从腺病毒感染的正常人细胞中分离富含病毒复制区室的核内组分

摘要

我们提供了一种从腺病毒（Ad）感染的人类细胞中分离病毒复制区室（RC）的新策略。该方法代表了一种无细胞体系，有助于阐明调控病毒基因组复制与表达的分子机制，以及在复制区室处建立的病毒-宿主相互作用的调控机制。

摘要

腺病毒（Ad）感染人类细胞时，宿主细胞核会发生显著的重排，通过将病毒和细胞蛋白募集到病毒基因组占据的位点，形成核内微环境。这些位点被称为复制区室（replication compartments, RC），可视为病毒诱导形成的核内结构域，其中定位于此的病毒基因组会招募参与复制、转录及转录后加工过程的病毒和细胞蛋白。此外，参与抗病毒反应的细胞蛋白，如肿瘤抑制蛋白、DNA损伤反应（DDR）组分以及先天免疫反应因子，也会被共同募集至RC中。尽管RC似乎在促进高效且具有复制活性的病毒复制周期中发挥关键作用，但对其组成成分及相关活性的系统性分析仍尚未充分开展。为了便于研究腺病毒RC，以及可能具有类似特征的其他在细胞核内复制的DNA病毒的RC，我们改进了一种基于速度梯度的简单方法用于分离腺病毒RC，并建立了一个无细胞体系，可用于对这些病毒诱导的核内亚结构进行形态学、功能性和组成成分的研究，同时也有助于探讨其对宿主细胞相互作用的影响。

引言

腺病毒含有双链DNA基因组，其在感染细胞的细胞核内进行复制。当病毒DNA进入细胞核后，会定位于PML核体附近¹。在病毒早期基因表达之后，细胞核结构发生显著重排，诱导形成称为病毒复制区室（Viral Replication Compartments, RC）的病毒微环境²。由于腺病毒（Ad）的RC是病毒基因组复制和晚期基因表达的发生位点，因此它为募集参与这些过程所需的所有病毒和细胞因子提供了特定环境。有趣的是，多种参与细胞抗病毒反应的细胞蛋白，如DNA损伤应答、天然免疫应答以及肿瘤抑制相关蛋白，均被招募至这些病毒位点²。因此，腺病毒RC可被视为调控枢纽，在促进高效病毒复制的同时，协调调控细胞的抗病毒反应，表明这些结构对于理解病毒与宿主细胞相互作用至关重要。然而，关于RC形成的分子机制、其组成成分及相关生物学活性，目前仍知之甚少。

与在细胞质中复制的病毒所形成的复制中心（RC）不同，腺病毒及其他在细胞核内复制的DNA病毒的复制中心不与膜结构相关联³。此外，这些病毒诱导形成的结构很可能完全由蛋白质和核酸组成。利用RNA病毒感染细胞后形成的复制中心（通常称为病毒工厂）位于细胞质中且具有膜结合特性，研究人员已据此成功分离这些结构，从而实现了对其形态学、功能及生物化学特性的详细表征⁴。

据我们所知，尚未有分离出细胞核内病毒复....

方案

1. HFF 细胞培养与腺病毒感染

1. 在HEK-293细胞单层中扩增Ad5野生型病毒，并如前所述在HFF细胞上以荧光形成单位（FFU）测定病毒滴度⁸。
2. 在37 ºC、5% CO₂的湿润培养箱中，将人包皮成纤维细胞（HFF）接种于无菌的100 mm培养皿中，每皿加入10 ml DMEM/10%胎牛血清（FBS）进行培养。使用Neubauer计数板对四个16格区域的细胞进行计数，以确定细胞数量。每毫升细胞数通过计算四个16格区域的平均细胞数并乘以10⁴得到。对于步骤1.3中包含的每个感染后时间点，使用1 × 10⁷个HFF细胞。
3. 在100 mm组织培养皿中，使用每皿1 ml Ad5（溶于DMEM）以每细胞30个感染形成单位（Focus Forming Unit，FFU）的感染复数（MOI）对HFF细胞进行模拟感染或腺病毒5型（Ad5）野生型（WT）（H5pg4100⁸）感染。在37 ºC、5% CO₂的湿润细胞培养箱中孵育2小时，每隔15分钟轻轻摇动培养皿，以确保病毒接种物在细胞表面均匀分布。孵育结束后，移除培养基，加入含10% FBS的新鲜DMEM，在37 ^ºC、5% CO₂的湿润细胞培养箱中继续孵育16、24或36小时。随后进行步骤2.1。

