GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内 生物发光成像，并验证经荧光素酶修饰的GL261细胞在研究胶质母细胞瘤的肿瘤免疫学及免疫治疗策略中的应用价值。
本文内容
摘要
摘要
与常见的报道中的人类胶质瘤异种移植动物模型相比，GL261 小鼠胶质瘤异种移植模型几乎重现了人类疾病的所有相关临床和组织病理学特征。当将 GL261 细胞植入同系 C57BL/6 小鼠颅内时，该模型具有维持完整免疫微环境的额外优势。GL261 细胞中稳定表达的荧光素酶可实现对颅内肿瘤生长的无创、经济高效的生物发光监测。我们最近已证明，GL261 细胞中的荧光素酶表达不影响肿瘤生长特性、肿瘤细胞免疫调节性细胞因子的表达、免疫细胞向肿瘤的浸润，或荷瘤小鼠的整体生存率。因此，GL261 荧光素酶胶质瘤模型在研究新型化疗和免疫治疗手段方面具有重要应用价值。本文报道了在 GL261 细胞中建立稳定荧光素酶表达的技术，以及如何利用生物发光成像技术研究肿瘤细胞的体外（in vitro）和体内（in vivo）生长情况。
引言
恶性胶质瘤是最常见且致死性最高的人类脑肿瘤。即使采用最大范围的手术切除，并辅以放疗和化疗，在主要脑肿瘤转诊中心，患者的中位生存期仍仅为15至20个月1, 2, 3。恶性胶质瘤中最侵袭性的类型是胶质母细胞瘤，其特征包括有丝分裂象、新生血管形成、向邻近脑组织浸润以及假栅栏样坏死。利用人类脑肿瘤细胞建立的原位脑肿瘤异种移植模型在神经肿瘤学研究中发挥了关键作用，有助于在进入人体临床试验之前推动新药剂的临床前转化。尽管大多数人类异种移植模型能够重现人类疾病的诸多特征，但所有基于人类组织的异种移植模型系统存在一个根本性局限，即必须使用免疫缺陷动物4。
宿主免疫反应的缺失显然会从肿瘤形态学和移植效率两方面改变肿瘤的生长。尽管在解读异种移植模型结果时某些假设可以接受，但在治疗评估领域得出有意义的结论仍具挑战性。免疫缺陷动物与免疫功能健全动物之间，某些基本的生物学特征可能相似，但其他方面如肿瘤相关炎症、组织侵袭以及对损伤的反应等则可能大不相同。相比之下，GL261 是一种化学诱导的小鼠胶质瘤细胞系，将其植入免疫功能健全的同系 C57BL/6 小鼠脑内时，能够准确地模拟胶质瘤的发生5。与人类疾病类似，颅内肿瘤的生长会快速且可重复地导致神经功能症状及动物死亡6-10。
皮下肿瘤的生长可直接测量。颅内肿瘤的生长只能通过动物牺牲或昂贵的影像学研究来测量。稳定表达荧光素酶可实现无创且经济有效的颅内生物发光成像11。转染荧光素酶的GL261细胞所产生的生物发光信号与颅内肿瘤的生长具有良好的相关性。我们近期对GL261细胞与荧光素酶修饰的GL261细胞进行了直接比较，结果表明两者在体外（in vitro）生长与侵袭能力、免疫细胞因子谱、荷瘤C57BL/6小鼠的体内（in vivo）生存期以及免疫细胞浸润方面均无差异。该技术适用于需要无创监测肿瘤生长的胶质母细胞瘤临床前研究。
方案
以下所述所有操作步骤均已通过西北大学机构动物使用与护理委员会的审查和批准，并在无菌条件下进行。
1. 用表达萤火虫荧光素酶的报告系统修饰GL261细胞
注意：基于HIV-1的慢病毒载体在脾脏集落形成病毒（SFFV）启动子的调控下表达萤火虫荧光素酶（Fluc）。该光学报告基因已克隆至载体质粒pHRSIN-CSGW-dlNotI中。
- 将293-T细胞维持在添加10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，GL261细胞维持在添加10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基中，于37 °C、含95%空气和5%二氧化碳（CO₂）的湿润 atmosphere 中培养2).
