用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

摘要

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。

摘要

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞（“APCs”）之间的动态相互作用所调控，这些相互作用被称为“免疫突触”。在这些紧密的细胞-细胞界面中，MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子和信号分子会形成离散的亚细胞簇，并迅速重组。这些动态变化被认为是决定免疫应答效率与质量的关键因素，从而影响保护性免疫与病理性免疫的差异。目前对生理性APC中免疫突触的理解受限于成像分辨率的不足。尽管人工基底模型（例如，平面脂双层）提供了优异的分辨率，并已成为极为有价值的工具，但其本质上缺乏生理相关性且过于简化。血管和淋巴管内皮细胞已逐渐被视为一类重要的外周组织（或基质）“半专业性APC”组分。这些APC（表达大多数专业性APC的分子机制）具有一个独特特征，即能够形成近乎平面的细胞表面，并且易于转染（例如，携带荧光蛋白报告基因）。本文将介绍一种基本方法，利用内皮细胞构建一种新颖且具有生理相关性的“平面细胞APC模型”，以改善对基本抗原信号传导过程的成像与研究。

引言

T淋巴细胞是适应性免疫系统的一个分支，其特征是能够通过T细胞受体（TCRs）高效识别与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的肽类抗原（Ag）¹。初始淋巴细胞会持续迁移，并在淋巴结内扫描“专业的抗原呈递细胞”（APCs；例如，树突状细胞），而记忆/效应T细胞则需要在周围组织中有效监测大量多样的抗原呈递细胞及潜在靶细胞。

在淋巴细胞初次识别抗原提呈细胞（APC）上的同源抗原（Ag）后的几分钟内，其迁移运动即停止，并开始形成一种特化的紧密细胞间界面，称为“免疫突触”（immunological synapse, IS）。持续较长时间（即 30–60 分钟）的IS接触对于信号的放大和维持至关重要^2–7。最新研究发现，在免疫突触内部，离散的亚细胞信号微簇（即 包含MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子及信号分子）的持续形成和快速重塑，决定了最终免疫应答的强度与质量^2–7。然而，该过程的动态细节及其调控机制尚未完全阐明^8,9。这在很大程度上源于技术上的挑战，包括APC表面结构的不规则拓扑形态以及细胞间相互作用平面方向难以精确控制，这些问题严重限制了所需的时空成像技术的应用^8–10（图1A）。

方案

本方案中描述的所有实验均使用原代人T细胞和商业可得的原代人内皮细胞（皮肤或肺微血管内皮细胞）进行。任何涉及人类受试者的研究方案必须经过机构审查委员会批准，并且每位血液捐献者须提供书面知情同意书。使用本方案进行的实验已获得贝斯以色列女执事医疗中心机构审查委员会的批准。

1. 准备人CD4⁺ Th1效应/记忆T细胞

1. 在供体手臂上绑上止血带，用酒精擦拭静脉，插入针头。使用含EDTA作为抗凝剂的真空采血管缓慢抽取15 ml血液。采血完成后，在拔出针头前先解开止血带。拔针后立即用无菌纱布对穿刺部位施加压力。
2. 将血液转移至50 ml离心管中。加入室温RPMI-1640培养基，按1:1比例稀释（终体积为30 ml）。小心地将稀释后的血液叠加到两个已装有15 ml预过滤淋巴细胞分离液（如Ficoll-Paque）的50 ml离心管中，分离液温度为室温。
3. 在室温下，使用水平转子以1,200 × g离心30分钟进行密度梯度离心。离心期间，配制T细胞培养基（500 ml RPMI-1640、50 ml胎牛血清、5 ml青霉素/链霉素）。
4. 从离心机中取出50 ml离心管后，可见四层：底部为红细胞沉淀，其上为Ficoll层，再上为含有白细胞（包括淋巴细胞）的细胞层，最上层为血浆。用巴斯德吸管小心吸取白细胞层，并转移至50 ml Falcon管中。
5. 通过加入室温RPMI-1460培养基（加至20 ml）洗涤白细胞层，然后....

结果

一种利用内皮细胞并将平面脂质双层模型的高分辨率优势与专业抗原呈递细胞的生理复杂性和可变形性相结合的新型成像方法被开发出来（图1). 图2 提供了采用该方法观察到的典型迁移、钙流和拓扑动力学实例。在内皮细胞缺乏SAg的情况下，SAg特异性CD4⁺ Th1 淋巴细胞在内皮表面快速扩散、极化并进行侧向迁移（图2A）但不添加钙离子（未显示）。大约5-10分钟内，这些淋巴细胞开始穿过内皮细胞进行跨内皮迁移。当内皮细胞负载超抗原（SAg）时，淋巴细胞呈对称性铺展，形成“煎蛋样”拓扑结构，并启动持续的（即， 30-60 分钟）细胞内钙离子流图2B；视频1），在此期间它们表现出极少或没有迁移现象（图 2C).

