成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

摘要

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。

摘要

相对静息的体细胞干细胞在大多数成年组织中支持终生的细胞更新。成年哺乳动物大脑中的神经干细胞仅局限于两个特定的神经发生微环境：海马齿状回的颗粒下区和侧脑室壁的室管膜下区（V-SVZ；亦称室管膜下区或SEZ）。 在体 成体干细胞群体的基因转移策略（即 哺乳动物大脑中的成体干细胞群体，实现目的转基因在干细胞及其分化后代中的长期表达，是当前生物医学与生物技术研究中的关键工具。本文介绍一种直接 体内 本方法通过利用慢病毒（LVs）对细胞周期非依赖性感染的特性以及V-SVZ微环境高度特化的细胞结构，实现了对成年小鼠V-SVZ细胞的稳定遗传修饰。具体而言，本实验方案包括将空载慢病毒（对照）或携带特定转基因表达盒的慢病毒直接注射至V-SVZ区域本身，以在体内靶向该微环境中所有类型的细胞，或注射至侧脑室腔内，以特异性靶向室管膜细胞。 体内 靶向神经发生微环境中所有类型的细胞，或注入侧脑室腔内，仅靶向室管膜细胞。随后，表达盒被整合至转导细胞的基因组中，而慢病毒（LVs）编码的荧光蛋白则可用于检测转导细胞，从而分析标记细胞及其子代细胞中细胞自主性与非自主性、依赖微环境的效应。

引言

小鼠侧脑室壁朝向纹状体的室管膜下区（V-SVZ）是一个高度活跃的生发区域，在此区域内前体细胞持续进行复制与分化，从而不断产生嗅球（OB）中间神经元和胼胝体少突胶质细胞¹。这些细胞的终生生成被认为依赖于该区域内存在的神经干细胞（NSCs；亦称B1细胞），这些细胞表达星形胶质细胞抗原胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及nestin、Id1和Sox2等干细胞标志物²。表达GFAP的B1细胞产生过渡性扩增前体细胞（TAP细胞；又称C细胞），后者表达转录因子Dlx2（远端-less同源盒2）和Ascl1（哺乳动物achaete-schute同源物1），快速分裂数次后，生成迁徙中的成神经细胞（A细胞）或成少突胶质细胞³。新生成的增殖性成神经细胞向前迁移，形成通往嗅球的吻侧迁移流（RMS），最终整合至颗粒层和小球层，分化为成熟的抑制性中间神经细胞。年轻的迁徙性成少突胶质细胞则移行至胼胝体（CC），转变为未成熟的NG2阳性细胞，这些细胞可在局部继续分裂，或进一步分化为成熟的髓鞘形成少突胶质细胞^1,4。

B1细胞来源于胎儿期的放射状胶质细胞，保留了前体细胞的细长极化形态，并与其微环境形成高度特化的相互关系。这些细胞跨越衬于脑室壁的室管膜和灌注V-SVZ微环境的血管网络。B1细胞的顶端小突起穿插于多纤毛的室管膜细胞之间，并终止于一条单一的非运动性初级纤毛；而其基底突起则延伸较长距离，伸向该微环境中的平面状血管丛，....

方案

伦理声明：本方案遵循瓦伦西亚大学的动物护理指南，符合欧盟指令 2010/63/EU 的规定。

1. 慢病毒载体的制备 在体实验 标记研究（见图1a）

警告：本文所述操作属于生物安全二级，因此所有后续操作均须在生物安全柜中进行。确保研究人员已具备相应资质并接受过所有操作流程的培训。穿戴个人防护装备，包括防护服、双层手套和适当的护目用品。最后，根据机构批准的消毒规范，对所有可能接触过病毒的工具和表面进行彻底去污染处理（使用70%乙醇、10%次氯酸钠溶液擦拭和/或高压灭菌）。

1. 在人胚胎肾293T细胞中生产慢病毒（LV）
   1. 开始本实验前，需准备用于转染的高纯度DNA。可通过双氯化铯（CsCl）梯度离心法或其他市售柱层析方法制备并纯化各质粒，以获得无内毒素DNA。本实验中使用的转移载体质粒为pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre。推荐的核心包装质粒为pMDLg/pRRE和pRSV.REV，包膜质粒为pMD2G^13,18,19。
   2. 转染前24小时，将5 × 10⁶个293T细胞接种于含Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）（见材料表）的10 cm塑料培养皿中，使转染时细胞融合度约为1/4至1/3。在37 °C、5–7% CO₂的湿化培养箱中孵育。

