我们展示了一种将培养细胞移植至早期小鼠胚胎特定部位的方法，以确定其 体内 潜力。我们还介绍了一种优化的电穿孔方法，该方法使用已知直径的玻璃毛细管，可将外源DNA精确导入胚胎中的少数细胞。
本文内容
摘要
摘要
小鼠早期胚胎的操作与培养是一项强大但尚未被充分应用的技术，可显著提升该模型系统的研究价值。相比之下，细胞培养已在发育生物学研究中得到广泛应用。然而，有必要确定 体外 培养的细胞真实地代表 体内 细胞类型。将细胞移植到胚胎中，随后评估其在发育过程中的贡献，是确定细胞潜能的一种有效方法。 体外 培养的细胞。在本研究中，我们描述了一种将细胞移植至早期着床后小鼠胚胎特定部位的方法，随后 离体 培养。我们还介绍了一种优化的电穿孔方法，该方法使用已知直径的玻璃毛细管，可精确定位并调控接受外源DNA的细胞数量，同时实现高效的转染效率和较低的细胞死亡率。这些技术无需任何特殊设备，使得对小鼠原肠胚形成期及早期器官发生期胚胎进行实验操作成为可能，从而能够在培养的细胞亚群中分析细胞命运的决定过程以及遗传操作的影响 原位 细胞分化
引言
细胞培养已广泛应用于发育生物学研究。小鼠胚胎干细胞（ESCs）和上胚层干细胞（EpiSCs）可分化为所有三个胚层 体外 并且是研究早期哺乳动物胚胎发生过程中细胞分化的有用模型。这些细胞系的建立为相关研究开辟了新的机遇 体外 操控和深入研究早期胚胎模式形成过程中局部信号事件及转录网络的运作机制。然而，仍需明确确定相关问题 体内 培养过程中所进行的任何操作的相关性。 体内 通过将植入前胚胎来源的小鼠胚胎干细胞重新导入植入前胚胎（桑葚胚或囊胚）中，对其潜能进行了评估1然而，代表植入后胚胎上胚层细胞的上胚层干细胞（EpiSCs）无法有效整合到植入前胚胎中2,3我们先前的研究结果表明，当上胚层干细胞（EpiSCs）被移植到着床后胚胎中时，能够高效地形成嵌合体并贡献于所有三个胚层。4因此，评估的最佳方法是 体外 培养细胞的关键是将其引入相应的环境 体内.
电穿孔是一种广泛使用的方法，用于将外源分子导入靶细胞中，适用于 在体 和 体外 实验。电能可在细胞膜上产生大量孔隙，从而使外源脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）进入细胞。该技术面临的主要挑战之一是，在保持最佳细胞活力的同时实现高效的电转染效率 5,6在胚胎组织中进行核酸电穿孔时，最常使用镀金电极，可实现对较广空间范围内细胞的靶向。7-9为了实现更局部化的基因转导，已采用针状电极以产生局灶性电场。10,11采用该方法，作者发现电穿孔后约有30–60个细胞摄取了DNA构建体11然而，使用固定宽度电极似乎仍难以精确调控电穿孔细胞的数量。毛细管电穿孔技术已被用于向单个细胞递送质粒12-14然而，该技术尚未被用于在体外对胚胎进行质粒电穿孔。最近，有研究报道了一种微型装置，可对早期着床后小鼠胚胎中少数远端内脏内胚层细胞（少于4个细胞）进行局部电穿孔15然而，目前尚不清楚该装置是否能有效靶向外胚层和中胚层 离体.