讨论

总体而言，本方案描述了研究内皮细胞的两种方法：i) 作为尚未充分研究的生理性抗原呈递细胞（APCs），以及 ii) 作为一类新型的“平面细胞抗原呈递模型”。关于前者，人们日益认识到，非造血来源的外周（或“间质性”）抗原呈递细胞发挥着关键且不可替代的作用（即，相较于造血来源的抗原提呈细胞（APCs）在调控适应性免疫应答中的作用 ^16-18在这些“半专业性”抗原呈递细胞中，血管和淋巴管内皮细胞（其数量远超专业性抗原呈递细胞）是研究最为深入的代表之一。 ^16-18然而，信号事件的细节及其偶联的免疫突触在很大程度上仍未被深入研究。本文所述方法为推进对该新兴领域的理解提供了基础。例如，将这些方法应用于研究在来自不同组织、已知具有独特适应性免疫功能的内皮细胞上形成的免疫突触例如肝脏和淋巴管内皮细胞可能具有特别的指导意义。

值得注意的是，该方法有助于弥合专业性抗原提呈细胞（APC）与人工APC基质模型之间的差距，从而增强对适应性免疫应答基本机制的探究能力。尽管平面APC基质（即，脂质双层、抗体包被的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer 无乳胶弹力止血带	BD Biosciences	367203
BD 酒精棉片	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok 安全型采血装置	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer 按压式静脉采血套装	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	使用前恢复至室温
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	热灭活处理
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
金黄色葡萄球菌肠毒素 B	Toxin Technology	BT202RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
中毒性休克综合征毒素 1	Toxin Technology	TT606RED	储存液：1 mg/ml PBS 溶液
人 IL-15	R&D Systems	247-IL-025	储存液：50 μg/ml PBS 溶液
PBS	Life Technologies	10010-049
纤连蛋白	Life Technologies	33016-015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
HMVEC-d Ad-Dermal MV 内皮细胞	Lonza	CC-2543	可使用其他人微血管内皮细胞，例如 HLMVEC
EGM-2 MV 子弹头试剂盒	Lonza	CC-3202
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	储存液：10×，用 PBS 稀释
amaxa-HMVEC-L 核转染试剂盒	Lonza	vpb1003	步骤 4 所需试剂盒
IFN-γ	Sigma-Aldrich	I3265	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
人 TNF-α 10 μg	Life Technologies	PHC3015	储存液：1 mg/ml H₂O 溶液
无酚红 HBSS	Life Technologies	14175-103
HEPES	Fisher Scientific	BP299-100
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016-100G	储存液：1 M H₂O 溶液
氯化镁	Sigma-Aldrich	208337	储存液：1 M H₂O 溶液
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F 无荧光浸油	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20×50 μg	Life Technologies	F1221	储存液：1 mM DMSO 溶液
pEYFP-Mem（膜定位 YFP）	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer（可溶性细胞质 DsRed）	Clontech	632466
pDsRed-Monomer Membrane（膜定位 DsRed）	Clontech	632512
pEGFP-Actin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
37% 甲醛溶液	Fisher Scientific	BP531-500	有毒，需在通风橱中操作
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
Falcon 组织培养处理 T25 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-9
Falcon 组织培养处理 T75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
Corning 组织培养处理 T175 培养瓶	Fisher Scientific	10-126-61
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-85	直径 12 mm
Falcon 24 孔组织培养板	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T 培养板	Bioptechs	04200415B
Wheaton 一次性巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 小鼠抗人单克隆抗体	BD Biosciences	555509
HS1 小鼠抗人单克隆抗体	BD Biosciences	610541
抗人 CD11a（LFA-1α）纯化抗体	ebioscience	BMS102
抗人 CD3 Alexa Fluor® 488 标记抗体	ebioscience	53-0037-41
抗 MHC II 类分子抗体	Abcam	ab55152
抗 Talin 1 抗体	Abcam	ab71333
抗 PKC theta 抗体	Abcam	ab109481
磷酸化酪氨酸抗体（4G10 Platinum）	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		步骤 4 所需电穿孔仪
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovision 软件	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425（Series 60）生物安全柜	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱	Fisher Scientific	202370
Centrifuge 5810 离心机	Eppendorf	EW-02570-02
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血细胞计数板
Isotemp 水浴锅 202 型	Fisher Scientific	15-462-2