- 当T-75培养瓶中的293-T细胞培养至80%融合度时，用不含Ca2+的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次+ 和 Mg2+，将3 ml胰蛋白酶（0.05%）加入细胞中，在37 °C孵育5分钟，用5 ml移液管轻轻吹打，同时将培养瓶略微倾斜，以收集瓶底全部细胞。将3 ml消化后的细胞悬液转移至15 ml锥形管中，加入7 ml新鲜RPMI培养基（细胞悬液总体积为10 ml）。
- 用5 ml移液管充分混匀细胞悬液。从离心管中取100 μl细胞悬液，使用血细胞计数板计数细胞数量。具体操作为：将100 μl细胞悬液与300 μl台盼蓝溶液混合，取2 μl混合液加入血细胞计数板中。在显微镜下选取四个不同视野，计数未被蓝色染色的细胞数量。取每个视野的细胞数平均值，该数值代表104 细胞/毫升
- 同时，将含有细胞悬液的离心管在300 × g下离心7分钟。吸除上清液，并用新鲜RPMI培养基重悬细胞沉淀，制备浓度为1.0 × 10⁶个/mL的GL261细胞悬液。6/毫升。接种 2.5 × 106 第1天，将含有2.5 ml RPMI培养基的GL261细胞加入装有27.5 ml DMEM的T-175培养瓶中。
- 24 小时后，将培养基更换为 20 ml 新鲜 DMEM（第 2 天）。
- 为制备慢病毒载体，将54 μl转染试剂与2 ml无血清DMEM混合，室温孵育5 min。向该混合液中加入3 μg gag-pol、3 μg水疱性口炎病毒G型包膜蛋白（VSV-G）和4.5 μg Fluc（pSIN-Fluc），混匀后室温孵育20 min。将全部DNA混合物滴加至293-T培养瓶（T-175）中，于37°C、含95%空气和5% CO₂的湿润化培养箱中孵育2 48 小时（第 2 天）。
- 转染后24小时加入10 ml新鲜DMEM（293-T细胞培养基总体积约为30 ml）（第3天）。
- 将GL261细胞接种至24孔板时，用不含Ca2+的PBS洗涤细胞一次+ 和 Mg2+，将细胞在37 °C下用5 ml胰蛋白酶（0.05%）孵育5分钟，稍倾斜培养瓶，用5 ml移液管吹打细胞，从瓶底收集全部细胞，并按步骤1.2所述使用血细胞计数板进行细胞计数。同时，以300 × g离心7分钟。吸除培养基，用新鲜RPMI培养基重悬细胞沉淀，制备浓度为2.5 × 10⁶4/ml。接种 2.5 × 104 24 孔板中加入 1 ml RPMI 培养基的 GL261 细胞（第 3 天）。
- 转染后48小时，用10 ml移液管从293-T培养瓶（T-175）中收集30 ml慢病毒上清液，转移至50 ml锥形管中。使用50 ml注射器吸取30 ml慢病毒上清液，经0.22 μm注射器滤器过滤，将病毒上清液分装为每管1 ml（第4天）。
- 将GL261细胞培养板（24孔）中的1 ml RPMI培养基更换为1 ml慢病毒上清液，置于37 °C湿化培养箱中孵育（第4天）。
- 慢病毒感染48小时后，将培养基更换为1 ml新鲜RPMI（第6天）。
- 24小时后，对GL261细胞进行第二次慢病毒感染（第7天）。
- 2之后nd 慢病毒转染48小时后，将培养基更换为1 ml新鲜RPMI（第9天）。
- 继续培养经荧光素酶修饰的GL261细胞（以下简称GL261.luc细胞），并将细胞培养扩增至T-75培养瓶中。
- 当GL261.luc细胞在T-75培养瓶中培养至70%融合度时，按照步骤1.2的方法用胰酶消化收集细胞，并用血细胞计数板进行计数。将GL261.luc细胞以梯度密度（1.0 × 106，5.0 × 105，2.5 × 105，1.0 × 105，5.0 × 104，2.5 × 104 细胞/孔），在含95%空气和5% CO₂的湿润化培养箱中37°C孵育2 3 小时。
- 使用生物发光成像技术，以经荧光素酶修饰的U-87 MG（U87.luc）细胞为参照，测定细胞的荧光素酶活性图1).