在本研究中，我们描述了两种评估植入后早期胚胎细胞功能和基因功能的全新方法。我们首先展示了如何进行移植 体外 将培养的细胞植入小鼠早期胚胎的特定部位，以评估其 体内 潜能。移植细胞及其后代（均通过一种遗传标记进行标记）的整合，例如，一种绿色荧光蛋白（GFP），可通过组织特异性蛋白的免疫染色进一步检测4其次，我们描述了一种通过电穿孔将DNA精确递送至胚胎局部区域的改进方法。与使用针状电极不同，我们将一根细金属丝插入尖端极细的玻璃毛细管内，并证明该改进方法能够以高效率将DNA递送至少量细胞，同时显著减少细胞死亡。此外，我们还表明，通过使用不同开口尺寸的玻璃毛细管，可调控被电穿孔的细胞数量。因此，我们认为该方法在研究涉及少量细胞的早期胚胎模式形成过程中具有重要应用价值。
方案
所有动物实验均按照英国国内事务部《1986年动物（科学程序）法案》中规定的法规进行，项目许可证编号为60/4435。为获取特定发育阶段的胚胎，设置了定时交配，以发现阴道栓当天中午定为胚胎发育第（E）0.5天。
1. 分离E7.5或E8.5植入后胚胎 离体 培养
- 通过颈椎脱位法处死怀孕的雌性小鼠。
- 使用剪刀分离子宫，用镊子夹住并置于盛有 M2 培养基的 30 mm 培养皿中。
- 用两把精细镊子小心撕开肌层。
- 剥离蜕膜，注意不要刺破胚外腔。
- 用镊子夹住Reichert膜，并缓慢将其从胚胎上分离，以去除Reichert膜。
- 在解剖体视显微镜下检查胚胎，确保卵黄囊、羊膜和胚外体腔锥完整无损。
- 用移液器将胚胎转移至盛有新鲜M2培养基的洁净培养皿中，并放置在冰上的30 mm塑料培养皿盖（“冰平台”）上，使胚胎部分冷却。
- 如有需要，可将胚胎置于冰平台上的M2培养基中保存最多1.5小时，e.g.，在配制培养基或于室温下处理少量（约3–4枚）胚胎时。
注意：啮齿类动物胚胎的获取与解剖方法此前已有详细描述7,8,16。
2. 准备胚胎培养基
- 取商品化大鼠血清（规格参见 Glanville-Jones et al.13）或根据 Copp 与 Cockroft16 方法自制的大鼠血清，新鲜解冻；将血清在 56 ˚C 下热灭活 30 分钟 ，并以 1 ml 分装于 -80 ˚C 冻存
注意：商品化大鼠血清适用于 24–36 小时的培养周期，但根据我们的经验，自制血清在长达 48 小时的培养周期中表现更优。 - 现配过量（例如，10 ml）的定义补充液，包含格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、2 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠。
- 根据拟培养各阶段胚胎的数量，计算所需培养基的体积（见第 3 节）。将大鼠血清与定义补充液混合，配制成 50% 培养基（1:1 (v/v) 大鼠血清 : 定义补充液）或 75% 培养基（3:1 (v/v) 大鼠血清 : 定义补充液）。
- 将胚胎培养基经 0.45 µm 滤器过滤，并添加 10,000 I.U./ml 青霉素和 10 µg/ml 链霉素。
注意：ex vivo 培养期间，胚胎发育依赖于新鲜解冻的 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠溶液。
3. 离体 不同胚胎发育阶段的培养条件
- 对于E7.5胚胎：使用4孔板在含有5% CO₂的培养箱中进行静态培养2 在37℃空气中 ˚在50%培养基中，每孔培养不超过两个胚胎，1 ml/孔，37°C培养24小时。
- 对于E8.5胚胎：使用滚筒培养装置8 以35转/分钟旋转，同时持续通入含5% CO的气体2 在37℃空气中 ˚C 培养 24 小时（每枚胚胎加入 1 ml 50% 培养基）。
- 对于E9.5胚胎：使用转速为35转/分钟并通入含5% CO的气体的滚筒培养装置2，40% O2 55% N2 37℃ ˚37°C 下培养 24 小时（每枚胚胎加入 1 ml 75% 培养基）。
注意：在处死小鼠后3小时内培养胚胎，因为M2中长时间孵育会对胚胎发育产生不利影响。参见Copp和Cockroft16 方法 离体 胚胎培养
4. 将培养细胞移植至 E7.5 或 E8.5 小鼠胚胎
- 使用20-200 µl移液枪头从6孔培养板上物理刮取普遍表达GFP的EpiSCs，并将其放入含有胚胎的30 mm培养皿中
