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方法文章

从腺病毒感染的正常人细胞中分离富含病毒复制区室的核内组分

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DOI：

10.3791/53296

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2015年11月12日

 , 
1Centro de Investigación en Dinámica Celular, Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, 2Instituto de Biotecnologìa, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

我们提供了一种从腺病毒（Ad）感染的人类细胞中分离病毒复制区室（RC）的新策略。该方法代表了一种无细胞体系，有助于阐明调控病毒基因组复制与表达的分子机制，以及在复制区室处建立的病毒-宿主相互作用的调控机制。

摘要

腺病毒（Ad）感染人类细胞时，宿主细胞核会发生显著的重排，通过将病毒和细胞蛋白募集到病毒基因组占据的位点，形成核内微环境。这些位点被称为复制区室（replication compartments, RC），可视为病毒诱导形成的核内结构域，其中定位于此的病毒基因组会招募参与复制、转录及转录后加工过程的病毒和细胞蛋白。此外，参与抗病毒反应的细胞蛋白，如肿瘤抑制蛋白、DNA损伤反应（DDR）组分以及先天免疫反应因子，也会被共同募集至RC中。尽管RC似乎在促进高效且具有复制活性的病毒复制周期中发挥关键作用，但对其组成成分及相关活性的系统性分析仍尚未充分开展。为了便于研究腺病毒RC，以及可能具有类似特征的其他在细胞核内复制的DNA病毒的RC，我们改进了一种基于速度梯度的简单方法用于分离腺病毒RC，并建立了一个无细胞体系，可用于对这些病毒诱导的核内亚结构进行形态学、功能性和组成成分的研究，同时也有助于探讨其对宿主细胞相互作用的影响。

引言

腺病毒含有双链DNA基因组，其在感染细胞的细胞核内进行复制。当病毒DNA进入细胞核后，会定位于PML核体附近1。在病毒早期基因表达之后，细胞核结构发生显著重排，诱导形成称为病毒复制区室（Viral Replication Compartments, RC）的病毒微环境2。由于腺病毒（Ad）的RC是病毒基因组复制和晚期基因表达的发生位点，因此它为募集参与这些过程所需的所有病毒和细胞因子提供了特定环境。有趣的是，多种参与细胞抗病毒反应的细胞蛋白，如DNA损伤应答、天然免疫应答以及肿瘤抑制相关蛋白，均被招募至这些病毒位点2。因此，腺病毒RC可被视为调控枢纽，在促进高效病毒复制的同时，协调调控细胞的抗病毒反应，表明这些结构对于理解病毒与宿主细胞相互作用至关重要。然而，关于RC形成的分子机制、其组成成分及相关生物学活性，目前仍知之甚少。

与在细胞质中复制的病毒所形成的复制中心（RC）不同，腺病毒及其他在细胞核内复制的DNA病毒的复制中心不与膜结构相关联3。此外，这些病毒诱导形成的结构很可能完全由蛋白质和核酸组成。利用RNA病毒感染细胞后形成的复制中心（通常称为病毒工厂）位于细胞质中且具有膜结合特性，研究人员已据此成功分离这些结构，从而实现了对其形态学、功能及生物化学特性的详细表征4。

据我们所知，尚未有分离出细胞核内病毒复制中心（RC）的报道，这可能是由于细胞核结构的复杂性以及缺乏细胞内膜系统，从而难以实现其分离。目前对RC的研究主要依赖于免疫荧光显微镜、荧光原位杂交（FISH）和透射电子显微镜技术。然而，尽管分离亚核结构存在固有的困难，其他一些核内区域如核仁和卡哈尔体此前已被成功分离5,6。由于核仁和RC均由蛋白质和核酸组成，且直径均在0.5 - 5 µm之间，我们推测RC也应具备可分离性。因此，为了更精确地表征RC相关的分子组成及其功能，我们建立了一种新颖的方法，用于分离富含RC的亚核组分。为此，我们采用速度梯度离心和蔗糖垫层等方法制备亚核组分，其操作类似于分离核仁7或其他核内结构6的流程，并建立了一个无细胞体系，可用于研究RC的分子组成及相关生物学活性。该技术将有助于深入理解病毒与宿主细胞之间的相互作用，是一种强有力的工具，也有望推动对其他在细胞核内复制并形成与腺病毒感染细胞中相似尺寸复制区室的病毒（如疱疹病毒、乳头瘤病毒或多瘤病毒）的RC进行深入分析。