- 启动图像软件（点击桌面上的图标）并初始化成像系统（点击 "初始化" 初始化将自动开始，系统检查和相机冷却至 -90 °C 可能需要几分钟。
- 每孔加入 25 μl 荧光素（D-Luciferin potassium salt，150 mg/kg）。
- 将细胞在室温下与荧光素孵育1分钟，然后对培养板成像10秒。设置成像系统时，选择 "发光的", "10 秒" 曝光时间，以及 "培养基" 分选。将24孔板放置在成像仪上，然后点击 "获取" 开始图像的按钮。
- 图像成功获取后，您将在屏幕上看到图像窗口和工具面板。单击 "ROI（感兴趣区域）工具" 并从狭缝图标中选择 6 × 4。创建 6 × 4 的狭缝阵列以覆盖 24 孔板图像上的信号区域，然后点击测量标签（铅笔图标）。观察出现的窗口，其中表格显示了感兴趣区域（ROI）的测量值，单位为每秒每球面度每平方厘米的光子数（photons/sec/sr/cm²）2).
- 使用之前用相同慢病毒修饰的U87.luc细胞（该慢病毒与本研究中用于修饰GL261的病毒相同）11作为转导GL261.luc细胞中荧光素酶活性检测的对照。
2. 体外 增殖检测
- 当GL261和GL261.luc细胞在T-75培养瓶中达到70%融合度时，通过胰酶消化收获两种细胞系，并按照步骤1.2进行计数，然后使用多通道移液器将细胞以每孔80 μl RPMI培养基中1500个细胞的密度接种至96孔板中，以尽量减少操作时间和移液误差。每种细胞系总共接种20个孔。为减少细胞所在孔内的培养基蒸发，向空孔中加入100 μl新鲜RPMI培养基。
- 采用比色法细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖活性。本实验使用MTS细胞增殖检测试剂盒。使用多通道移液器向96孔板中含细胞的每个孔加入20 μl MTS试剂。
- 将培养板置于含95%空气和5% CO2的湿润化培养箱中，37°C孵育3小时。使用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度。此步骤分别在接种后的第1、2、4和7天重复进行。为标准化吸光度值，将每一天的吸光度值除以第1天对应的读数（图2）。
3. 肿瘤细胞移植
注意：所有器械均需高压灭菌。使用消毒剂（2% 氯己定溶液）喷洒手术区域，并覆盖吸水性手术单以准备术区。为维持无菌条件，手术过程中应佩戴无菌外科手套，并用彩色胶带将手术区域划分为两个区域。区域 1 标记为 "清洁区"，用于放置已灭菌的物品；区域 2 标记为 "污染区"，用于放置使用过的材料。
- 动物手术前，准备用于颅内注射的细胞悬液。通过胰酶消化法从70%汇合度的T-75培养瓶中收获细胞，按步骤1.2方法使用血细胞计数板计数细胞，并以Hanks'平衡盐溶液（不含Ca2+和Mg2+，HBSS）配制成密度为1.0 × 105 个细胞/µl的细胞悬液。
- 通过腹腔注射200 μl混合液对小鼠进行麻醉，混合液包含氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg），溶于0.9%生理盐水中。为确认麻醉效果，轻捏小鼠脚趾 。若小鼠完全麻醉，则不应对外界刺激产生反应。
- 通过皮下注射给予0.1 mg/kg的丁丙诺啡，以缓解术后疼痛。
- 使用电推剪剃除动物头部顶部的毛发，并用浸有2%氯己定溶液的棉签擦拭清洁。术中涂抹眼膏以维持角膜充分润滑。
