用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

摘要

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。

摘要

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞（“APCs”）之间的动态相互作用所调控，这些相互作用被称为“免疫突触”。在这些紧密的细胞-细胞界面中，MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子和信号分子会形成离散的亚细胞簇，并迅速重组。这些动态变化被认为是决定免疫应答效率与质量的关键因素，从而影响保护性免疫与病理性免疫的差异。目前对生理性APC中免疫突触的理解受限于成像分辨率的不足。尽管人工基底模型（例如，平面脂双层）提供了优异的分辨率，并已成为极为有价值的工具，但其本质上缺乏生理相关性且过于简化。血管和淋巴管内皮细胞已逐渐被视为一类重要的外周组织（或基质）“半专业性APC”组分。这些APC（表达大多数专业性APC的分子机制）具有一个独特特征，即能够形成近乎平面的细胞表面，并且易于转染（例如，携带荧光蛋白报告基因）。本文将介绍一种基本方法，利用内皮细胞构建一种新颖且具有生理相关性的“平面细胞APC模型”，以改善对基本抗原信号传导过程的成像与研究。

引言

T淋巴细胞是适应性免疫系统的一个分支，其特征是能够通过T细胞受体（TCRs）高效识别与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的肽类抗原（Ag）¹。初始淋巴细胞会持续迁移，并在淋巴结内扫描“专业的抗原呈递细胞”（APCs；例如，树突状细胞），而记忆/效应T细胞则需要在周围组织中有效监测大量多样的抗原呈递细胞及潜在靶细胞。

在淋巴细胞初次识别抗原提呈细胞（APC）上的同源抗原（Ag）后的几分钟内，其迁移活动即停止，并开始形成一种特化的紧密细胞间界面，称为“免疫突触”（immunological synapse, IS）。持续较长时间（即，30–60 分钟）的IS接触对于信号的放大和维持至关重要^2–7。近期研究发现，在免疫突触内部，离散的亚细胞信号微簇（即，包含MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子及信号分子）的持续形成和快速重塑，决定了最终免疫应答的强度与质量^2–7。然而，该过程的动态细节及其调控机制尚未完全阐明^8,9。这在很大程度上源于技术上的挑战，包括APC表面结构的不规则拓扑形态以及细胞间相互作用平面方向难以精确控制，这些问题严重限制了所需的时空成像技术的应用^8–10（图1A）。

图1. 一种用于成像免疫突触动态的生理平面细胞抗原呈递细胞（APC）模型。 示意图展示了传统T细胞与专业抗原呈递细胞（APC）之间免疫突触的成像方式（A），T细胞与传统平面脂双层APC模型之间的成像方式（B），并与本研究所提出的新型内皮平面APC模型（C）进行对比。专业APC可提供生理性的免疫突触，但其细胞间界面取向不佳（即，相对于最佳的x-y成像平面而言；分辨率约0.2 μm），这会显著降低成像的空间分辨率（z成像平面分辨率约1 μm）和时间分辨率（即，由于需反复扫描所有z成像平面）。脂双层模型具有平面拓扑结构，可实现最佳的时空成像分辨率，但其结构高度简化、非生理且刚性较强。该内皮细胞模型将脂双层的平面拓扑结构与经典APC的生理基质相结合，从而在生理环境中实现最优的空间与时间成像分辨率。请点击此处查看此图的放大版本。

先前的研究通过开发平面基底模型部分克服了这些障碍（即，脂质双分子层和抗体包被的表面）以提供最佳的时空分辨率（即，通过将T细胞活化表面固定到与最优方向平行的单一平面来实现 x-y 成像平面 ^11-15 (图1B）。这些模型促进了对控制T细胞抗原信号传导的亚细胞/分子动态的重要认识，包括动态肌动蛋白/TCR信号微簇的发现 ^7,11-14然而，此类模型本质上过于简化，且具有刚性，无法用于研究三维拓扑特征的形成与演化。图1B因此，目前尚不清楚如何将这些发现与生理条件下的细胞间免疫监视相关联。

