本方案描述了通过血管顺行灌注去污剂对 Sprague Dawley 大鼠肾脏进行脱细胞处理，从而获得无细胞的肾脏细胞外基质，用作人类肾上皮细胞再接种的支架模板。再细胞化过程及利用刃天青灌注法监测细胞生长的操作在专门设计的灌注生物反应器中进行。
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摘要
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本方案详细描述了如何制备无细胞但具有生物功能的肾脏细胞外基质（ECM）支架，该支架可作为器官尺度组织发育的小规模模型基质。通过将导管插入Sprague Dawley大鼠的肾动脉进行插管，并以一系列低浓度去垢剂（Triton X-100和十二烷基硫酸钠（SDS））灌注26小时，从而获得结构完整、包含可灌注血管系统、肾小球及肾小管的全肾支架。脱细胞处理后，将肾脏支架置于自行设计的灌注式生物反应器容器中，经导管插入的肾动脉连接至包含蠕动泵、管路以及可选的pH、溶解氧和压力探头的灌注回路。使用过氧乙酸和乙醇对支架灭菌后，调节pH至7.4，随后在维持于37 °C和5% CO2的大型培养箱中，通过灌注培养基的方式准备接种细胞。经肾动脉注入四千万个肾皮质小管上皮（RCTE）细胞，在高流速（25 ml/min）和高压（约230 mmHg）条件下快速灌注15分钟后，将流速降低至生理水平（4 ml/min）。RCTE细胞主要定植于肾皮质内的小管ECM微环境，在连续七天的灌注培养中增殖并形成小管状上皮结构。在更换培养基期间，将含有44 µM刃天青（resazurin）的溶液灌注通过肾脏持续1小时，以进行基于荧光检测的氧化还原代谢分析，评估细胞在小管形成过程中的活力与增殖情况。该肾脏灌注生物反应器支持对培养基进行无创取样以进行生化分析，多个进样口还允许通过肾静脉或输尿管逆行接种其他类型细胞。本方案可用于在该系统内快速评估多种细胞类型（包括血管内皮细胞、小管上皮细胞和间质成纤维细胞）对肾脏支架的再细胞化效果。
引言
随着终末期肾衰竭患者人数持续增加，可用于移植的供体肾脏数量严重且日益短缺。由于无法满足等待肾移植患者数量不断增长的需求，科研人员开始致力于肾脏器官工程研究，最终目标是按需开发可定制的、可植入的肾脏移植物1,2。利用患者自身的细胞构建具有功能的肾组织，将消除终身免疫抑制治疗的需要，缩短患者在等待肾移植期间接受透析的时间，并使更多慢性肾病患者获得挽救生命的移植机会。
利用患者来源的细胞进行肾脏组织生物工程的第一步是构建一种支架，作为肾实质（例如 肾小管上皮细胞）、间质成纤维细胞和血管细胞生长的支持性基质。来源于天然器官细胞外基质（ECM）的生物材料支架具有多种特性，使其适用于组织工程，包括其天然的生物学组成；适宜的宏观和微观结构以赋予生理功能；以及良好的细胞相容性，可促进细胞黏附、迁移和建设性组织重塑3。一种有前景的制备肾脏组织再生支架的方法是通过对同种异体或异种来源的肾脏进行脱细胞处理，该方法能够保留肾脏ECM大部分复杂的天然蛋白质组成4，维持器官固有的结构复杂性，并在支架再细胞化后为发育中的细胞提供血管供应，从而克服自下而上构建厚实细胞化组织所面临的难题5。
灌注脱细胞是一种通过器官血管网络均匀输送去污剂、酶或其他破坏细胞的溶液的过程6。该策略已被确立为一种高效的方法，可用于制备基于无细胞器官的....