- 使用无菌手术刀在顶枕骨区域做一条长约1 cm的矢状切口。为清晰显示前囟，用浸有3%过氧化氢溶液的棉签擦拭颅骨表面。
- 使用无菌25号针头在颅骨上钻孔，孔位位于前囟右侧3 mm处，且紧靠冠状缝后方。
- 为确保颅内注射深度为距颅骨表面3 mm，使用剪刀将20 μl移液器吸头的尖端剪去3 mm，然后将注射器插入该吸头中。
- 将注射器垂直插入先前钻好的孔中，在1分钟内缓慢注入含有3.0 × 105 个细胞的3 µl HBSS细胞悬液。注射完成后保持针头留置1分钟，然后缓慢拔出针头。
- 用浸有3%过氧化氢溶液和2%氯己定溶液的棉签擦拭颅骨表面，并用棉签将颅骨表面擦干。取约3 mm3大小的无菌骨蜡，将其粘附于棉签末端，再用棉签将骨蜡涂抹于钻孔处以封闭骨孔。
- 使用镊子将头皮两侧拉拢覆盖颅骨，用皮肤缝合钉固定闭合伤口。用浸有2%氯己定溶液的棉签清洁伤口。
- 术后密切观察所有小鼠，直至其恢复自主活动并表现出正常行为。通常恢复时间约为30分钟。在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得将其放回与其他动物共用的笼具中。
4. GL261 肿瘤生长的生物发光成像
- 在洁净的纸巾上喷洒足量消毒剂（0.05%二甲基氯化铵溶液）。用浸有消毒剂的纸巾彻底擦拭成像舱内的黑色垫板、鼻锥及隔板，即动物将与设备接触的部位。再用洁净干燥的纸巾彻底擦拭所有表面。重复上述步骤一次，并静置5分钟。
- 按照步骤1.14.1初始化成像系统。
- 通过腹腔注射300 μl混合液对小鼠进行麻醉，混合液包含200 μl的氯胺酮/赛拉嗪和100 μl的荧光素（D-Luciferin potassium salt，150 mg/kg）。
- 注射后等待10分钟，通过捏尾确认小鼠是否完全麻醉。设置成像系统时，选择 "发光的", "自动" 曝光时间，以及 "培养基" 分箱。将小鼠放置在成像台上并点击 "获取" 点击按钮开始成像。确保每次成像会话中注射后的时长保持一致。
- 图像成功获取后，应出现一个图像窗口和工具面板。点击 "ROI 工具" 并选择 "自动" 从圆形图标开始。定义感兴趣区域（ROI）时，用圆形圈选出图像上的信号区域，然后以光子/秒/球面度/平方厘米为单位，对ROI进行测量。2.
- 将小鼠从成像室中取出，并持续观察直至小鼠恢复自主活动能力并表现出正常行为。通常恢复时间约为15分钟。在小鼠完全从麻醉状态中恢复之前，不得将其放回与其他动物共用的笼具中。
- 每周进行两次生物发光成像以监测肿瘤生长，直至动物出现以下症状：体重减轻（相对于植入前体重减少超过20%）、食欲减退（完全厌食持续24小时）以及对轻柔刺激缺乏持续的目的性反应（微弱尝试站立），此时应实施安乐死。出现上述症状的动物应采用CO₂安乐死。2 处死后进行颈椎脱位。
- 将小鼠放入安乐死舱内（切勿使舱内过于拥挤），并通入压缩 CO₂2 持续5-6分钟。观察到约5分钟后所有动物均处于无意识状态且无呼吸。
- 将小鼠从舱室中取出。用拇指和食指轻触胸部，确认心脏已停止跳动，并检查角膜反射是否消失。
- 将小鼠俯卧于平坦表面，用一只手抓住其颈背部颅底位置，另一只手的拇指和食指捏住尾根部。
- 固定头部并迅速向后拉尾部。用拇指和食指确保颅骨与第一颈椎分离。
- 将每一天的发光值相对于生物发光成像第一天获得的相应读数进行归一化处理，如步骤2.3所述（图3A).