尽管仍研究不足，血管和淋巴管内皮细胞正逐渐被视为一个庞大的（即，数量比所有专业APC多约1000倍的外周“准专业”APC区室 ^16-18这些细胞表达MHC-I、MHC-II以及多种共刺激分子。例如CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1；但不包括 CD80 和 CD86），并定位于血-组织交界处，在此发挥特化的哨兵功能 ^16-18先前的研究表明，内皮细胞能够有效重新刺激效应/记忆性T细胞，但不能刺激初始T细胞 ^19-25因此，内皮细胞可能在外周组织适应性免疫应答的效应阶段发挥独特的抗原提呈细胞作用，例如对T细胞的活化、分化、记忆及耐受产生局部影响。 ^16,17,26. 关键的是，当培养时 体外 内皮细胞形成近乎平面的细胞表面，且易于转染（例如，结合荧光蛋白报告系统）。这些特性非常适合在细胞间相互作用过程中对拓扑动力学进行高时空分辨率成像 ^19,27因此，内皮细胞可能作为一种独特的生理性“平面细胞抗原呈递细胞”模型，特别适用于研究驱动抗原识别并调控免疫应答的亚细胞/分子重塑机制。图1C) ^19,20.

先前建立的互补成像技术（包括将内皮细胞转染表达细胞膜和细胞质的荧光蛋白标记物），用于研究白细胞与内皮细胞在黏附和跨内皮迁移过程中的相互作用细节²⁷，结果显示，白细胞通过动态插入和回缩亚微米级、富含肌动蛋白的圆柱形突起（直径和深度约为200–1,000 nm），主动探测内皮细胞表面，这些结构被称为类似侵袭小体的突起（i.e.，“ILPs”）^27,28。这些成像方法已进一步拓展，并结合新建立的实验方案，利用内皮细胞的抗原呈递细胞（APC）功能，首次实现了对T细胞-内皮细胞免疫突触的高时空分辨率成像，相关方法已在文献中报道^19,20，并在本文中进一步描述。从这一新型平面细胞APC模型中获得的一个核心发现是，T细胞的ILPs在促进初始抗原识别以及维持后续信号传导中均发挥功能。事实上，多个ILPs阵列（在初始钙离子流响应下得以稳定并累积）中富集了TCR以及提示存在活跃信号传导的分子，如PKC-θ、ZAP-70、磷酸化酪氨酸和HS1。因此，ILPs似乎代表了平面双层模型中观察到的TCR信号微簇的三维生理对应结构。该方法因而能够灵敏地揭示或报告其他方法无法检测到的分子、结构（以及隐含的生物力学）动态变化。

本文所述方法有助于弥合专业抗原呈递细胞（APC）与人工抗原呈递细胞基质模型之间的差距，从而增强我们探究适应性免疫应答基本机制的能力。尽管本文重点在于CD4⁺ Th1型效应/记忆细胞的激活，但如后文所述，这一基本方法可轻易修改，用于研究多种T细胞类型和抗原（Ags）。

方案

本方案中描述的所有实验均使用原代人T细胞和商业可得的原代人内皮细胞（皮肤或肺微血管内皮细胞）进行。任何涉及人类受试者的研究方案必须经过机构审查委员会批准，并且每位血液捐献者须提供书面知情同意书。使用本方案进行的实验已获得贝斯以色列女执事医疗中心机构审查委员会的批准。