注意：为了将细胞团块植入胚胎，应通过物理刮取而非胰酶消化的方式获取细胞。 - 将手工拉制的移植毛细管连接到吸管管路上，制成口控移液装置。
- 轻柔地用口吸使一个或多个大小>20个细胞的细胞团块进入移植毛细管中。
- 轻轻吹出细胞，使较大的团块部分分散。
- 选择一个含有约10-20个细胞的团块，再次吸入移植毛细管中，并使其靠近毛细管开口处。注意避免反复将细胞团块推入和抽出毛细管，以防其破碎成更小的片段。
- 用一对镊子轻轻固定胚胎，将移植毛细管插入目标区域以形成开口。
- 轻柔地将细胞团块从移植毛细管中推出，使一段较短的10-20个细胞链滞留在胚胎内部。
- 根据所需数量重复进行胚胎移植操作。为方便起见，建议每次处理3-4个胚胎为一批。
- 将胚胎保留在同一M2培养基培养皿中，使用配备相机的荧光体视显微镜对移植后的胚胎进行成像，成像时间应尽可能缩短，以避免胚胎暴露于过量的光照和热量中。
注意：成像时间需根据实际情况确定，因其取决于相机和显微镜的具体参数，以及荧光染料的性质和荧光强度。 - 成像后立即用移液巴斯德管将胚胎连同极少量M2培养基转移至预先平衡的培养介质中（见第3节）。
注意：移植后应仔细检查胚胎形态，仅对结构完整的胚胎进行后续培养。
5. 手工制备电穿孔材料和仪器装置（电穿孔实验前需提前准备以下物品）：
- 用于DNA注射的移液管：使用水平显微移液管拉制仪制备DNA注射用移液管。注射移液管应具有细小的尖端，开口直径小于10 µm，以避免向胚胎腔内注射DNA时造成组织损伤。
- 用于玻璃毛细管电穿孔：使用微加工仪将DNA注射移液管的开口切割至内径为20或30 µm。为避免毛细管在电穿孔过程中接触胚胎时造成细胞损伤，玻璃毛细管的尖端必须整齐切割，不得带有锋利或破碎的边缘。
- 用于手工制作的毛细管电极（阳极）（图1）：将直径为0.2 mm的铂丝插入具有固定开口（直径20或30 µm）的电穿孔玻璃毛细管中，以聚焦电流并将质粒DNA递送至胚胎中的特定小区域。
- 用于手工制作的L形电极（阴极）（图1）：将直径为0.2 mm的铂丝弯成“L”形，其中“L”的水平部分长度约为1 mm。
- 将每个铂电极连接至一根细的绝缘导线，并插入由绝缘胶带包裹的微注射针持器中。
- 将针持器安装在标准显微操作仪的持器上。
- 按照图1所示连接电路：将毛细管电极连接至电源的阳极；将L形电极连接至万用表的阳极；将万用表的阴极连接至电源的阴极。
6. E7.5 或 E8.5 小鼠胚胎的电穿孔
- 将电穿孔玻璃毛细管中加入 PBS，液面距管口 1-2 mm，然后将直形铂电极（阳极）插入玻璃毛细管中，直至到达毛细管底部。
- 将 L 形电极（阴极）固定在盛有 PBS 的 30 mm 培养皿表面。
- 将胚胎从 M2 培养基转移至盛有 PBS 的电穿孔培养皿中。
- 将注射针从外侧上胚层插入胚胎的羊膜腔内。使用气动微量泵，将 DNA 溶液（pCAG-Cre:GFP 或 pCAG-GFP，1-1.5 µg/ml，含 0.01% 绿色食用染料）注入腔内，直至完全充满。对于 E7.5-E8.5 胚胎，每个胚胎所需 DNA 溶液体积少于 5 µl。以绿色染料作为指示，注意避免胚胎破裂。
- 小心地将胚胎置于两个电极之间，并移动毛细管电极至需递送 DNA 的精确位置。
注意：胚胎的朝向取决于 DNA 电穿孔的目标区域。 - 使用 200 伏特（V）进行 6 次脉冲，每次持续 50 ms，脉冲间隔为 1 秒，对胚胎进行电穿孔。
- 电穿孔后立即将胚胎转移至预平衡的培养基中。如需，可对下一个胚胎重复该过程。
注意：将培养基加入无菌容器中，并置于培养箱内以预先平衡培养基。 - 为在培养 2 小时后检测电穿孔细胞，使用移液吸头将胚胎转移至盛有 M2 培养基的洁净 30 mm 培养皿中。使用荧光体视显微镜，按照步骤 5.9 的方法对胚胎进行成像。
- 成像后立即使用移液吸头将胚胎重新转移回培养环境中。
- 为检测电穿孔导致的死亡细胞，可在电穿孔后 2 小时，于 37 ˚C 条件下用远红光细胞膜不透过性核染料（1:200 稀释于胚胎培养基中）对胚胎染色 10 分钟 （可选）
- 为计数电穿孔细胞，可在 4 ˚C 条件下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定胚胎 2-4 小时，使用紫外或远红荧光核复染剂对细胞核染色，并使用共聚焦显微镜对胚胎成像（可选）。