结果

慢病毒介导的基因递送系统可用于成年小鼠侧脑室下区（V-SVZ）细胞的长期体内转导，从而在细胞增殖、迁移和分化过程中对其进行示踪和遗传学改造。该感染方法效率高，可获得大量表达报告基因的转导细胞，这些细胞可轻松地与未感染细胞区分开来。目前我们主要使用由泛表达的磷酸甘油酸激酶启动子驱动的GFP荧光报告分子来示踪转导细胞，但也可使用其他报告分子或蛋白标签。我们通常使用抗GFP抗体进行检测，而非直接检测报告分子的荧光信号，因为前者可获得更强的荧光信号。此外，脑组织可新鲜解剖后直接浸入固定液，但通过经心脏灌注固定可获得更佳的效果。

在立体定位引导下，将纯化且浓缩的病毒载体缓慢注射至侧脑室下区（V-SVZ）与纹状体交界处（图 2a, b）。注射后两个月，在 V-SVZ 及注射点周围约 1 mm 半径范围内均可见大量 GFP⁺ 细胞（图 2a, b）。慢病毒（LVs）可转导 V-SVZ 中所有类型的细胞，且室管膜细胞中报告基因的表达表明，LVs 亦能高效靶向非分裂细胞（图 2.......

讨论

与其他病毒系统相比，慢病毒（LVs）在成年神经干细胞（NSCs）的遗传修饰方面具有重要优势^16,18。通过立体定位将慢病毒递送至V-SVZ微环境，是一种高效标记和示踪低频分裂的B1型神经干细胞的方法，克服了其他常用技术（如BrdU标记法或逆转录病毒转导）的局限性：BrdU在多次细胞分裂后会被稀释，而逆转录病毒仅能靶向在施用时处于增殖状态的细胞。慢病毒与腺病毒均可不依赖细胞周期状态实现感染，这对于不分裂的细胞（如室管膜细胞）或相对静息、分裂稀少的成年神经干细胞尤为关键^16,18。转导的转基因可高效、稳定地整合至细胞基因组并持续表达，从而实现对转导细胞及其子代细胞的形态学特征分析。