1. 准备人CD4⁺ Th1效应/记忆T细胞

1. 在供体手臂上绑上止血带，用酒精擦拭静脉，插入针头。使用含EDTA作为抗凝剂的真空采血管缓慢抽取15 ml血液。采血完成后，在拔出针头前先解开止血带。拔针后立即用无菌纱布对穿刺部位施加压力。
2. 将血液转移至50 ml离心管中。加入室温RPMI-1640培养基，按1:1比例稀释（终体积为30 ml）。小心地将稀释后的血液叠加到两个已装有15 ml预过滤淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）的50 ml离心管中，分离液温度为室温。
3. 在室温下，使用水平转子以1,200 × g离心30分钟进行密度梯度离心。离心期间，配制T细胞培养基（500 ml RPMI-1640、50 ml胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素）。
4. 从离心机中取出50 ml离心管后，可见四层：底部为红细胞沉淀，其上为Ficoll层，再上为含有白细胞（包括淋巴细胞）的细胞层，最上层为血浆。用巴斯德吸管小心吸取白细胞层，并转移至50 ml Falcon管中。
5. 通过加入室温RPMI-1460培养基（加至20 ml）洗涤白细胞层，然后在室温下以1,200 × g离心5分钟。将白细胞重悬于1 ml T细胞培养基中。取5 µl上述1 ml细胞悬液加入含250 µl T细胞培养基的1.5 ml离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
6. 将25 µl稀释后的细胞悬液与25 µl 0.4%台盼蓝溶液混合。取10 µl混合液分别加入标准血细胞计数板两侧计数区域。
7. 将血细胞计数板置于低倍光学显微镜下，使用10倍物镜计数两侧计数板中央大方格内未被台盼蓝染色的活细胞数量。
8. 计算细胞浓度时，取两个大方格计数结果的平均值，乘以100（稀释倍数），再乘以10⁴，即得每毫升细胞数（cells/ml）。
9. 用T细胞培养基将细胞终浓度调整为0.5 × 10⁶ cells/ml。向细胞中加入终浓度均为1 µg/ml的细菌超抗原——金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和中毒性休克综合征毒素1（TSST-1）。在37 °C、5% CO₂条件下培养72小时，以扩增CD4⁺ T细胞群体。
10. 将T细胞以1,200 × g离心5分钟，沉淀后重悬于含人IL-15（20 ng/ml）的T细胞培养基中，调整细胞浓度为0.5 × 10⁶ cells/ml。将淋巴细胞转移至T150培养瓶中。根据培养基颜色变化（i.e.，当培养基由粉红色变为微黄色时），每24–48小时在含IL-15的完全培养基中传代扩增一次。所得淋巴细胞群体可维持培养长达15天。
    注意：本方案旨在特异性激活并扩增对SEB和TSST-1有反应的CD4⁺ T细胞亚群，并诱导其向Th1样效应/记忆表型分化。其他白细胞在此培养条件下无法存活和增殖，因此至步骤1.10时，细胞中CD4⁺、CD45RO⁺ T细胞比例至少可达95%¹⁹，可通过流式细胞术轻松验证。如需更高纯度，可使用市售的抗体/磁珠介导的阳性或阴性分选试剂盒进一步纯化。

2. 原代人内皮细胞培养的启动

1. 在无菌条件下，用 PBS 中 20 µg/ml 纤连蛋白（FN）包被 T25 培养瓶。室温放置 30–60 分钟。去除 FN 溶液，加入 5 ml 完全培养基（内皮基础培养基（EBM-2）添加内皮生长培养基（EGM-2）单份添加剂）。在 37 °C 细胞培养箱中预孵育至少 30 分钟。
2. 将一管冻存的人肺或皮肤微血管内皮细胞（HLMVECs 或 HDMVECs）在 37 °C 水浴中解冻，期间轻柔振荡约 2–3 分钟。立即转移细胞至含有预热培养基的 T25 培养瓶中。轻轻混匀后放入 37 °C 培养箱中。
3. 约 4–6 小时后更换培养基。此后每 48 小时左右（或当培养基略变黄时）更换一次培养基，直至培养瓶中细胞融合度达到约 90–95%。

3. 内皮细胞的常规分离与扩增

1. 将细胞培养至约90-95%融合度，可能需要2-5天。传代时，吸除培养基并用PBS洗涤。吸除PBS后，加入最小体积的新鲜1×胰蛋白酶溶液（T25培养瓶加0.5 ml，T75培养瓶加1.5 ml）。轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖整个表面，于37 °C孵育约5分钟。使用低倍光学显微镜观察细胞从培养皿表面脱落的情况。
2. 当大部分细胞变圆或已脱落时，加入5倍体积（即相对于所加胰蛋白酶体积）的预温完全EGM-2培养基，并轻轻吹打瓶壁表面，使所有细胞充分脱离。
3. 按1.6–1.7节所述方法用血细胞计数板计数内皮细胞。通过离心（5分钟，1,200 × g）收集细胞，弃上清。用预温的完全EGM-2 MV培养基调整细胞浓度至每毫升含50万个细胞。
4. 将细胞分装至适当的纤连蛋白（FN）包被培养皿或培养瓶中进行常规培养。轻轻晃匀后放入培养箱。接种后6–12小时内更换培养基，之后大约每48小时更换一次培养基。