注意：胚胎在 PBS 中停留过久会对其生长产生不利影响。因此，应尽量缩短每个胚胎的电穿孔操作时间（<5 分钟/胚胎）。
结果
嫁接
普遍表达EGFP的EpiSCs（r04-GFP，源自E6.5上胚层；C2，源自 体外 来自mESCs）4 从培养皿中手动刮取后，移植至E7.5胚胎的不同部位（图 2A）。胚胎被培养 离体 24小时后进行分析。通过荧光显微镜评估供体细胞的分布情况。如果供体细胞成功整合，它们将增殖，其子代细胞会在宿主胚胎内分散图2B）。据观察，含有10-16个细胞的移植物能够高效地整合到宿主胚胎中（图2A和2B），然而，移植更多细胞并不会产生更好的嵌合率。相反，移植的细胞会形成未整合的细胞团块（图2C和2D).
电穿孔
为了评估电穿孔系统的效率，我们将表达GFP的质粒（pCAG-GFP和pCAG-Cre:GFP）递送至胚胎的特定部位。与先前的研究一致11，在电穿孔后1–2小时即可检测到GFP+细胞（图2E和2G）。当在晚期原条阶段胚胎的远端上胚层细胞进行电穿孔时，经标记的细胞在体外培养24小时后贡献于神经外胚层（图2E和2F）。该结果与已知的原肠胚形成阶段胚胎上胚层细胞的命运图谱高度吻合17。类似地，当在E8.5（2–5个体节）时期的原条区域电穿孔GFP表达质粒时，GFP+细胞贡献于轴旁中胚层（图2G和2H），这与晚期原条区域已知的命运图谱一致18。此外，我们观察到电穿孔的细胞对三个胚层均有贡献（图2I–K），表明电穿孔操作并未影响细胞在体内的正常行为in vivo。然而，我们也注意到，尽管靶向的是E7.5时期的上胚层或E8.5时期的原条细胞，部分内胚层细胞也被成功电穿孔（图3C和表1）。
使用毛细管电极的主要优势之一是可以通过改变其开口直径来控制电穿孔细胞的数量。为了确定电穿孔的细胞数量，我们在电穿孔后2小时固定胚胎，并在共聚焦显微镜下对完整胚胎进行成像。GFP+细胞的数量通过手动计数共聚焦z轴层叠图像获得。表1显示，对于同一发育阶段，将玻璃毛细管的开口尺寸从20 µm增加到30 µm，可使更多细胞摄取DNA。当在同一开口尺寸下比较不同阶段（E7.5与E8.5）时，发现E8.5阶段电穿孔的细胞数量更多。这一效应可能是由于E8.5时羊膜腔内DNA浓度更高所致。由于DNA溶液与绿色食用染料混合，我们可以通过绿色染色来评估羊膜腔内的DNA浓度。在显微镜下可以明显观察到，与E8.5胚胎相比，E7.5胚胎羊膜腔内的绿色在DNA注射后明显更浅。尽管向E7.5和E8.5胚胎注射了相同浓度的DNA溶液，但由于E8.5胚胎体积更大，需要更多的DNA溶液才能完全充满其羊膜腔。在拔出注射针后，DNA溶液总会从羊膜腔发生一定程度的泄漏；而由于早期胚胎的穿刺孔相对于其羊膜腔尺寸更大，E7.5胚胎的DNA溶液泄漏比例可能高于E8.5胚胎，从而导致DNA浓度更低。转染细胞数量的差异也可能源于不同发育阶段细胞的直径或诱导跨膜电压（ITV）阈值不同。
电穿孔的一个缺点是伴随的细胞死亡。与传统的镀金电极或针状电极类似，使用毛细管电极进行电穿孔也会导致细胞死亡。电穿孔后，靶向区域的颜色比邻近区域更深（图3A和3B），表明该区域必然发生了一定程度的细胞死亡。为了进一步确定电穿孔操作所导致的死亡细胞数量，将胚胎用一种荧光的、不能透过细胞膜的核染料进行染色。死细胞的细胞核被一种不能透过细胞膜的远红荧光染料标记。染色结果证实，这种毛细管电穿孔技术仅在电穿孔位点附近造成少量细胞死亡（图3D和表1）。
我们注意到，尽管在电穿孔位点出现死亡细胞，但GFP+细胞与死亡细胞在空间上几乎互不重叠（图3E和3F）。此外，当在E8.5时期对尾侧外胚层使用pCAG-GFP质粒并以20 µm开口的玻璃毛细管进行电穿孔后，体外培养48小时可检测到大量GFP+细胞（图3G和3H）。综上所述，这些结果表明，电穿孔后2小时所检测到的大多数GFP+细胞在后续培养过程中仍具有活力。
我们对GFP的数量进行了评分+ 24 小时后的细胞 离体 培养。在E7.5时，使用毛细管开口为六枚胚胎电穿孔导入pCAG-GFP。 20µm 直径。107±31（均值 ± 标准差）GFP+ 细胞/胚胎被检测到。由于在培养开始时（2小时），每个胚胎平均有9个细胞被电穿孔表1），这表明电穿孔的细胞在2小时内经历了3-4次分裂。在E7.5至E8.5胚胎中，除腹侧结节细胞外，所有其他细胞的平均倍增时间约为6-7小时19,20这表明电穿孔操作不会妨碍细胞的正常生长。
