本文介绍了一种结合临床相关吻合构型的动静脉瘘（AVF）失败的小鼠模型。该模型可用于研究其病理生理机制，并测试潜在的治疗干预措施。
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本文内容
摘要
摘要
动静脉瘘（AVF）仍然存在较高的失败率，其原因在于血管重塑不足以及内膜增生，而后者的精确病理生理机制尚不明确。为了揭示其病理生理过程，研究人员建立了一种模拟AVF失败的小鼠模型，该模型中吻合口的构型与临床实践中 preferred 的情况相似。该模型通过使用间断缝合法将颈外静脉分支的静脉断端连接至颈总动脉侧壁来构建AVF。在组织学层面，我们观察到静脉流出道出现进行性狭窄性内膜病变，这与人类失败的AVF中所见的病变一致。尽管由于动物体型微小，该手术在技术上具有挑战性，但在经过充分训练后，我们实现了97%的手术成功率。小鼠模型的一个主要优势在于可获得转基因动物。鉴于目前提出的多种可能导致AVF失败的机制，敲除可能参与血管重塑的基因将有助于我们揭示AVF失败复杂的病理生理过程。
引言
对于依赖长期血液透析维持生命的肾衰竭患者而言，功能良好的血管通路至关重要。目前，动静脉内瘘（AVF）是血管通路的首选方案。然而，与AVF相关的并发症是接受长期血液透析患者发病的主要原因之一。尽管科学界已付出大量努力，但所有旨在减少AVF通路相关并发症的新型方法均未能显著改善AVF的使用寿命。这一进展令人失望的部分原因在于对血液透析通路失败的潜在病理生理机制尚缺乏充分理解。
为了阐明动静脉通路功能障碍的病理生理机制，建立能够紧密模拟人类病理特征的动物模型至关重要。在这方面，不仅需要考虑动物物种，还应考虑吻合部位、所需的抗凝治疗以及术后随访的持续时间1。尽管大型动物最适合用于开发新治疗策略的干预性研究，但由于存在大量可用的转基因小鼠，小鼠模型在揭示动静脉通路功能障碍潜在分子机制方面具有最大潜力。此外，与使用大型动物相比，使用大量小鼠进行此类研究的成本更低。
首个小鼠动静脉瘘（AVF）失败模型由 Kwei 和 et al.2 于2004年描述。在该模型中，使用血管内导管以端对端方式连接颈总动脉与颈外静脉构建 AVF。尽管该模型可用于研究 AVF 早期的静脉适应性变化，但其端对端的吻合方式以及血管内导管的存在限制了其在模拟人类 AVF 中的有效性。Castier 和 et al.3 随后提出了一种改进的 AVF 模型，将颈总动脉....
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方案
所有实验均经莱顿大学医学中心动物福利委员会批准。
1. 动物准备与麻醉
- 将小鼠（1-3个月大）置于充满3-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中进行麻醉。
- 使用电动剃刀剃除小鼠颈部腹侧及左后肢内侧的毛发，并用胶带粘去残留毛发。
- 在双眼上涂抹眼用软膏。
- 将动物仰卧位固定在加热毯上，鼻部对准已固定的鼻式通气面罩，并用胶带将头部固定于面罩上。
- 使用富氧空气输送异氟烷，氧气流量设定为：空气0.3 L/min，100%氧气0.2 L/min，异氟烷浓度维持在1.5-2.0%。通过夹捏足趾间皮肤评估麻醉深度，并根据需要调整异氟烷浓度。
- 用胶带将动物四肢固定于设定温度约为37 °C的加热毯上，保持仰卧位。
- 在动物侧腹部皮下注射用0.9%氯化钠（NaCl）溶液溶解的丁丙诺啡，剂量为0.1 mg/kg，同时注射0.5 ml 无菌0.9% NaCl溶液。
- 在已消毒的手术区域涂抹0.5%氯己定酊。
2. 皮肤切口
- 将动物置于显微镜下，使其头部朝向手术者。
- 使用显微剪刀在颈部腹侧正中线处做一条长约1.5 cm的纵向切口。
- 用镊子夹住唾液腺，并将右侧唾液腺向头侧移位，直至其部分....