4. 内皮细胞转染

注意：大多数常用的化学转染和电穿孔方法难以对原代内皮细胞进行转染。下文所述基于核转染的方法可实现相对较高的转染效率（约50–70%）。一种有效的替代方法是使用合适的病毒载体进行感染（参见材料表中的注释）。

1. 根据需要准备 HLMVECs 或 HDMVECs 的 T25 或 T75 培养瓶，使其最终密度达到 90–95% 汇合度。在无菌条件下，用含 20 µg/mL 纤连蛋白（FN）的 PBS 溶液包被显微镜用培养板（如用于步骤 5 的 Delta-T 板）或置于 24 孔细胞培养板孔内的 12 mm 圆形玻璃盖玻片（用于步骤 6），包被方法如上文（2.1）所述。
2. 向显微镜用培养板中加入 1 mL 完全 EGM-2 培养基，或向每个 24 孔中加入 0.5 mL，并将培养板置于湿润的 37 °C / 5% CO₂ 培养箱中平衡。
3. 按照步骤 3.1–3.3 所述方法收获并计数内皮细胞。将所需体积的细胞（每样本 50 万个细胞）在室温下以 1,200 × g 离心 5 分钟。每样本用 100 µl 室温核转染液小心重悬细胞沉淀。
4. 将 100 µl 细胞悬液与 1–5 µg DNA 混合。将细胞/DNA 混悬液转移至认证的电穿孔杯中；样品必须覆盖电穿孔杯底部且无气泡。
   注意：使用将 YFP 或 DsRed 靶向细胞膜的构建体（通过神经调节蛋白 N 端 20 个氨基酸，该序列含有翻译后棕榈酰化信号）单独转染（仅膜定位 YFP 或仅膜定位 DsRed），或与细胞质体积标记物共转染（例如，膜定位 YFP 与可溶性 DsRed）。可使用多种荧光蛋白标记组合。
5. 用电穿孔杯盖封闭电穿孔杯。将含细胞/DNA 混悬液的电穿孔杯插入电穿孔仪的电穿孔杯架中，运行程序 S-005。程序完成后，将电穿孔杯从架中取出。
6. 向电穿孔杯中加入约 500 µl 预先平衡的培养基，使用核转染试剂盒提供的塑料移液管轻轻将细胞悬液从电穿孔杯中移出。
7. 对于使用显微镜用培养板的实验，将一个反应的细胞悬液均分至两个含有预温培养基的培养皿中（见步骤 4.2–4.3）。对于使用 24 孔板的实验，将一个反应的细胞悬液均分至 3 个孔中。
8. 将细胞置于湿润的 37 °C / 5% CO₂ 培养箱中培养，并在转染后 4–6 小时更换培养基，之后在 12–16 小时再次更换。