图 1. 显示电穿孔装置的电路图。 含有 DNA 溶液的胚胎置于两个电极之间，其羊膜腔内含有 DNA 溶液。通过方波脉冲发生器（电源）提供设定参数的电流。将万用表串联接入电路，用于检测通过胚胎的电流。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 嫁接或电穿孔细胞在宿主胚胎中的分布。 (A-H) 整胚亮场图像（灰度）上叠加的 GFP 荧光图像（绿色）。(A) 将 10-16 个 GFP+ EpiSCs 嫁接到晚期条纹期胚胎的远端区域。(C) 将较大团块的 GFP+ EpiSCs 嫁接到中期条纹期胚胎的远端区域。(B 和 D) 培养 24 小时后，宿主胚胎中来源于 EpiSCs 的细胞（绿色）分布情况（对应 A 和 C 图）。(B) GFP+ 细胞在宿主胚胎中分散分布，提示供体细胞已正确整合。(D) 嫁接较大细胞团块导致在宿主胚胎中形成未整合的细胞团块。(E-K) 将 pCAG-Cre:GFP 质粒电穿孔至野生型胚胎的特定区域。对早期芽胚阶段胚胎的远端区域进行电穿孔 (E)，或对 2-5 体节期胚胎的原条区域进行电穿孔 (G)，操作 2 小时后在这些区域可见 GFP+ 细胞。(F 和 H) 培养 24 小时后，宿主胚胎中 GFP+ 细胞的分布情况显示，电穿孔细胞可贡献于神经外胚层（黑箭头）(F) 和轴旁中胚层 (白箭头)(H)。(I-K) 对 GFP+ 细胞进行 DAB 免疫组化染色，显示电穿孔细胞在培养 24 小时后可分化为神经外胚层 (I)、中胚层 (J) 和内胚层 (J 和 K)。比例尺 (A-H) = 250 µm；比例尺 (I-K) = 100 µm。注：图 1A 和 1B 重印自我们先前的出版物4。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. GFP的分布+ 电穿孔后胚胎中的活细胞与死细胞 （A-C） pCAG-Cre:GFP 质粒电转染至 E8.5（2-5 体节期）胚胎的尾侧外胚层细胞（毛细管开口尺寸： 20 µm). （A） 操作后2小时，与胚胎其他部分相比，靶向区域呈现较深的颜色（白色箭头）。插图显示了电穿孔区域的放大图像。 （B） 明场图像（灰度）与绿色荧光通道叠加，显示电穿孔的细胞（绿色）。 (C) 共聚焦z轴切片显示，当靶向尾侧外胚层细胞时，两个内胚层细胞（绿色）也吸收了质粒。细胞核显示为红色。 （D-F） pCAG-Cre:GFP 质粒通过电穿孔法转染至 E8.5 胚胎亨利结尾端区域（毛细管开口尺寸： 30 µm）。胚胎培养2小时。电穿孔细胞显示为绿色，死亡细胞显示为红色。 (D) 电穿孔区域包含GFP+ 细胞以及死亡细胞。白色框选区域进一步在共聚焦显微镜下进行分析。通过对z轴层扫图像进行人工计数，结果显示共有33个GFP+ 该区域有23个活细胞和23个死细胞。仅有两个细胞对两种荧光染料均呈阳性。 （E 和 F） D图白色方框区域共聚焦z轴切片的XYZ视图，显示GFP+ 活细胞与死细胞相互分离。细胞核呈蓝色。 （G 和 H） pCAG-Cre:GFP 质粒通过电穿孔导入 E8.5 胚胎尾侧外胚层的少数细胞中（毛细管开口尺寸： 20 µm）并在两小时后成像 (G) 和 48 (H) 小时 离体 培养说明：（H）胚胎经培养后被截成两段，移除头部和心脏区域。比例尺（A、B、D、G 和 H）= 250 µm；比例尺（C、E 和 F）= 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 毛细管开口直径 | 胚胎阶段 | 电穿孔效率：2小时后含有GFP+细胞的胚胎数 / 总电穿孔胚胎数（24或48小时培养后正常发育的GFP+胚胎数） | 每个胚胎中GFP+细胞的平均数量 ±标准差（n=检测胚胎数） | 每个胚胎中GFP+内胚层细胞数 ±标准差（n=检测胚胎数） |
| 20μm | E7.5 (LS-LB) | 7 / 9 (7) | 9±3 (n=4) | 4±2 (n=4) |
| 30μm | E7.5 (LS-LB) | 13 / 15 (12) | 17±2(n=4) | 6±1 (n=4) |