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结果
吻合完成后（图1），应使用血管钳短暂阻断静脉流出道以评估其通畅性。当吻合口通畅时，阻断部位近端的血管应明显出现搏动性扩张。此外，可通过近红外荧光成像（NIRF）技术进一步确认通畅性，该技术可有效发挥血管造影的作用（图2）。手术操作失败可能导致吻合口闭塞，如（图2）所示。此类失败可能由吻合区域过窄、血管扭曲、肝素剂量不足，或缝合时意外将吻合口前壁与后壁缝合在一起所致。
在组织学水平上，利用该模型可优雅地研究动静脉内瘘（AVF）中的血管重塑过程。AVF中的血管重塑是由于血流量和压力增加所致。在小鼠中，这一反应表现为周长增加（例如，外向性重塑），从而在术后前2周内导致管腔面积增大。此后2周，由于外向性重塑停止且内膜持续增厚，管腔面积逐渐减小。这些进行性狭窄病变的形成导致术后4周时50%的AVF发生闭塞。因此，获取AVF组织的最佳时间点为术后2周，因为在此阶段，仍可对通畅AVF中的血管反应进行充分分析。术后2周对静脉流出道进行免疫染色显示，内膜的细胞成分主要由α-平滑肌肌.......
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讨论
动静脉内瘘（AVF）被认为是血液透析治疗中的薄弱环节。遗憾的是，AVF 仍存在较高的失败率8-10。尽管对潜在机制已进行了广泛研究，但其确切的病理生理机制仍不明确。目前文献中已描述了多种用于研究 AVF 失败的小鼠模型2,3,11,12。然而，这些模型均未采用临床上最常用的静脉端与动脉侧吻合的构型。这一点非常重要，因为由此产生的血流动力学特征在血管重塑过程中起着关键作用。此外，部分模型在动脉与静脉连接时使用了合成套管2,11，而此类装置在临床实践中并未应用。
为了提高临床相关性，我们因此建立了一种小鼠模型，在颈外静脉分支与颈总动脉之间采用间断缝合的方式创建单侧静脉端对动脉侧的吻合6。在该模型中观察到关键的组织形态学改变，包括向外重塑和进行性内膜增生，最终导致动静脉瘘功能衰竭。
手术过程中的一个关键环节是麻醉方案。建议使用异氟烷吸入麻醉，因为这是一种安全且简便的方法，可实现长时间的麻醉效果。这一点在训练阶段尤为重要，因为整个手术过程可能长达3.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由荷兰肾脏基金会（KJPB 08.0003）的资助支持。
感谢 Carolien Rothuizen 对本研究的贡献。感谢 Hoang Pham 在病理学检测工作中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖显微镜 | Leica | M80 | |
| 镊子 | Medicon | 07.61.25 | |
| 血管镊 | S&T | JFL-3D.2 | |
| 血管镊 | S&T | D-5a.2 | |
| 镊子 | Roboz | SS/45 | |
| 5 mm 刀头显微剪 | Fine science tools | 15000-08 | |
| 2 mm 刀头显微剪 | Fine science tools | 15000-03 | |
| 剪刀 | Medicon | 05.12.21 | |
| 血管夹施放器 1 | S&T | CAF-4 | |
| 血管夹 1 | S&T | B-1V | |
| 血管夹施放器 2 | BBraun | FE572K | |
| 血管夹 2 | BBraun | FE740K | |
| 止血钳 | BBraun | BH110 | |
| 10.0 缝线 | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 缝线 | BBraun | 768464 | |
| 电凝器 | Fine science tools | 18010-00 | |
| 持针器 | Medicon | 11.82.18 | |
| 眼用软膏 | Pharmachemie | 41821101 | |
| 0.5% 氯己定酊 | Leiden University Medical Center | NA | |
| 肝素 | Leo Pharma | 012866-08 | |
| 丁丙诺啡 | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| 异氟烷 | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| 麻醉面罩 | Maastricht university | custom made | |
| 咪达唑仑 | Actavis | AAAC6877 | |
| 右美托咪定 | Orion | 141-267 | |
| 芬太尼 | Bipharma | 15923002 | |
| 持续麻醉诱导室 | Vet-tech solutions | AN010R |
参考文献
- Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in ....
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重印与许可