5. 活细胞成像与分析

1. 准备内皮细胞
   1. 第0天：通过核转染技术将膜定位YFP和可溶性DsRed共转染至原代人肺微血管内皮细胞（HLMVECs），具体操作如步骤4所述，并将细胞接种于活细胞成像培养板中。
   2. 第1天：更换为含干扰素-γ（IFN-γ，100 ng/ml）的新鲜培养基，以诱导MHC-II表达。第2天，在现有培养基中加入20 ng/ml肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激转染细胞。
   3. 第3天，在实验开始前立即向内皮细胞中加入各1 µg/ml的细菌超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和中毒性休克综合征毒素1（TSST），于37 °C孵育30–60分钟。对于无抗原（“-Ag”）对照条件，省略此步骤。
2. 准备淋巴细胞
   1. 与步骤5.1.3同时进行，配制缓冲液A（不含酚红的HBSS），添加20 mM Hepes（pH 7.4）和0.5% v/v人血清白蛋白，并预热至37 °C。取培养的淋巴细胞样品，使用血细胞计数板计数以确定细胞密度（步骤1.12–1.17）。
   2. 将每份样品200万个细胞在15 ml锥形管中于室温下以1,200 × g离心5分钟。吸除上清液，轻柔地将细胞沉淀重悬于2 ml缓冲液A中，确保无细胞团块残留。
   3. 取新鲜Fura-2钙荧光染料，用DMSO重悬，配制成1 mM的储存液。
   4. 向T细胞悬液中加入2 μl Fura-2储存液（终浓度为2 μM），盖紧管盖后立即倒置混匀，确保染料均匀分散。于37 °C孵育30分钟。
   5. 按步骤5.2.2条件离心。吸除缓冲液A，轻柔但彻底地将淋巴细胞重悬于20–40 μl新鲜缓冲液A中。
3. 活细胞成像设置与图像采集
   注：可使用多种系统在直立或倒置光学显微镜上进行活细胞荧光成像。基本要求包括荧光光源与滤光片、CCD相机、电动滤光片切换装置与快门、加热载物台（或可安装于显微镜的加热腔室）以及用于自动图像采集的软件。本实验方案需使用高数值孔径、高倍率（即，40X、63X）的油浸物镜，以获得必要的空间分辨率。在选择适用于Fura-2钙成像的荧光光源和物镜时需特别注意，并非所有设备均兼容所需的340/380 nm激发波长。也可采用替代方法（兼容标准绿色和红色荧光滤光片组），使用非比率型钙敏感染料（例如，Fluo-4、Rhod-3），但此类染料无法准确量化钙通量，仅能提供相对/定性读数。
   1. 开启显微镜系统（操作用计算机、显微镜主机、CCD相机、滤光轮和氙灯）。
   2. 打开指定软件。
   3. 设置显微镜/软件以进行多通道自动延时成像。包括连续采集微分干涉差（DIC）图像、标准绿色荧光、标准红色荧光以及标准340 nm和380 nm激发的Fura-2图像。设定采集间隔为10–30秒，总时长约20–60分钟。
      1. 设置Fura-2成像的曝光时间。
         1. 添加新鲜的物镜油，将仅含0.5 ml缓冲液A的显微镜培养皿安装至加热载物台适配器上，并立即开启加热至37 °C平衡（约需2–3分钟）。
         2. 使用20 μl移液器将静息状态的Fura-2负载淋巴细胞加入已安装的显微镜培养皿腔室中。
         3. 开启明场成像，选择光路至目镜。使用粗调焦旋钮使物镜接触培养皿底部，再通过目镜和细调焦旋钮对准沉降在皿底的T细胞进行聚焦。
         4. 使用x-y载物台控制选择至少包含10个细胞的视野。避免过于密集的区域和细胞团块，以免产生成像伪影。
         5. 切换至荧光光源，将成像路径从目镜切换至CCD相机。设置采集参数（例如，曝光时间、探测器增益和像素合并）。使用软件采集静息状态下的Fura-2-340和Fura-2-380图像（初始时两通道曝光时间相同，通常在200–1,000毫秒范围内）。
         6. 采用步骤5.4.1所述方法计算每个淋巴细胞的Fura-2-340/Fura-2-380比值。反复调整Fura-2-340和Fura-2-380的曝光时间，采集图像并计算比值，直至平均比值接近1。
      2. 设置mem-YFP和DsRed的曝光时间。
         1. 将步骤5.3.3.1中使用的显微镜培养皿更换为来自细胞培养箱中经转染、激活并经SAg处理（或未处理；对照）的HLMVECs或HDMVECs培养皿（步骤4.5.1）。使用一次性转移移液器快速吸除培养基，加入约1 ml预热的缓冲液A清洗一次，吸除后加入0.5 ml缓冲液A。
         2. 选择存在明亮荧光阳性转染内皮细胞、细胞状态良好且细胞间连接结构清晰的视野。