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方案
伦理声明：所有涉及动物的实验操作均依照西北大学机构动物护理和使用委员会批准的指南进行。
1. 肾脏脱细胞
- 制备脱细胞溶液。为每只待脱细胞的肾脏准备以下体积的试剂，并额外多准备一份体积（例如，对于4个肾脏，准备5,000 ml 步骤 1.1.3 中使用的 Triton X-100：
- 准备 500 ml 反渗透水（ROH2O）。注意：在使用 ROH 的步骤中，也可使用去离子水2O 被标示出。
- 准备 1,000 ml Triton X-100，1%（v/v）溶于ROH2O. 缓慢加入10 ml 在搅拌板上剧烈搅拌下，将Triton X-100加入990 ml水中，置于大烧杯中。使用前需确保试剂完全溶解（至少10分钟）。
- 准备 1,000 ml Triton X-100，1%（v/v）溶于ROH2O（单独体积）
- 准备 1,000 ml 十二烷基硫酸钠（SDS），0.1%（v/v）溶于ROH2O. 缓慢加入 5 ml 在搅拌器上剧烈搅拌下，将SDS（20%储存液）加入995 ml水中。使用前让试剂充分混匀（至少10分钟）。
- 准备 500 ml RO....
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结果
根据先前建立的最佳脱细胞方案，肾脏依次用清水和稀释的去垢剂溶液（1% Triton X-100、0.1% SDS）灌注（见图1A、B）7，在26小时期间内逐渐变得透明，如图2A所示。所得的无细胞肾脏支架不含细胞，保留了由完整肾包膜支撑的连贯肾细胞外基质（ECM），且灌注程序完成后肾包膜未受损伤。在最终的去垢剂灌注（SDS）阶段，由于较大血管（如叶间动脉）的壁厚明显超过肾单位小管基底膜的厚度，脱细胞支架中肾脏的血管网络（尤其是叶间血管）清晰可见（见图2A、B）。整个器官的天然细胞均被清除，仅留下肾小球、肾小管和集合管完整的基底膜网络，以及脱细胞血管的细胞外基质，包括皮质内叶间动脉的内弹力层和外弹力层（见图2B、C）。除大血管外，肾小球内的微血管基底膜也保持了结构完整性（见图2B、C）。
脱细胞肾脏应保存在4 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）中，以限制肾细胞外基质（ECM）的自然水解降解，并应在脱细胞.......
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讨论
所述的脱细胞化方案能够稳定地制备出完全无细胞的肾脏细胞外基质（ECM），该基质可作为三维支架用于培养人肾皮质小管上皮细胞（包括近端和远端小管来源的细胞）以及血管内皮细胞7,17。通过插管的肾血管系统是实现试剂和细胞在生物反应器系统中均匀输送的关键结构，从而支持灌注式脱细胞化、细胞接种、长期灌注培养以及刃天青（resazurin）灌注检测等操作。因此，在器官灌注前正确地对肾动脉进行插管至关重要，必须特别注意避免肾动脉发生阻塞或损伤，并确保导管固定牢靠。用于获取肾脏的Sprague Dawley大鼠必须进行全身肝素化处理，以防止器官获取过程中血管内形成血栓；因为血管内血栓无法清除，可能阻碍肾脏的完全脱细胞化。
用于重细胞化肾脏接种和灌注培养的灌注生物反应器设计允许多种接种方法 原位17除了本文所述的动脉注射技术外，还可通过插管的输尿管或肾静脉进行逆行细胞注射。此外，生物反应器本体装有阀门，可用于施加负压（部分真空；参见 图1C)，用于输尿管种植。无论采用何种种植策略，通过肾动脉顺行灌注培养基.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Zell家族基金会的支持。我们承认获得西北纪念基金会Dixon转化研究资助计划、美国移植外科医师学会教职员工发展资助、伊利诺伊州国家肾脏基金会青年研究者资助的支持。我们感谢Robert R. McCormick基金会的支持。本研究还获得了美国国家糖尿病、消化病和肾病研究所（NIDDK）K08 DK10175（授予J.A.W.）的资助。本研究所使用的成像和组织学核心设施由西北大学小鼠组织学与表型分析实验室、电子探针仪器中心（EPIC）和Simpson Querrey研究所设备核心提供支持，并获得癌症中心支持资助（NCI CA060553）。作者谨此感谢西北大学显微外科核心实验室在啮齿类动物肾脏获取方面提供的协助。肾小管上皮细胞在重细胞化后的形态学评估是在由P30 CA118100资助的荧光显微镜共享资源平台上完成的。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| TRITON X-100，蛋白质组学级，AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| 十二烷基硫酸钠溶液，BioUltra，用于分子生物学，20% 水溶液（H2O） | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| 过氧乙酸溶液，纯度约 39%，溶于乙酸（室温） | Sigma-Aldrich | 77240 | 过氧乙酸易燃且具有腐蚀性。应在通风橱内配制，并使用适当的个人防护装备（如手套、护目镜）。 |