神经干细胞存在于一个高度特化的微环境中，周围有室管膜细胞、血管细胞以及其自身产生的子代细胞，共同形成一个受到严密调控的环境²与许多胎儿神经干细胞（NSCs）类似，B1细胞位于脑室旁边，其顶端细小突起延伸至脑室腔，末端形成单一的非运动性初级纤毛，浸没于脑室脑脊液（CSF）中¹ (图2a）。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
第1部分：用于体内递送的LV的制备。
设备：
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XL-100K
超速离心机转子	Beckman Coulter	SW-28
超速离心机转子	Beckman Coulter	SW-55
超速离心管	Beckman Coulter	358126	25 mm × 89 mm
超速离心管	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
超速离心机转子适配器	Beckman Coulter	358156
6孔板	SPL	PLC-30006
24孔板	SPL	PLC-30024
10 cm 培养皿	SPL	PLC-20101	100 x 20 样式
FACS 管	Afora	DE400800	12 mm × 75 mm，5 ml
无菌FACS滤杯	BD	340626	30 µm
硝酸纤维素滤膜	默克密理博	SCGPU05RE	0.22 μm
流式细胞仪	BD	LSR Fortessa	蓝色激光 488 nm
Steritop 滤器	生物膜	FPE-204-500	0.22 µm
试剂：
pMDLg/pRRE 质粒	Addgene	#12251	核心包装质粒
pRSV.REV 质粒	Addgene	#12253	核心包装质粒
pMD2G质粒	Addgene	#12259	包膜质粒
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre 质粒	Addgene	#12252	转移载体质粒
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Biowest	L0101-500	用于 HeLa 细胞培养
Iscove改良型Dulbecco培养基	生命技术	12440-053	293T 细胞培养
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl（sigma，T5941），0.1 mM EDTA（sigma，E5134），pH 7.6  无DNA酶/RNA酶、0.2 µm 经无菌过滤
2x HBS			0.28 M NaCl（Sigma，S7653），0.05 M HEPES（Sigma，H7523），1.5 mM 无水 Na2HPO4 （Sigma，S7907）溶于 dH₂O2O（最好不是MilliQ）。用NaOH溶液（Calbiochem，567530）调节pH至7.0。
胎牛血清（FBS）	Biowest	S181B-500	100倍浓缩储备液，用于配制HeLa和293T细胞培养基，终浓度为10倍。
谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513-100	200 mM 储存液，用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 6 mM。
丙酮酸钠	生命技术	11360-039	100 mM 储存液，用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 1 mM。
GlutaMAX 补充剂	生命技术	35050-061	用于配制293T培养基，终浓度为1%。
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4458	储存液含有 5,000 单位/毫升青霉素和 5 毫克/毫升链霉素。用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 1%。
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200-056	含酚红，每升含有2.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA 4Na的HBSS。
磷酸盐缓冲液  （PBS）	Sigma-Aldrich	D1408	不含氯化钙和氯化镁，10倍浓度，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养。该储备液用于在细胞培养级水中配制1倍浓度的PBS。
聚凝胺（hexadimethrine bromide）	Sigma-Aldrich	H9268	粉末。在 dH₂O 中配制 8 mg/ml 的 1,000 倍储存液<亚区2O
甲醛，电子显微镜级，16%	EM Sciences	15710
名称	公司	目录编号	评论
第2部分：将LV立体定位注射至SEZ实质或侧脑室。
设备：
Vernier 立体定位仪	NeuroLab，Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham小鼠和新生大鼠适配器	NeuroLab，Leica	39462950
注射器固定器	KD Scientific	KDS-311-CE
33 号针头注射器	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
电动钻机	精细科学工具	98096
保温毯	Ufesa	AL5512/01	230-240 V，100-110 W，型号 C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	模型：beauty，3 V，300 mA，型号 HT-03
试剂：
美托咪定	Esteve	DOMTOR	1 mg/ml 的商用溶液。
氯胺酮	Merial	Imalgene 500	50 mg/ml 的商用溶液
美托咪定/氯胺酮混合物			配制工作液：将美托咪定稀释至终浓度为0.2 mg/ml，氯胺酮稀释至终浓度为15 mg/ml，溶剂为生理盐水。作为麻醉剂使用时，注射体积应使美托咪定终剂量为每公斤体重0.5–1 mg，氯胺酮终剂量为每公斤体重50–75 mg。
布托啡诺	辉瑞	托布吉辛	储存液浓度为10 mg/ml。使用时用生理盐水稀释至1 mg/ml作为镇痛剂。
阿替美唑	Esteve	安替塞丹	储存液浓度为5 mg/ml，使用时用生理盐水稀释至终浓度0.5 mg/ml以拮抗麻醉。
0.9% 生理盐水溶液	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	皮肤用粘合剂
HydroGel	透明 H2O	70-01-5022
Kimwipes	金伯利-克拉克	34120	11 cm x 21 cm
漂白剂/Virkon	Dupont
外科标记笔	Staedler	313-9	永久性发光标记
眼科润滑剂		SICCAFLUID	0.5 g/剂量，卡波姆 974P
聚维酮碘	聚维酮碘	694109.6	10% 聚维酮碘
名称	公司	目录编号	评论
第3部分：组织学分析。
设备：
自动蠕动泵	Cole-Parmer 仪器公司	HV-07524-55	Masterflex L/S 可调速经济型驱动器，1.6–100 rpm，230 V
泵头	Cole-Parmer 仪器公司	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load 精密管路泵头；PSF 泵壳，CRS 转子
硅胶管	Cole-Parmer 仪器公司	HV-96410-16	Platinum L/S 16
头皮静脉输液套件	Vygon V-green	70246.05T	25 G，30 cm 管长
振动切片机	Leica	VT1000
共聚焦显微镜	奥林巴斯	FluoView FV10i
热板	技术	SHP-10
试剂：
磷酸盐缓冲液（PB）			0.2 M PB：0.2 M Na2HPO4 （Sigma，S7907）和 0.2 M NaH2PO4 （Panreac，141965.1211）在 dH 中2O，调节pH至7.2–7.4
多聚甲醛（PFA）	Panreac	141451.1211	每次均需新鲜配制。将去离子水加热2O 至 55–60 °C 在通风橱中使用加热板，边搅拌边加入PFA粉末，配制8%溶液。由于PFA不易溶解，溶液呈乳白色浑浊状。逐滴加入1N NaOH，直至溶液变澄清。冷却后，用Whatman滤纸过滤，并加入等体积的0.2 M PB。
生理盐水溶液			0.9% NaCl in dH₂O2O
超级胶水	乐泰	767547
叠氮化钠	Panreac	122712.1608
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G7126-100
正常山羊血清	默克密理博	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	去垢剂
抗GFP兔抗体	ROCKLAND	600-401-215	以1:500稀释度使用
Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG（H+L）抗体	分子探针	A-21206	以1:750的稀释比例使用
6-二氨基二苯并吲哚二盐酸盐水合物（DAPI）	Sigma-Aldrich	D9542	荧光核染色。使用浓度为 2 mg/ml 的 ddH₂O 溶液。2O. 4℃避光保存 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	荧光样本封片剂