| 20μm | E8.5 (2-5体节) | 12 / 13 (10) | 21±4 (n=4) | 11±4 (n=4) |
| 30μm | E8.5 (2-5体节) | 2 / 2 (2) | 33和26 (n=2) | 14和16 (n=2) |
表1. 小鼠胚胎中pCAG-Cre:GFP质粒的电穿孔效率。
缩写：LS，晚期原条阶段；LB，晚期芽状阶段。胚胎分期依据Downs和Davies12
讨论
嫁接
细胞移植实验的关键步骤是将一串完整的细胞尽可能通过单次操作插入，以避免细胞团块破裂。该技术需要通过练习掌握口吸管的控制技巧。如果供体细胞在宿主体内整合良好，其衍生物将在胚胎中分散开来。为了进一步确定这些分散的供体来源细胞是否在宿主体内正常分化，可对胚胎切片进行免疫染色分析。如果供体细胞与宿主环境不相容，则可能无法检测到（因为细胞被胚胎排出）或者在培养后于胚胎内形成未整合的细胞团块。如果同时观察到分散的细胞和细胞团块，这可能表明移植的细胞数量过多，过量的供体细胞无法与周围的宿主细胞相互作用，从而导致团块形成。在此情况下，可进行额外的移植实验，减少移植细胞的数量。
细胞移植技术的主要局限性在于无法确定其完整的 体内 细胞的潜能，自小鼠以来 离体 超过48小时的培养尚未实现。然而，若结合超声引导下的细胞注射技术，或许可将体外培养的细胞转移至胚胎中 在子宫内综上所述，细胞移植实验在我们课题组已被广泛应用，并为我们提供了有关 体内 不同类型细胞的潜能4,21,22一种用于评估的通用技术 体内 潜力 体外 早期植入后胚胎中的培养细胞
电穿孔
尽管本研究仅证明了毛细管电穿孔技术靶向外胚层是高效的，但该技术也可有意地靶向其他胚层，例如内胚层细胞。毛细管电穿孔技术的关键步骤是尽量缩短每个胚胎的电穿孔时间（< 每个胚胎5分钟），因为PBS对早期小鼠胚胎而言非常不适宜。我们上述数据表明，在胚胎的大多数区域，电穿孔并不影响胚胎的生长发育。然而，在脊索中节（node）进行电穿孔会导致胚胎发育异常并引发其过早死亡。这可能是由于形成重要信号中心的细胞受到了损伤或死亡所致23。因此，使用该技术时必须避开这一区域。另一个需要注意的问题是，正如结果部分所述，尽管目标是外胚层或原条细胞，但部分内胚层细胞也被电穿孔。这可能是因为DNA通过外胚层上皮下方的间隙扩散至内胚层。内胚层由上皮细胞组成，根据我们的经验，这些细胞更易于摄取DNA。因此，在应用该技术进行命运图谱绘制时，明确最初摄取DNA的细胞类型至关重要。
还应注意，尽管使用本研究中所示的电穿孔参数可高效递送 pCAG-GFP 和 pCAG-Cre:GFP 质粒，但其他DNA载体的转染效率可能有所不同，需进行个体化优化。若发现质粒转染困难，可调整DNA浓度、电穿孔电压或脉冲次数。
综上所述，我们优化的毛细管电穿孔系统能够高效且可重复地将GFP或Cre:GFP质粒递送至胚胎中极少数细胞，同时细胞死亡程度较低。由于该方法无需昂贵或高度专业化的设备，因此在细胞示踪研究中具有重要用途，或可用于检测异位表达或条件性基因敲除在早期胚胎中的效应——前提是电穿孔操作在携带floxed条件性突变等位基因的胚胎中进行。因此，该电穿孔技术为在局部野生型胚胎环境中，以单细胞水平解析细胞内在因子的功能提供了有力的实验工具。
披露
作者声明不存在经济或其他利益冲突。
致谢
感谢Filip Wymeersch和Anestis Tsakiridis对本文手稿的评论，感谢SCRM动物实验中心工作人员在动物饲养方面的帮助，以及感谢Stuart Forbes教授提供免疫组织化学试剂。本研究工作得到了英国医学研究理事会（MRC）资助项目（编号：Mr/K011200/1）和中国国家留学基金委的支持
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 | Dumostar | T5390 | |
| 解剖体视显微镜 | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 带荧光功能的体视显微镜系统 | Nikon | AZ100 | |
| 带数码相机的倒置显微镜 | Olympus | Olympus BX61 | |