结果

由于病毒复制室（RC）是由蛋白质和核酸组成的核内病毒诱导结构，与其他核区室相似，已证明可根据其生物化学特性通过速度梯度法进行分离。分离方案中的关键步骤如图1所示。每一步均需通过明场显微镜监测样品，以确保不同亚细胞组分的完整性。例如，在细胞膨胀过程中，需标准化低渗缓冲液中的孵育时间，以膨胀细胞质但避免损伤细胞核。细胞匀浆后，应获得不含细胞质成分（包括内质网膜）的完整细胞核。此外，超声处理时间也需标准化，以确保破裂所有细胞的核膜，同时不破坏复制室（RC）的结构。

在获得核内组分后，需要包括关键对照以确定其关联性与富集程度 真正 RCf 中的复制中心（RC）标记物。腺病毒复制中心通常通过免疫荧光法使用针对病毒 E2A-72K 蛋白（DBP）的抗体在感染细胞中进行可视化。DBP 是一种直接参与病毒基因组复制的病毒蛋白；因此，DBP 在 RCf 富集颗粒中的存在表明该病毒蛋白与分离颗粒之间存在直接关联，如图所示。 图1此外，通过Western Blot在RCf中检测到DBP，证实了该蛋白与分离的RC存在关联.......

讨论

为了阐明病毒感染调控细胞活动的分子机制，了解复制中心（RC）的组成及其相关活性将具有重要意义。因此，为了对复制中心进行详细分析，我们建立了一种无细胞体系，利用病毒诱导结构的大小和生化组成特性，通过基于蔗糖垫速度梯度的简单方法，分离富含复制中心的核内组分。该实验流程中需根据所用细胞类型进行优化的关键步骤包括：i）标准化细胞膨胀时间，以避免细胞核破裂；ii）形成良好的蔗糖梯度，以确保各组分能够有效分离；iii）在整个操作过程中通过明场显微镜持续监测样品状态；iv）超声处理的时间和强度应适当，以确保所有细胞核被裂解，同时复制中心不被破坏；v）所有分步分离操作均需在冰上进行，以防止核结构被破坏。

该技术可能遇到或可预见的局限性包括：i）核仁以及可能其他具有相似尺寸和生化组成的核内结构或区域会在复制区室（RC）组分中共同被分离，导致复制区室相对于其他类似核结构的相对丰度因病毒种类、细胞类型及感染后时间的不同而有所变化；ii）随着病毒复制周期的推进，不仅复制区室的大小和组成可能发生改变，其颗粒的致密程度也可能发生变化，因此有必要设计实验以确定感染后不同时间点复制区室颗粒的详细超微结构变化，从而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	12100-046	使用前在37 ºC水浴中预热
胎牛血清	Gibco	12484-028
蔗糖，超纯级	Research Organics	0928S	配制2.55 M的储存液，4 ºC保存
玻璃匀浆器（Dounce homogenizer）	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 超声波清洗仪	Branson	Z769533 SIGMA	使用前开启15分钟
山羊抗小鼠IgG1二抗，Alexa Fluor 488标记	Life Technologies	A-21121	以PBS按1:2,000比例稀释后使用
硅烷处理载玻片	Sigma	S4651-72EA	在超净工作台内打开
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Pierce ThermoScientific	34080