需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种新型的小鼠动静脉瘘衰竭模型：手术步骤详解

13.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53294

⸱

2016年2月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, 3Department of Surgery, Leiden University Medical Center, 4Division of Nephrology, University of Cincinnati

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合临床相关吻合构型的动静脉瘘（AVF）失败的小鼠模型。该模型可用于研究其病理生理机制，并测试潜在的治疗干预措施。

摘要

动静脉瘘（AVF）仍然存在较高的失败率，其原因在于血管重塑不足以及内膜增生，而后者的精确病理生理机制尚不明确。为了揭示其病理生理过程，研究人员建立了一种模拟AVF失败的小鼠模型，该模型中吻合口的构型与临床实践中 preferred 的情况相似。该模型通过使用间断缝合法将颈外静脉分支的静脉断端连接至颈总动脉侧壁来构建AVF。在组织学层面，我们观察到静脉流出道出现进行性狭窄性内膜病变，这与人类失败的AVF中所见的病变一致。尽管由于动物体型微小，该手术在技术上具有挑战性，但在经过充分训练后，我们实现了97%的手术成功率。小鼠模型的一个主要优势在于可获得转基因动物。鉴于目前提出的多种可能导致AVF失败的机制，敲除可能参与血管重塑的基因将有助于我们揭示AVF失败复杂的病理生理过程。

引言

对于依赖长期血液透析维持生命的肾衰竭患者而言，功能良好的血管通路至关重要。目前，动静脉内瘘（AVF）是血管通路的首选方案。然而，与AVF相关的并发症是接受长期血液透析患者发病的主要原因之一。尽管科学界已付出大量努力，但所有旨在减少AVF通路相关并发症的新型方法均未能显著改善AVF的使用寿命。这一进展令人失望的部分原因在于对血液透析通路失败的潜在病理生理机制尚缺乏充分理解。

为了阐明动静脉通路功能障碍的病理生理机制，建立能够紧密模拟人类病理特征的动物模型至关重要。在这方面，不仅需要考虑动物物种，还应考虑吻合部位、所需的抗凝治疗以及术后随访的持续时间1。尽管大型动物最适合用于开发新治疗策略的干预性研究，但由于存在大量可用的转基因小鼠，小鼠模型在揭示动静脉通路功能障碍潜在分子机制方面具有最大潜力。此外，与使用大型动物相比，使用大量小鼠进行此类研究的成本更低。

首个小鼠动静脉瘘（AVF）失败模型由 Kwei 和 et al.2 于2004年描述。在该模型中，使用血管内导管以端对端方式连接颈总动脉与颈外静脉构建 AVF。尽管该模型可用于研究 AVF 早期的静脉适应性变化，但其端对端的吻合方式以及血管内导管的存在限制了其在模拟人类 AVF 中的有效性。Castier 和 et al.3 随后提出了一种改进的 AVF 模型，将颈总动脉的断端与颈外静脉的侧壁进行吻合。然而，血液透析患者的 AVF 通常是由静脉断端与动脉侧壁吻合而成。AVF 的确切吻合方式是动静脉通路模型的关键特征，因为它决定了血管通路内的血流动力学特征4，而后者是导致内皮功能障碍及继发性内膜增生（IH）的重要因素5。

最近开发了一种新型的小鼠模型，其解剖结构与人类所采用的完全相同6。在该模型中，通过间断缝合将C57BL/6小鼠颈外静脉分支的断端与颈总动脉侧壁吻合，从而建立动静脉瘘（AVF）。在本文中，我们重点介绍该模型的显微外科手术操作，以促进这一小鼠模型的广泛应用，旨在揭示血液透析通路失功的复杂病理生理机制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验均经莱顿大学医学中心动物福利委员会批准。

1. 动物准备与麻醉

  1. 将小鼠（1-3个月大）置于充满3-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中进行麻醉。
  2. 使用电动剃刀剃除小鼠颈部腹侧及左后肢内侧的毛发，并用胶带粘去残留毛发。
  3. 在双眼上涂抹眼用软膏。
  4. 将动物仰卧位固定在加热毯上，鼻部对准已固定的鼻式通气面罩，并用胶带将头部固定于面罩上。
    1. 使用富氧空气输送异氟烷，氧气流量设定为：空气0.3 L/min，100%氧气0.2 L/min，异氟烷浓度维持在1.5-2.0%。通过夹捏足趾间皮肤评估麻醉深度，并根据需要调整异氟烷浓度。
  5. 用胶带将动物四肢固定于设定温度约为37 °C的加热毯上，保持仰卧位。
  6. 在动物侧腹部皮下注射用0.9%氯化钠（NaCl）溶液溶解的丁丙诺啡，剂量为0.1 mg/kg，同时注射0.5 ml 无菌0.9% NaCl溶液。
  7. 在已消毒的手术区域涂抹0.5%氯己定酊。