- 用于统计分析，使用Kaplan-Meier估计法绘制生存曲线12 并使用对数秩检验比较生存曲线之间的差异13.
结果
GL261 细胞按照上述第 1 步所述方法，用含有荧光素酶的慢病毒感染。体外 生物发光成像显示，荧光素酶的表达水平 robust，与阳性对照 U87.luc 人胶质母细胞瘤细胞系中的表达水平相似（图 1）。如预期，未感染的 GL261 细胞无背景荧光素酶表达。此步骤虽简单，但在使用感染后的细胞系进行后续研究之前，确认荧光素酶的稳定表达至关重要。
颅内植入后荧光素酶表达。
在颅内植入前，我们证实无差异 体外 GL261.luc 细胞与 GL261 细胞的生长速率比较（图2）。对于颅内生长和生存分析，按照方案步骤3将细胞注射至C57BL/6小鼠脑内。携带GL261.luc肿瘤的小鼠通过方案步骤4进行连续的生物发光成像分析，结果显示可检测到肿瘤生长（图3A). 携带GL261.luc肿瘤的小鼠迅速且一致地进入濒死状态并被实施安乐死。重要的是，携带GL261.luc与GL261肿瘤的动物在总体生存期上无显著差异。图3B). 体内 因此，生物发光成像可用于监测胶质母细胞瘤实验治疗的反应。肿瘤快速可靠的生长以及较短的总体生存期可在相对较短的时间内产生大量数据。
图 1. GL261.luc 细胞中的荧光素酶活性。 U87.luc、GL261.luc 和 GL261（阴性对照）细胞从左至右的接种密度分别为 1.0 × 106、5.0 × 105、2.5 × 105、1.0 × 105、5.0 × 104 和 2.5 × 104 个细胞/孔。使用 Lumina 成像系统检测发光强度（光子数/秒/球面度/cm2）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 荧光素酶表达不影响GL261细胞增殖。 GL261.luc 细胞不会引起 增殖差异通过MTS细胞增殖实验进行验证。该图显示了相对于第1天的倍数增加，通过比较特定时间点的平均吸光度值（均值 ± 标准误）与第1天的平均值（非配对）确定 t- 每个细胞系之间比较的检验值： P = 0.7796)14误差线表示每天四个重复样本的平均值（均值±标准误）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3. 萤光素酶表达不影响 体内 肿瘤生长和动物生存。 (A) 生物发光监测显示颅内接种的GL261.luc肿瘤在C57BL/6小鼠中呈进行性生长。(B) Kaplan-Meier生存分析显示，颅内接种GL261（实线）或GL261.luc细胞（虚线）的小鼠总体生存率无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
将GL261小鼠胶质瘤细胞植入同源免疫健全的C57BL/6小鼠颅内时，相较于人胶质瘤异种移植动物模型具有多项优势。许多异种移植肿瘤呈包膜状病灶生长，无法准确模拟人类胶质瘤的浸润性特征。相比之下，GL261肿瘤不仅表现出向邻近脑组织浸润的能力，还具有新生血管形成、有丝分裂象及显著坏死等特征。7最重要的是，在研究肿瘤免疫学或免疫治疗策略时15, 16，C57BL/6小鼠保留了完整的免疫系统8既往研究表明，颅内肿瘤中存在免疫抑制性细胞因子 TGF-β 的强烈表达，并含有类似于人类胶质母细胞瘤的免疫抑制性调节性T细胞9, 10.