| 200 proof 乙醇 | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote，用于玻璃及其他表面的硅化试剂 | Sigma-Aldrich | SL2 | 用于生物反应器储液槽的处理。文中称为硅化试剂。 |
| DMEM/F12 培养基 | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro 胎牛血清（优质），Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| 青霉素-链霉素溶液，100X，10,000 I.U. 青霉素，10,000 µg/mL 链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X)，含酚红 | Life Technologies | 12605-028 | 文中称为细胞解离酶。 |
| 台盼蓝染色液（0.4%） | Life Technologies | 15250-061 | |
| 刃天青钠盐 | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| 设备： | |||
| Masterflex L/S 数字驱动器，600 RPM，115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| 适用于 07519-05 和 -06 泵头的 Masterflex L/S 大容量泵管 | Cole-Parmer | EW-07519-70 | 文中称为大容量泵管。 |
| Masterflex L/S 8通道4滚轮泵头 | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| 直形 6" 齿状镊 | VWR | 82027-438 | |
| *肾脏灌注生物反应器 | WilMad Labglass | *定制设计 | 生物反应器由 WilMad Labglass 按照所述方法生产。其设计已在先前发表的文章中详细描述。 |
| 灌注回路组件 | |||
| 24 G × 0.75 英寸 BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管（0.7 mm × 19 mm），由 BD Vialon 生物材料制成，带刻痕针头（50/包，200/箱） | BD Biosciences | 381412 | 文中称为 24 号导管。 |
| Masterflex PharMed BPT 泵管，L/S #14，25 英尺 | Cole-Parmer | HV-06508-14 | 文中称为蠕动泵管。 |
| 过氧化物固化硅胶管，内径 1/16"，外径 1/8"，25 英尺/包 | Cole-Parmer | HV-06411-62 | 文中称为内径 1/16" 的硅橡胶管。 |
| Masterflex 铂固化硅胶管，L/S 14，25 英尺 | Cole-Parmer | HV-96410-14 | 文中称为厚壁内径 1/16" 硅橡胶管。 |
| VWR 硅胶管，内径 1/4"，外径 0.5" | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 通气滤器，Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | 文中称为 0.2 微米通气滤器。 |
| Cole-Parmer 鲁尔接头，雄性鲁尔锁扣转 1/8" 内径，尼龙，25/包 | Cole-Parmer | T-45505-11 | 文中称为雄性鲁尔锁扣转 1/8" 带刺接头。 |
| Cole-Parmer 鲁尔配件，雄性鲁尔堵头，尼龙，25/包 | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| 雌性鲁尔转雌性鲁尔接头，尼龙，25/包 | Cole-Parmer | EW-45502-22 | 文中称为雌性鲁尔转雌性鲁尔接头。 |
| Cole-Parmer 鲁尔配件，雌性鲁尔帽，尼龙，25/包 | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical 大孔径 Hi-Flo 三通旋塞阀 # MX4311L — 带延长雄性鲁尔锁扣的三通 Hi-Flo 旋塞阀，不含 DEHP，无乳胶（LF），抗脂质，非 PVD，50/箱 | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical（供应商）目录号为 #MX4311L。 |
| 其他组件 | |||
| 5 ml BD Luer-Lok 一次性注射器，带 BD Luer-Lok™ 接头 | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm × 10 mm Easy Grip 培养皿 | BD Biosciences | 353001 | 用于将细胞悬液吸入注射器以进行细胞接种。 |
参考文献
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line. Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).
