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方法文章

一种快速定量的荧光法用于靶向蛋白质的小分子药物筛选

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DOI：

10.3791/53261

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2015年10月16日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于负载药物蛋白模板原位合成超小荧光金纳米簇（Au NCs）的小分子药物筛选方案。该方法通过蛋白模板化金纳米簇发出的可见荧光信号，简便地测定药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。

摘要

我们展示了一种新的药物筛选方法，该方法通过在载药蛋白中形成荧光金纳米簇（Au NCs），并基于Au NCs发射的差异性荧光信号，测定小分子药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。选择人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，测试了四种对白蛋白具有不同结合亲和力的小分子药物（例如，布洛芬、华法林、苯妥英和磺胺酰胺）。研究发现，在变性条件（即，60 °C或存在尿素）下，载药白蛋白蛋白内部荧光Au NCs的形成速率比在未载药的原始蛋白中更慢。此外，所形成NCs的荧光强度与这些药物对白蛋白的结合亲和力呈负相关。特别是，药物-蛋白结合亲和力越高，Au NCs的形成速率越慢，因而所得Au NCs的荧光强度越低。因此，所得Au NCs的荧光强度可作为所测试不同药物相对结合强度的简单度量。通过在固定蛋白浓度下改变预载入蛋白中的药物含量，该方法还可扩展用于测定特定的药物-蛋白结合常数（KD）。所测得的结果与其他权威但更复杂方法获得的数值高度一致。

引言

血清白蛋白（如人血清白蛋白 HSA 和牛血清白蛋白 BSA）是血浆中最丰富的蛋白质，在维持血液 compartment 的渗透压方面起着至关重要的作用。它们也被公认为是水溶性较低的小分子（如类固醇、脂肪酸、甲状腺激素以及多种药物）的载体蛋白。这些分子与血清白蛋白的结合特性（例如，结合位点、结合亲和力或结合强度）是药代动力学研究中的一个重要课题。1-4 目前已开发出多种分析方法用于研究不同药物与血清白蛋白的结合特性，例如 X 射线晶体学5,6、核磁共振（NMR）7-11 和表面等离子体共振（SPR）12,13 等。然而，这些方法往往受限于繁琐且耗时的分析过程（例如，X 射线晶体学所需的单晶生长）、需要专用且昂贵的设备（SPR），或需使用昂贵的同位素标记（NMR）进行检测。因此，开发一种快速、直接且成本效益高的小分子药物筛选替代方法具有重要意义。

金纳米簇（Au NCs）是一类特殊的纳米材料，包含数个至数十个金属原子，尺寸小于2 nm14-17。由于其离散且尺寸依赖的电子结构18,19以及类分子的吸收和发射特性20-23，这类材料引起了广泛的研究兴趣。这些独特的材料性质，尤其是强荧光性，在生物体系中的传感与成像等方面已获得广泛应用24-32。超小荧光金纳米簇可通过功能性蛋白质（如血清白蛋白）作为模板进行合成33。在典型的蛋白质模板法合成金纳米簇过程中，首先将一定量的金盐封装于蛋白质内部，随后由蛋白质自身将其还原。蛋白质的还原能力源于其组成中的功能性氨基酸残基（例如，酪氨酸），这些残基可通过提高溶液pH至碱性条件而被激活。蛋白质结构的去折叠被认为是金纳米簇形成的关键步骤，因为在去折叠状态下，更多的还原性功能基团可暴露并与封装的金盐接触。蛋白质去折叠可通过加热处理或暴露于变性剂来实现。引入小分子药物也可影响去折叠过程，即改变去折叠的中点变性温度和焓变34,35。所有这些因素的影响最终会反映在荧光金纳米簇的形成动力学上，并体现在所获得的金纳米簇的荧光强度中36。