2. 皮肤切口

  1. 将动物置于显微镜下，使其头部朝向手术者。
  2. 使用显微剪刀在颈部腹侧正中线处做一条长约1.5 cm的纵向切口。
  3. 用镊子夹住唾液腺，并将右侧唾液腺向头侧移位，直至其部分露出切口外。

3. 解剖和准备静脉

  1. 沿血管走向，紧贴右侧颈外静脉的背内侧分支，将其从周围血管组织中完全钝性分离。
  2. 在游离的静脉周围放置一个结扎线环（10.0 缝线），打一个单结但不锁紧。

4. 去除胸锁乳突肌

  1. 使用镊子沿右侧胸锁乳突肌的边缘钝性分离其周围组织。将一对张开的镊子置于游离后的肌肉下方，用6.0缝线在其近端和远端分别结扎。随后使用电灼器切除该肌肉。

5. 解剖并准备颈总动脉

  1. 使用镊子识别并分离右侧颈总动脉。在动脉周围放置一根6.0规格的缝合线，以辅助操作动脉。
  2. 尽可能在远端和近端应用血管夹。
  3. 使用专用显微剪刀在动脉中部做长约1 mm的纵向切口。
  4. 用肝素溶液［100 IU/ml］冲洗动脉，直至血管内血液完全清除。
  5. 根据需要测量并调整切口长度，使其与血管夹宽度［1.1 mm］相匹配。

6. 静脉结扎

  1. 在已准备好的静脉近端施加血管夹，并在静脉周围放置缝合线。
  2. 使用夹在缝合线上的止血钳对静脉施加轻柔的尾向牵引，并尽可能远端地用先前放置的10.0缝线结扎静脉。
  3. 用剪刀在结扎处近端稍前方剪断静脉。
  4. 使用血管钳轻轻打开静脉管腔，并用肝素溶液 [100 IU/ml] 冲洗。

7. 吻合口的建立 第1部分

  1. 使用间断缝合（10.0缝线），在十二点位置打两个方结，将静脉与动脉连接，随后在六点位置缝合一针。确保连接静脉与动脉时，避免其绕自身轴线旋转。旋转动物体位以改善手术视野暴露。
  2. 在静脉周围放置缝线，并使用止血钳施加轻柔的侧向牵引。
  3. 采用相同的间断缝合方式，在吻合口可见的腹侧区域再缝合约3至4针，完成吻合。

8. 肝素给药

  1. 将加热毯旋转180°，并将显微镜对焦于左上肢。
  2. 通过观察上肢内侧纵向走行并可透过皮肤看到的血管结构，识别股静脉/动脉/神经束。用显微剪刀在股静脉正上方沿纵轴方向做约1 cm的切口。
  3. 仔细分离股静脉周围的血管周围组织，并向股静脉内注射肝素，剂量为0.2 IU/g体重。

9. 吻合口的建立 第2部分

  1. 返回颈部区域，移除之前放置在静脉周围的缝合线。
  2. 放置一条缝合线（6.0），从颈动脉下方穿过，再经过静脉上方，然后再次从颈动脉下方穿出。（图1L）
  3. 移除静脉血管夹。
  4. 接着，沿颈动脉轴线顺时针方向将尚未完成的动静脉瘘扭转180°，同时扭转两个血管夹，并对缝合线的两端施加向内牵引力。
  5. 以与步骤7.2中所述相同的方式完成吻合。

10. 血管钳移除

  1. 移除缝合线，并将血管夹逆时针旋转180°。
  2. 先移除远端血管夹，随后移除近端血管夹。
  3. 用血管镊轻轻阻断静脉流出道，以评估吻合口的通畅性。若吻合口通畅，阻断前的静脉段将呈搏动性扩张。使用镊子将右侧唾液腺复位至其原始解剖位置。