         3. 调整mem-YFP和DsRed的采集参数（例如，曝光时间、探测器增益和像素合并），确保各通道的平均荧光信号强度处于探测器动态范围的25%至75%之间。
   4. 进行活细胞成像实验。
      1. 使用自动化软件开始图像采集，连续采集若干时间点的图像以建立基线。
      2. 在采集过程中，通过将小体积（P-5或P-20）移液器尖端插入物镜中心附近的培养基中，缓慢挤出约5 μl浓缩的Fura-2负载淋巴细胞（来自步骤5.2），将其加入显微镜培养皿成像区域中心。
      3. 当淋巴细胞沉降至成像视野后，微调焦距，确保T细胞与内皮细胞界面（免疫突触）保持在焦平面内。使用40X和63X物镜时，每视野10–20个细胞为最佳。若视野中细胞数量过少，重复步骤5.3.4.2。
      4. 在完成预定观察时间后，继续成像，并立即用移液器（操作方式同5.3.4.2）将离子霉素直接加入显微镜培养皿中，终浓度为2 μM，以诱导最大钙通量/Fura-2信号（即，作为校准手段，见分析部分5.4）。
      5. 作为步骤5.3.4.4的替代方案，在完成预定观察时间后，立即吸除缓冲液A，加入0.5 ml固定液（含3.7%甲醛的PBS）于室温固定5分钟，随后用PBS洗涤三次。然后进入步骤6。
4. 活细胞成像数据分析
   注：保存采集文件后，可直接分析或导出至多种离线图像分析软件进行处理。ImageJ是一款功能强大且高度灵活的免费软件，几乎兼容所有图像采集软件包。步骤5.1–5.3所述成像实验设计可用于研究在有或无特异性SAg条件下，淋巴细胞与内皮抗原呈递细胞之间相互作用的高时空分辨率动态过程。针对细胞形态计量学/信号动态的成像数据可进行无限多样的分析。本实验方案的具体目标是协同量化淋巴细胞迁移与信号传导（即，细胞内钙通量的动力学特征与水平），以及免疫突触结构的动态变化，重点关注特定特征（即，ILPs/足印结构）。以下列举若干标准与非标准（即，为本实验/问题专门开发）的分析方法示例。
   1. 测量淋巴细胞钙通量
      1. 选择在加入淋巴细胞前采集的初始Fura-2-340（340_nmEX-510_nmEM）和Fura-2-380（380_nmEX-510_nmEM）图像，作为背景图像，并从时间序列中各通道的所有图像中进行数字减除。
      2. 对每个时间点，生成背景扣除后的Fura-2-340与Fura-2-380图像的数字比值图像（即：340_nmEX-510_nmEM-背景 / 380_nmEX-510_nmEM-背景）。
      3. 选择合适的软件绘图工具，点击屏幕在每个淋巴细胞周围绘制圆形感兴趣区域（ROI）。软件将为每个淋巴细胞和时间帧生成像素平均比值。
      4. 使用适当软件（例如，电子表格程序）将计算出的比值对时间作图。通过将每视野中所有淋巴细胞在各时间点的比值总和除以该时间点的淋巴细胞总数，计算实验的平均钙通量。
   2. 进行淋巴细胞迁移轨迹分析。
      1. 使用适当的细胞追踪软件（例如，ImageJ）分析T细胞迁移，基于各视频的DIC通道图像。使用ImageJ细胞追踪插件，在每一帧中手动点击识别每个细胞的质心位置。
      2. 利用所得的连续x-y坐标（即，迁移路径轨迹）计算平均速度（总迁移距离 / 总成像时间）和迂曲度（总迁移距离 / 细胞在首帧与末帧位置之间的直线距离）。
      3. 将这些参数与单个细胞的钙通量（5.4.1）动态进行交叉关联分析。
   3. 评估免疫突触（IS）内足印结构/ILP密度
      1. 统计每个T细胞免疫突触中在特定时间间隔内（例如，T细胞加入后5分钟）形成的ILP总数。这些结构表现为微米级的膜定位YFP荧光环状结构，在淋巴细胞黏附位点处与内皮抗原呈递细胞胞质DsRed的暗环共定位。
      2. 将所得“ILP指数”与单个细胞的钙通量（5.4.1）动态进行交叉关联分析。
   4. 测量足印结构/ILP的寿命
      1. 对某一免疫突触中的每个足印结构/ILP，计算其寿命为该ILP最后一次可见的时间点减去其首次出现的时间点。分别计算每个免疫突触的平均ILP寿命。
      2. 将这些寿命值与单个细胞的钙通量（5.4.1）动态进行交叉关联分析。
   5. 评估初始ILP形成与钙通量之间的时序关系
      1. 对每个淋巴细胞，确定其钙信号首次高于基线的时间点（帧）¹⁹。
      2. 对每个淋巴细胞，确定其首个足印结构/ILP出现的时间点。
      3. 对每个淋巴细胞，通过将初始钙通量时间点从初始足印结构/ILP时间点中减去，计算“偏移时间”。对视野中所有淋巴细胞的值取平均。正值表示ILP形成早于钙通量，负值则表示相反。
         注：这些实验可使用市售的平行壁流动成像室在生理相关的层流剪切条件下轻松完成，具体方法见¹⁹。