本视频演示了一种药物筛选方法，即在载药白蛋白蛋白中于较高温度（60 °C）或变性剂（例如，尿素）存在下合成金纳米簇（Au NCs），以所得Au NCs的荧光强度作为信号读数。首先，在经60 °C处理或含尿素的HSA和BSA模板中合成Au NCs，以展示蛋白质去折叠（由热处理或变性剂诱导）对Au NCs形成动力学的影响。其次，在预先负载不同药物的蛋白模板中合成Au NCs，研究药物负载对所得Au NCs相对荧光强度的影响，从而评估药物与蛋白的相对结合强度。最后，通过改变固定浓度蛋白中预载药物的含量，对Au NC-药物筛选方案进行改进，以实现对药物-蛋白结合常数（KD）的定量测定。

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方案

警告：使用所有相关化学品前，请查阅其安全数据表（SDS）。药物筛选实验涉及纳米材料的合成与操作，其危害可能较块体材料更高。请确保在整个实验过程中采取所有必要的控制措施，包括使用工程控制设备（如通风橱）和个人防护装备（PPE，例如，长裤、不露脚趾的鞋、耐化学腐蚀手套和护目镜）。

1. 药物筛选用化学试剂的准备

  1. 合成金纳米簇的前体
    1. 将30 mg氯化金（III）溶液（痕量金属含量≥99.99%，30 wt.%溶于稀盐酸中）溶解于6.9 ml超纯水中，配制15 mM的氯化金（III）溶液。注意：氯化金溶液具有腐蚀性和刺激性，操作时应穿戴适当的个人防护装备，避免与眼睛和皮肤直接接触。
    2. 将74 mg HSA或BSA溶解于1 ml超纯水中，配制74 mg/ml的蛋白储备液。
  2. 药物溶液
    1. 将所需量的药物，例如，(a) 布洛芬1.9 mg、(b) 华法林2.8 mg、(c) 苯妥英2.3 mg、(d) 磺胺苯酰1.5 mg，分别溶解于20 µl DMSO中，配制450 mM的药物储备溶液。
      注：选择DMSO作为溶剂是因为这些药物具有疏水性，在水中溶解度较差。
  3. 其他试剂
    1. 将600 mg氢氧化钠颗粒溶解于10 ml超纯水中，配制1.5 M的NaOH溶液。将2.4 g尿素溶解于2 ml超纯水中，配制20 M的尿素溶液。

2. 蛋白质模板金纳米簇的合成

  1. 人血清白蛋白模板金纳米簇（HSA-Au NCs）
    1. 将两个玻璃小瓶分别放入两个可调温的磁力搅拌器中，每个小瓶内均放置一个微型磁力搅拌子。
    2. 将其中一个磁力搅拌器的温度设定为 60 °C，并将置于其上的玻璃小瓶标记为“60 °C”；另一个磁力搅拌器保持室温（RT），其上的玻璃小瓶标记为“RT”。
    3. 在持续搅拌条件下（除非另有说明，转速设定为 360 rpm），向每个小瓶中加入 200 µl HSA 溶液、200 µl 超纯水和 200 µl 氯金酸（III）溶液，以实现金离子在蛋白质模板内的包埋。
    4. 2 分钟后，向每个小瓶中加入 20 µl NaOH 溶液，以激活 HSA 的还原能力，启动 Au NCs 的形成，并将此时记为反应时间 0 分钟。
    5. 每隔 20 分钟，从每个样品中吸取 50 µl 溶液至 384 孔黑色微孔板中，使用微孔板读数仪测定发射光谱。典型的扫描参数设置：λex = 370 nm，λem = 410 – 850 nm。
    6. 反应 100 分钟后停止磁力搅拌。
    7. 将玻璃小瓶置于水槽中流动水下冷却。注意：玻璃小瓶温度较高，操作时需佩戴耐热手套以防烫伤。
    8. 绘制各样品在各时间点的光致发光光谱，以获得不同温度条件下 Au NCs 的形成动力学。
  2. 牛血清白蛋白模板金纳米簇（BSA-Au NCs）
    1. 将一个含有微型磁力搅拌子的玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，温度保持在室温。
    2. 在持续搅拌条件下，向玻璃小瓶中加入 200 µl BSA 溶液、200 µl 尿素溶液和 200 µl 氯金酸（III）溶液，混合均匀。
    3. 2 分钟后，加入 20 µl NaOH 溶液以激活 BSA 的还原能力，启动 Au NCs 的形成，并将此时记为反应时间 0 分钟。每小时测定一次反应混合物的光致发光光谱。
      注：由于尿素使蛋白质去折叠的效果较弱，相同温度下 BSA-Au NCs 的形成速率慢于 HSA-Au，因此 BSA-Au NCs 的光致发光光谱测定频率较低。
    4. 7 小时后停止磁力搅拌。绘制所有时间点的光致发光光谱，以观察通过尿素变性诱导的 Au NCs 形成动力学。