11. 皮肤缝合与术后护理

  1. 使用连续缝合（6.0）缝合大腿部位的皮肤。
  2. 使用连续缝合（6.0）缝合颈部皮肤。
  3. 将动物从加热毯上移开，并皮下注射0.5 ml 0.9%氯化钠溶液。
  4. 将动物置于由加热灯保温的昏暗笼子中，使其完全恢复。若动物未能完全恢复，需确认其是否因手术区域出血而出现血流动力学休克，注意观察颈部肿胀和血液渗漏等迹象。
  5. 在首次注射布托啡诺约6小时后，皮下注射一次缓释型布托啡诺制剂，剂量按制造商推荐量给予，以确保额外72小时的充分镇痛效果。    

12. 组织采集

  1. 通过腹腔注射给予咪达唑仑（5 mg/kg）、美托咪啶（0.5 mg/kg）和芬太尼（0.05 mg/kg）的麻醉混合物，使动物麻醉。
  2. 将动物仰卧位固定，用针穿过其足掌和颊部，插入非加热硅胶垫中。
  3. 使用显微剪刀在颈部瘢痕处做一条长约1.5–2.0 cm的切口。
  4. 解剖动静脉瘘（AVF），并在近端动脉、远端动脉及静脉流出道周围放置缝线（6.0），以便于识别。
  5. 按照方案第10.3节所述方法评估AVF的通畅性。
  6. 使用显微剪刀行正中腹腔切开术，打开腹腔。
    1. 从锁骨中线尾侧开始，用剪刀剪开左右腹侧肋骨笼；使用显微剪刀横断附着于腹侧肋骨笼中部的膈肌，随后用镊子将该部分组织向头侧移位。
    2. 定位下腔静脉，并用显微剪刀将其横断。
  7. 将23号针头插入左心室，在约100 mmHg的压力下用PBS灌注，直至血管内液体基本澄清。
  8. 不拔出针头，继续在约100 mmHg的压力下灌注4%甲醛溶液10分钟。
  9. 使用显微剪刀横断动静脉瘘两端的动脉和静脉，将AVF完整切除，并浸入4%甲醛溶液中过夜（O/N）。

13. 组织包埋与切片

  1. 根据制造商的方案将组织处理成石蜡包埋样品。所采用的方案包括以下步骤：
    1. 在70%乙醇中浸渍1小时，室温。重复2次。
    2. 在96%乙醇中浸渍1小时，室温。重复2次。
    3. 在99.5%乙醇中浸渍1小时，室温。重复1次。
    4. 在99.5%乙醇中浸渍1.5小时，室温。
    5. 在100%二甲苯中浸渍1小时，室温。重复1次。
    6. 在石蜡中浸渍1小时，62 °C。重复2次。
  2. 将动静脉瘘（AVF）包埋于石蜡中，使静脉流出道与包埋盒方向垂直。
  3. 使用切片机连续切取12组系列切片，每组包含30张厚度为5 µm的切片。然后从每组系列切片中各取一张，按顺序从第1至第12号位置依次贴于载玻片上，起始位置为最靠近吻合口的区域。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

吻合完成后（图1），应使用血管钳短暂阻断静脉流出道以评估其通畅性。当吻合口通畅时，阻断部位近端的血管应明显出现搏动性扩张。此外，可通过近红外荧光成像（NIRF）技术进一步确认通畅性，该技术可有效发挥血管造影的作用（图2）。手术操作失败可能导致吻合口闭塞，如（图2）所示。此类失败可能由吻合区域过窄、血管扭曲、肝素剂量不足，或缝合时意外将吻合口前壁与后壁缝合在一起所致。

在组织学水平上，利用该模型可优雅地研究动静脉内瘘（AVF）中的血管重塑过程。AVF中的血管重塑是由于血流量和压力增加所致。在小鼠中，这一反应表现为周长增加（例如，外向性重塑），从而在术后前2周内导致管腔面积增大。此后2周，由于外向性重塑停止且内膜持续增厚，管腔面积逐渐减小。这些进行性狭窄病变的形成导致术后4周时50%的AVF发生闭塞。因此，获取AVF组织的最佳时间点为术后2周，因为在此阶段，仍可对通畅AVF中的血管反应进行充分分析。术后2周对静脉流出道进行免疫染色显示，内膜的细胞成分主要由α-平滑肌肌...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

动静脉内瘘（AVF）被认为是血液透析治疗中的薄弱环节。遗憾的是，AVF 仍存在较高的失败率8-10。尽管对潜在机制已进行了广泛研究，但其确切的病理生理机制仍不明确。目前文献中已描述了多种用于研究 AVF 失败的小鼠模型2,3,11,12。然而，这些模型均未采用临床上最常用的静脉端与动脉侧吻合的构型。这一点非常重要，因为由此产生的血流动力学特征在血管重塑过程中起着关键作用。此外，部分模型在动脉与静脉连接时使用了合成套管2,11，而此类装置在临床实践中并未应用。