此处描述的简单技术可实现GL261细胞对荧光素酶的稳定表达。我们近期已报道了类似结果 体外 和 体内 GL261.luc细胞与GL261细胞相比的生长情况，以及相似的肿瘤组织学特征和免疫细胞浸润17GL261.luc 细胞稳定表达荧光素酶，该酶可催化底物荧光素的氧化反应，将化学能转化为光子，从而产生可检测的光信号。荧光素可安全地给予实验动物，并在腹腔或静脉注射后穿过血脑屏障。在小动物（如小鼠）等研究模型中，生物发光信号可从体外以非侵入性方式检测。11因此，无需牺牲动物或进行昂贵的MRI或CT成像，即可对肿瘤生长进行连续评估。
该方案中的关键步骤不仅包括慢病毒转导，还包括对荧光素酶稳定表达的验证 体外 在开始任何操作之前 体内 实验过程中，若转导效率下降，可能需要重复慢病毒感染。此外，也可通过在表达载体中引入抗生素抗性基因来筛选表达荧光素酶的细胞。颅内移植要求操作技术精细，以确保将数量一致的细胞重复植入精确的解剖位置，从而保证不同治疗组之间的可比性。本研究与既往关于表达荧光素酶的GL261细胞研究的一个主要区别在于，本研究采用徒手接种细胞的方法，而此前研究则使用立体定位仪。18我们此前已证实，采用徒手技术可获得稳定的植入效果19自由操作技术的优点在于能够对不同处理试剂进行高通量分析。在我们的操作条件下，可在1小时内植入约60只动物。
掌握该技术后，其未来的应用前景将极为广阔。由于GL261表现出较高的有丝分裂活性和快速的肿瘤生长特性，类似于人类胶质母细胞瘤，因此可用于评估抗增殖治疗的效果。同样，由于GL261肿瘤具有侵袭性和促血管生成特性，也可用于测试抗侵袭和抗血管生成疗法。在评估靶向人类特异性分子的化疗药物效果时应谨慎，与先前使用表达荧光素酶的人类胶质母细胞瘤异种移植模型的研究相比20，这可视为本模型的一个局限性。此外，GL261异种移植模型还可用于研究免疫治疗策略对肿瘤生长的影响。
披露
不存在需要披露的利益冲突。
致谢
我们感谢Rajwant Kaur提供的技术协助。我们感谢Maxwell Tom在慢病毒制备方面的帮助。本工作得到了加州大学旧金山分校（UCSF）颅底肿瘤外科Reza和Georgianna Khatib捐赠讲席基金，以及西北大学Michael J. Marchese教授兼主任基金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D-荧光素钾盐 | Gold Biotechnology | LUCK-100 | 避光保存 |
| Living Image 软件 | Caliper Life Sciences | 联系获取报价 | 无 |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | 联系获取报价 | 无 |
| 24孔板；标准组织培养；平底 | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G3582 | 无 |
| Synergy 2 多功能酶标仪 | BioTek | 联系获取报价 | 无 |
| 96孔检测板，黑色板，透明底，带盖，组织培养处理 | Corning | 3603 | 无 |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | 管制物质 |
| 赛拉嗪 | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | 无 |
| 28G 针头（带注射器） | Fisher | 22-004-270 | 又称胰岛素注射器 |
| 2% 氯己定 | Fisher | NC9756995 | 又称 “Nolvasan” |
| 3% 过氧化氢 | Fisher | H312P-4 | 避光保存 |
| 眼科软膏 | Cardinal Health | 1272830 | 又称 “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 针头 | BD Becton Dickinson | 305127 | 无 |
| 一次性手术刀片 | Feather | 2975 | 21号 |
| 纱布 | Fisher | 22028563 | 使用前高压灭菌 |
| 加热垫 | Dunlap | HP950 | 无 |
| 皮肤缝合器、缝合钉、拆除器 | Stoelting | 59020 | 无 |
| PDI 酒精消毒片 | Fisher | 23-501-711 | 无 |
| Reflex 7 mm 伤口夹，100个装 | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | 使用前高压灭菌 |
| Reflex 7 mm 伤口夹施加器 | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | 使用前高压灭菌 |
| Reflex 7 mm 伤口夹拆除器 | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | 无 |
| 单头圆头木柄棉签 | Qosmedix | 10107 | 使用前高压灭菌 |
| 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14170-112 | 无 |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | 80300 | 无 |
| FuGENE 6 转染试剂 | Promega | E2961 | 无 |
| 骨蜡 | Harvard Apparatus | 599864 | 无 |
参考文献
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