWR
解剖套件VWR
BD FACSAriaIIIBD生物科学公司

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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iNKT CD1d

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