6. 固定细胞成像与分析

1. 固定终点 T 细胞-内皮细胞免疫突触形成与染色
   1. 按步骤 1 所述制备 T 细胞。按步骤 5.1 所述制备内皮细胞（± SAg）（转染，步骤 5.1.1 为可选步骤）。取一定量培养的淋巴细胞，用血细胞计数板计数以确定细胞密度（第 1 节）。
   2. 将相当于至少 3 × 10⁵ 淋巴细胞/样本的淋巴细胞培养液体积转移至 15 ml 圆锥形离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，将淋巴细胞沉淀重悬于 Buffer-A（步骤 5.2.1）中，调整细胞浓度至 6 × 10⁵ 淋巴细胞/ml。
   3. 从细胞培养箱中取出内皮细胞，逐个样本操作，依次吸除培养基，并加入 0.5 ml 淋巴细胞悬液（3 × 10⁵ 淋巴细胞/样本），然后放回 37 °C 培养箱中孵育。
   4. 按照上述适当的孵育时间孵育后，吸除孔板中的培养基，加入足量固定液（PBS 中含 3.7% 甲醛），完全覆盖样本（例如，24 孔板中约 300–500 µl）。室温孵育 5–10 分钟。
   5. 用 PBS 清洗样本 3 次。加入一抗，室温孵育 60 分钟（参见列表）。如果一抗靶向细胞内蛋白，则需额外进行通透处理：加入足量通透液（PBS 中含 0.01% Triton X-100），完全覆盖样本，室温处理 1 分钟。再次用 PBS 清洗样本 3 次。加入相应的二抗（某些情况下同时加入荧光标记鬼笔环肽），室温孵育 60 分钟。
   6. 将圆形玻璃盖玻片置于成像载玻片上，完成固定终点 T 细胞-内皮细胞免疫突触形成与染色。开始成像时，将含有样本的成像载玻片放置于显微镜载物台上，选择 63X 油镜。滴加新鲜的浸油。
2. 使用明场成像模式和目镜定位焦平面。切换至落射荧光模式，通过目镜观察样本。选择感兴趣的视野。切换至激光扫描模式。
3. 使用快速扫描模式，在尽可能宽的视野下，分别调节每个通道的激光功率和增益，以优化信号强度，理想情况下，特异性信号强度应达到探测器动态范围的至少 ~25% 但不超过 75%。
4. 使用手动调焦控制，快速扫描 Z 轴，确定切片的上下边界（通常所有信息应包含在约 15 μm 厚度范围内）。选择 Z 轴切片厚度在 ~0.2–1.0 µm 范围内。
5. 最后，对成像视野进行缩放/裁剪至特定感兴趣区域并进行扫描。除了样本中需具有明亮且特异的荧光信号外，获取高分辨率三维成像还需多次扫描并调整采集参数。目标是在无明显光漂白的情况下，获得最大的 x-y 和 z 轴分辨率。
6. 通过适当的软件应用（例如，Image J）对所得光学切片进行数字三维重建，定性分析免疫突触的三维拓扑结构。利用类似软件定量评估荧光信号分布（例如，Pearson 共定位分析、荧光强度相关线扫描分析及正交视图分析）。

结果

开发了一种利用内皮细胞的新型成像方法，该方法结合了平面脂质双层模型的高分辨率优势与专业抗原呈递细胞（APC）的生理复杂性和可变形性（图1）。图2展示了采用该方法观察到的典型迁移行为、钙流及拓扑动力学示例。当内皮表面无超抗原（SAg）存在时，SAg特异性的CD4⁺ Th1淋巴细胞会迅速铺展、极化，并沿内皮表面侧向迁移（图2A），且不发生钙流（未显示）。约5–10分钟后，这些淋巴细胞启动跨内皮迁移。当内皮表面负载SAg时，淋巴细胞则对称铺展，呈现“煎蛋样”拓扑结构，并启动持续性的胞内钙流（即持续30–60分钟）（图2B；视频1），在此期间其迁移活动极微弱或几乎完全停止（图2C）。