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方案

1. HFF 细胞培养与腺病毒感染

  1. 在HEK-293细胞单层中扩增Ad5野生型病毒，并如前所述在HFF细胞上以荧光形成单位（FFU）测定病毒滴度8。
  2. 在37 ºC、5% CO2的湿润培养箱中，将人包皮成纤维细胞（HFF）接种于无菌的100 mm培养皿中，每皿加入10 ml DMEM/10%胎牛血清（FBS）进行培养。使用Neubauer计数板对四个16格区域的细胞进行计数，以确定细胞数量。每毫升细胞数通过计算四个16格区域的平均细胞数并乘以104得到。对于步骤1.3中包含的每个感染后时间点，使用1 × 107个HFF细胞。
  3. 在100 mm组织培养皿中，使用每皿1 ml Ad5（溶于DMEM）以每细胞30个感染形成单位（Focus Forming Unit，FFU）的感染复数（MOI）对HFF细胞进行模拟感染或腺病毒5型（Ad5）野生型（WT）（H5pg41008）感染。在37 ºC、5% CO2的湿润细胞培养箱中孵育2小时，每隔15分钟轻轻摇动培养皿，以确保病毒接种物在细胞表面均匀分布。孵育结束后，移除培养基，加入含10% FBS的新鲜DMEM，在37 ºC、5% CO2的湿润细胞培养箱中继续孵育16、24或36小时。随后进行步骤2.1。

2. 富集腺病毒复制中心的亚细胞核组分的制备

  1. 使用细胞刮刀收集经Ad5感染或模拟感染的HFF细胞，并将细胞收集至无菌离心管中。按照步骤1.2的方法确定细胞数量。根据步骤1.3中指定的感染后时间点，每次使用1 × 107个细胞。
  2. 在4 ºC条件下，以220 × g离心5分钟。
  3. 用预冷的PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH2PO4）重悬细胞沉淀。每次用5 ml预冷PBS洗涤细胞沉淀，共洗涤3次。具体操作为：在4 ºC条件下以220 × g离心5分钟，弃去上清液（SN），并通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。
  4. 为破坏细胞膜，将细胞沉淀重悬于700 µl预冷的低渗缓冲液（10 mM HEPES pH 7.9、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM DTT、20 µg/ml苯甲基磺酰氟（PMSF），以及包含10 µg/ml牛胰蛋白酶抑制剂、10 µg/ml胃蛋白酶抑制剂A和10 µg/ml N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸醛的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂混合物）中，在冰上孵育3小时使细胞充分膨胀。
  5. 使用带有松配合A型聚四氟乙烯杵的匀浆器裂解细胞。进行80次Dounce匀浆，每20次后通过明场显微镜观察样品，确保所有细胞已被裂解，但细胞核未受损或破裂。
  6. 将细胞匀浆液在4 ºC条件下以300 × g离心5分钟。将上清液作为细胞质组分收集于离心管中，并于-20 ºC保存。
  7. 为去除细胞核中的细胞碎片，将沉淀重悬于750 µl溶液1（S1）（0.25 M蔗糖、10 mM MgCl2、20 µg/ml PMSF，以及包含10 µg/ml牛胰蛋白酶抑制剂、10 µg/ml胃蛋白酶抑制剂A和10 µg/ml N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸醛的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂混合物）中，然后将其小心铺加在等体积的溶液2（S2）（0.35 M蔗糖、0.5 mM MgCl2、20 µg/ml PMSF，以及包含10 µg/ml牛胰蛋白酶抑制剂、10 µg/ml胃蛋白酶抑制剂A和10 µg/ml N-乙酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸醛的蛋白酶抑制剂混合物）之上。在4 ºC条件下以1,400 × g离心5分钟。
  8. 使用微量移液器弃去上清液，注意避免扰动沉淀。
  9. 将含有分离细胞核的沉淀重悬于750 µl S2溶液中。
  10. 为分离富含腺病毒复制中心（RC）的核内组分（RCf），将重悬的细胞核置于超声水浴中进行超声处理，采用两次5分钟脉冲，或直至明场显微镜下观察到所有细胞核均被裂解为止。根据需要在超声水浴中加入冰块，以确保样品温度维持在4 °C或以下。
  11. 将超声处理后的细胞核样品小心铺加在等体积的溶液3（S3）（0.88 M蔗糖、0.5 mM MgCl2）之上，在4 ºC条件下以3,000 × g离心10分钟。将1.5 ml上清液作为核质组分（Npl）于-70 ºC保存；将沉淀重悬于700 µl S2溶液中，并作为RCf组分于-70 ºC保存。