为了提高临床相关性，我们因此建立了一种小鼠模型，在颈外静脉分支与颈总动脉之间采用间断缝合的方式创建单侧静脉端对动脉侧的吻合6。在该模型中观察到关键的组织形态学改变，包括向外重塑和进行性内膜增生，最终导致动静脉瘘功能衰竭。

手术过程中的一个关键环节是麻醉方案。建议使用异氟烷吸入麻醉，因为这是一种安全且简便的方法，可实现长时间的麻醉效果。这一点在训练阶段尤为重要，因为整个手术过程可能长达3...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。 

致谢

本研究由荷兰肾脏基金会（KJPB 08.0003）的资助支持。

感谢 Carolien Rothuizen 对本研究的贡献。感谢 Hoang Pham 在病理学检测工作中的协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖显微镜LeicaM80
镊子Medicon07.61.25
血管镊S&TJFL-3D.2
血管镊S&TD-5a.2
镊子RobozSS/45
5 mm 刀头显微剪Fine science tools15000-08
2 mm 刀头显微剪Fine science tools15000-03
剪刀Medicon05.12.21
血管夹施放器 1S&TCAF-4
血管夹 1S&TB-1V
血管夹施放器 2BBraunFE572K
血管夹 2BBraunFE740K
止血钳BBraunBH110
10.0 缝线BBraunG1117041
6.0 缝线BBraun768464
电凝器Fine science tools18010-00
持针器Medicon11.82.18
眼用软膏Pharmachemie41821101
0.5% 氯己定酊Leiden University Medical CenterNA
肝素Leo Pharma012866-08
丁丙诺啡RB Pharmaceuticals 283732
异氟烷Pharmachemie45,112,110
麻醉面罩Maastricht universitycustom made
咪达唑仑ActavisAAAC6877
右美托咪定Orion141-267
芬太尼Bipharma15923002
持续麻醉诱导室Vet-tech solutionsAN010R

参考文献

  1. Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
  2. Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
  3. Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
  4. Krishnamoorthy, M. K., et al. Hemodynamic wall shear stress profiles influence the magnitude and pattern of stenosis in a pig AV fistula. Kidney Int. 74 (11), 1410-1419 (2008).
  5. Ene-Iordache, B., Cattaneo, L., Dubini, G., Remuzzi, A. Effect of anastomosis angle on the localization of disturbed flow in 'side-to-end' fistulae for haemodialysis access. Nephrol. Dial. Transplant. 28 (4), 997-1005 (2013).
  6. Wong, C. Y., et al. Vascular remodeling and intimal hyperplasia in a novel murine model of arteriovenous fistula failure. J.Vasc.Surg. 59 (1), 192-201 (2014).
  7. Rekhter, M., Nicholls, S., Ferguson, M., Gordon, D. Cell proliferation in human arteriovenous fistulas used for hemodialysis. Arterioscler. Thromb. 13 (4), 609-617 (1993).
  8. Falk, A. Maintenance and salvage of arteriovenous fistulas. J. Vasc. Interv. Radiol. 17 (5), 807-813 (2006).
  9. Tordoir, J. H., et al. Prospective evaluation of failure modes in autogenous radiocephalic wrist access for haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2), 378-383 (2003).
  10. Dixon, B. S., Novak, L., Fangman, J. Hemodialysis vascular access survival: upper-arm native arteriovenous fistula. Am. J. Kidney Dis. 39 (1), 92-101 (2002).
  11. Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J. Vasc. Interv. Radiol. 20 (7), 946-950 (2009).
  12. Kang, L., et al. Regional and systemic hemodynamic responses following the creation of a murine arteriovenous fistula. Am. J. Physiol Renal Physiol. 301 (4), F845-F851 (2011).
  13. Wong, C. Y., et al. Elastin is a key regulator of outward remodeling in arteriovenous fistulas. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 49 (4), 480-486 (2015).
  14. Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
  15. Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
  16. Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
  17. Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

小鼠动静脉瘘模型手术操作细节血管重塑分析内膜增生研究静脉流出道转基因动物应用组织学检查通畅性评估近红外荧光成像
一种新型的小鼠动静脉瘘衰竭模型：手术步骤详解
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。