3. 小分子药物筛选

  1. 筛选不同小分子药物与HSA的相对结合亲和力
    1. 将五个玻璃小瓶（每个瓶中均含有一个磁力搅拌子）放置在可温控的多点磁力搅拌器上。分别标记这些小瓶为a、b、c和d，对应四种药物：布洛芬（ibuprofen）、华法林（warfarin）、苯妥英（phenytoin）和磺胺嘧啶（sulfanilamide）。将仅含纯HSA的样品标记为对照组。
    2. 向每个小瓶中加入200 µl HSA。向四个对应的小瓶中各加入1 µl药物溶液。向对照组中加入1 µl DMSO。开启搅拌器，设置转速为360 rpm，孵育1小时，使药物与HSA的结合反应充分完成。
    3. 1小时后，在持续搅拌条件下，向每个小瓶中加入200 µl Milli-Q水和200 µl氯金酸（gold (III) chloride）溶液。在持续搅拌下将温度设定为60 °C，反应10分钟。然后向每个小瓶中加入20 µl 1.5 M NaOH，并开始记录反应时间为0分钟。
    4. 迅速从每个小瓶中吸取50 µl溶液至384孔黑色板中，测量发射光谱（结果标记为0分钟）。每隔10分钟记录一次各样品的发射光谱。至少采集四个不同时间点的光谱数据，即0、10、20和30分钟。
    5. 重复步骤3.1.1–3.1.4多次，以获得具有一致趋势的结果。停止磁力搅拌器。
    6. 绘制各样品（a–d及对照组）的时间分辨光致发光光谱。确定所有样品的峰值强度，并将其对时间作图，以比较在不同载药蛋白模板中Au NCs的形成动力学。
  2. 测定特定药物与HSA的结合常数
    1. 重复步骤3.1.1–3.1.4。将药物溶液替换为四种不同浓度的布洛芬（ibuprofen）溶液（包括一个仅使用HSA、未加载药物的对照样品）。根据药物浓度相应地标记玻璃小瓶。
    2. 10分钟后，将玻璃小瓶置于水槽中用流动水冷却。注意：玻璃小瓶温度较高，操作时需佩戴耐热手套以防烫伤。
    3. 从每个小瓶中吸取50 µl上述溶液至384孔黑色板中，测量发射光谱。
    4. 再重复步骤3.2.1–3.2.3两次，以获得另外两组在不同药物浓度下的实验结果。
    5. 停止磁力搅拌器。绘制光致发光光谱并分析结果。
      1. 对于每批获得的原始数据，在OriginPro等软件中绘制各样品的光致发光光谱，并确定其峰值强度。
      2. 计算并绘制相对荧光强度[(I0 - I)/I0]随药物浓度的变化曲线，其中I和I0分别表示在载药HSA和纯HSA中形成的Au NCs的荧光强度。
      3. 通过将数据拟合至单一位点结合模型（使用Michaelis-Menten方程）来计算结合常数：Y = Rmax × C/(KD + C)，其中Rmax表示最大响应信号，C为配体浓度，KD为结合常数。可在OriginPro等软件中完成该分析：选择菜单“Analysis → Fitting → Nonlinear Curve Fit”，然后从Growth/Sigmoidal类别中选择Hill函数。在“Settings: Function Selection”页面中，点击Fit以显示拟合结果。