讨论

总体而言，本方案描述了研究内皮细胞的两种方法：i) 作为尚未充分研究的生理性抗原呈递细胞（APCs），以及 ii) 作为一类新型的“平面细胞抗原呈递模型”。关于前者，人们日益认识到，非造血来源的外周（或“间质性”）抗原呈递细胞发挥着关键且不可替代的作用（即，相较于造血来源的抗原提呈细胞（APCs）在调控适应性免疫应答中的作用 ^16-18在这些“半专业性”抗原呈递细胞中，血管和淋巴管内皮细胞（其数量远超专业性抗原呈递细胞）是研究最为深入的代表之一。 ^16-18然而，信号事件的细节及其偶联的免疫突触在很大程度上仍未被深入研究。本文所述方法为推进对该新兴领域的理解提供了基础。例如，将这些方法应用于研究在来自不同组织、已知具有独特适应性免疫功能的内皮细胞上形成的免疫突触例如肝脏和淋巴管内皮细胞可能具有特别的指导意义。

值得注意的是，该方法有助于弥合专业性抗原提呈细胞（APC）与人工APC基质模型之间的差距，从而增强对适应性免疫应答基本机制的探究能力。尽管平面APC基质（即，脂质双层、抗体包被的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 无乳胶弹力止血带	BD Biosciences	367203
BD 酒精棉片	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok 安全型采血装置	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer 按压式静脉采血套装	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	使用前恢复至室温
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	热灭活处理
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
金黄色葡萄球菌肠毒素 B	Toxin Technology	BT202RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
中毒性休克综合征毒素 1	Toxin Technology	TT606RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
人 IL-15	R&D Systems	247-IL-025	储存液：50 μg/ml PBS 溶液
PBS	Life Technologies	10010-049
纤连蛋白	Life Technologies	33016-015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
HMVEC-d Ad-Dermal MV 内皮细胞	Lonza	CC-2543	可使用其他人微血管内皮细胞，例如 HLMVEC
EGM-2 MV 子弹头试剂盒	Lonza	CC-3202
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	储存液：10×，用 PBS 稀释
amaxa-HMVEC-L 核转染试剂盒	Lonza	vpb1003	步骤 4 所需试剂盒
IFN-γ	Sigma-Aldrich	I3265	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
人 TNF-α 10 μg	Life Technologies	PHC3015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
无酚红 HBSS	Life Technologies	14175-103
HEPES	Fisher Scientific	BP299-100
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016-100G	储存液：1 M H₂O 溶液
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337	储存液：1 M H₂O 溶液
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F 无荧光浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20×50 μg	Life Technologies	F1221	储存液：1 mM DMSO 溶液
pEYFP-Mem（膜定位 YFP）	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer（可溶性细胞质 DsRed）	Clontech	632466
pDsRed-Monomer Membrane（膜定位 DsRed）	Clontech	632512
pEGFP-Actin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
37% 甲醛溶液	Fisher Scientific	BP531-500	有毒，需在通风橱中操作
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
Falcon 组织培养处理 T25 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-9
Falcon 组织培养处理 T75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
Corning 组织培养处理 T175 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-61
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-85	直径 12 mm
Falcon 24 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T 培养板	Bioptechs	04200415B
Wheaton 一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 小鼠抗人单克隆抗体	BD Biosciences	555509
HS1 小鼠抗人单克隆抗体	BD Biosciences	610541
抗人 CD11a（LFA-1α）纯化抗体	ebioscience	BMS102
抗人 CD3 Alexa Fluor® 488 标记抗体	ebioscience	53-0037-41
抗 MHC II 类分子抗体	Abcam	ab55152
抗 Talin 1 抗体	Abcam	ab71333
抗 PKC theta 抗体	Abcam	ab109481
磷酸化酪氨酸抗体（4G10 Platinum）	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		步骤 4 所需电穿孔仪
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovision 软件	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425（Series 60）生物安全柜	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱	Fisher Scientific	202370
Centrifuge 5810 离心机	Eppendorf	EW-02570-02
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血细胞计数板
Isotemp 水浴锅 202 型	Fisher Scientific	15-462-2