| 倒置共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| 低熔点琼脂糖 | Life Technologies | 16520-050 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30 mm 培养皿 | Fisher Scientific | 121V | |
| 4孔板 | Thermo scientific | 179820 | |
| M2培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life Technologies | 10010015 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 移液器 | NICHIRYO | Nichipet | |
| 吸头 | Greiner Bio One | 685280 | |
| 细胞培养箱 | SANYO | MCO-17AIC | |
| 滚筒式培养装置 | BTC Engineering | ||
| 0.45 µm 无菌注射器滤器µ | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| 格拉斯哥最低必需培养基（GMEM） | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Life Technologies | 11140050 | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| 丙酮酸钠溶液 | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| 青霉素-链霉素溶液（10,000 UI/mL） | Lonza | DE17-602E | |
| 便携式Meker燃烧器用气罐 | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| 带拉丝的薄壁硼硅酸盐毛细玻璃管，外径1.0 mm，内径0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| 校准微量毛细移液管用吸管组件 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| 火焰/布朗微电极拉制仪 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| 显微操作电极抛光仪 | De Fonbrune | BS030301 | |
| 气动皮升注射泵 | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader加样尖 | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830方波脉冲发生器 | BTX | 45-0002 | |
| 绿色食用染料 | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| 远红光、细胞膜不透性核染料 | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| 万用表 | Excel | XL830L | |
| 显微操作器 | Leitz | ||
| 直径0.2 mm的铂丝 | Agar Scientific | E404-2 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 山羊抗鸡IgY-HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| 液体DAB+底物显色系统 | Dako | K3467 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Life Technologies | D21490 | |
| 远红荧光核复染染料 | Life Technologies | T3605 |
参考文献
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