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结果

蛋白质去折叠是形成蛋白质模板化金纳米簇（Au NCs）的重要步骤，因为蛋白质中更多的活性功能基团（例如，酪氨酸残基）得以暴露，从而还原被包埋的金离子，加速Au NCs的形成速率。加热和添加外部变性剂是促进蛋白质去折叠过程的两种常用方法。图1以人血清白蛋白（HSA）为模型蛋白，展示了加热和添加外部变性剂对Au NCs形成动力学的影响。首先通过测量光致发光光谱随时间的变化来研究加热对Au NCs形成动力学的影响（图1A和1B）。当反应在60 °C下进行时，可在较短时间内（100分钟）快速形成红色发射的Au NCs，这由光致发光光谱中在670 nm处逐渐增强的明显发射峰所证实33,36（图1B）。相比之下，在相同时间内于室温下进行的反应，在670 nm处未观察到Au NCs的发射峰（图1A）。

还通过使用牛血清白蛋白（BSA）作为模板、尿素作为变性剂，研究了引入外部变性剂对金纳米簇（Au NCs）形成动力学的影响。...

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讨论

该方法中有若干关键步骤需要特别强调。在筛选不同小分子药物相对结合亲和力的实验方案中，步骤 3.1.2、3.1.3 和 3.1.4 对获得显示相对结合强度一致趋势的良好结果至关重要。在这些步骤中，添加试剂和抽取反应溶液进行检测的操作应尽可能迅速，以最小化时间延迟效应，同时应保持添加试剂和取样检测的顺序一致，以确保实验的可重复性。在测定布洛芬与人血清白蛋白（HSA）结合常数的实验方案中，步骤 3.2.4 对成功测定 KD 值极为重要。尽管可选择更多的浓度点，但因待测样品增多，时间延迟效应会更加显著。为最小化时间延迟效应，可在不同浓度下的反应体系合成可分批次平行进行。在每一批次中，均应包含一个不含药物的对照组，以确保实验一致性并消除可能的系统误差。

在本视频中，选择人血清白蛋白（HSA）作为模型蛋白，用于指导荧光金纳米簇（Au NCs）的合成，以进行药物筛选。仅使用了四种不同的药物， 即（a）布洛芬，（b）华法林，（c）苯妥英，以及（d）磺胺苯胺在此处被检测。事实上，该方法具有通用性，可被改造成多种形式。理论上，只要其他药物或小分子（如类固醇、脂肪...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Y.N.T. 感谢新加坡科技研究局（A*STAR）通过 JCO CDA 项目 13302FG063 提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 氯化金（III）溶液Sigma-Aldrich484385腐蚀性，刺激性
人血清白蛋白，96%Sigma-AldrichA1887
牛血清白蛋白，96%Sigma-AldrichA2153
布洛芬，98%Sigma-AldrichI4883 
华法林，98%Sigma-AldrichA2250
苯妥英Sigma-AldrichPHR1139
磺胺，99%Sigma-AldrichS9251
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418
尿素Sigma-AldrichU5128
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465
磁力搅拌器IKART5
酶标仪TecanInfinite M200
384 孔板Corning
5 ml 空气置换移液器Eppendorf
1,000 μl 空气置换移液器Eppendorf
100 μl 空气置换移液器Eppendorf
5,000 μl Eppendorf 吸头
1,000 μl Eppendorf 吸头
100 μl Eppendorf 吸头
1.5 ml 微量离心管Eppendorf
带螺口盖的 20 ml 玻璃小瓶
带螺口盖的 4 ml 玻璃小瓶

参考文献

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