3. RCf 的 Western 印迹分析

注意：进行 Npl 和 RCf 组分的 Western 印迹分析时，从步骤 2.11 获得的总体积中分别保留 640 µl 用于 Npl，300 µl 用于 RCf。

  1. 将每种核亚组分各15 µl与2倍Laemmli缓冲液（4% SDS、20%甘油、10% 2-巯基乙醇、0.004%溴酚蓝、0.125 M Tris HCl pH 6.8）混合，在95 ºC下煮沸5分钟。将样品上样至10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）变性凝胶中，在20毫安（mA）条件下电泳分离1.5小时。
  2. 通过电转印法，在400 mA条件下将蛋白质转移1.5小时至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  3. 用含3%脱脂奶粉的PBS溶液在室温下封闭膜2小时。
  4. 在4 ºC下用针对病毒E2A DNA结合蛋白（B6-89）的一抗，按1:500稀释于PBS/0.3%脱脂奶粉中孵育过夜 。
  5. 用PBS/0.1%吐温20溶液洗涤膜3次，每次10分钟。
  6. 将膜在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的鼠抗IgG二抗按1:10,000稀释于PBS中孵育2小时。
  7. 用PBS/0.1%吐温20溶液洗涤膜3次，每次10分钟。
  8. 使用增强型化学发光试剂和X射线胶片显影膜。

4. RCf 中病毒 DNA 的检测

注意：从 Npl 和 RCf 组分中提取 DNA 时，分别使用步骤 2.11 中获得总体积的 210 µl（Npl）和 100 µl（RCf）。

  1. 将亚核组分与 1 mg/ml 蛋白酶 K 和 0.5% Tween 20 混合，在 55 ºC 下孵育 1 小时。
  2. 将样品在 95 °C 下孵育 10 分钟，以灭活蛋白酶 K。
  3. 在室温下以 20,000 × g 离心 2 分钟。
  4. 收集上清液。加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和等体积的异丙醇，在 4 °C 下过夜 沉淀 DNA。
  5. 在室温下以 20,000 × g 离心 10 分钟。
  6. 用微量移液器弃去上清液。用 70% 乙醇洗涤沉淀物，并在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 5 分钟。
  7. 将 DNA 重悬于 10 µl 的 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）中。
  8. 使用分光光度计在 260 nm 处测量光密度（OD）以定量 DNA。
  9. 为扩增病毒 DNA，从每个亚核组分中取 100 ng DNA，在 25 µl 反应体系中使用 Taq DNA 聚合酶进行标准 PCR 反应，引物用于扩增主要晚期转录单位内从核苷酸 7273 至核苷酸 7353（81 bp）的区域（正向引物：GAGCGAGGTGTGGGTGAGC；反向引物：GGATGCGACGACACTGACTTCA）。采用以下循环条件：95 ºC 初始变性 3 分钟，随后进行 20 个循环的扩增（95 ºC 变性 1 分钟，62 ºC 退火 1 分钟，72 ºC 延伸 30 秒），最后在 72 ºC 延伸 3 分钟。
  10. 将 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶中以 90 V 电泳。加入溴化乙锭至终浓度 0.5 µg/ml 染色，并观察 DNA 条带，以验证病毒 DNA 在 RCf 中的富集。操作溴化乙锭时需格外小心，务必始终佩戴手套，因该化合物为强效诱变剂。溴化乙锭的废弃应遵循机构相关规定。

5. RCf 中晚期病毒 mRNA 的检测

注意：从 Npl 和 RCf 组分中分离 RNA 时，从步骤 2.11 获得的总体积中分别取 640 µl 用于 Npl，300 µl 用于 RCf。

  1. 使用 Trizol 试剂，按照制造商说明书从核内组分中分离 RNA。将 RNA 重悬于 50 µl 的 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水中。
  2. 使用分光光度计通过测定 260 nm 处的 OD 值对 RNA 进行定量（可获得约 3 µg）。将 RNA 分装为 50 ng/µl，于 -70 ºC 保存。
  3. 通过在无逆转录酶（RT）的情况下进行对照 PCR 反应，检测纯化 RNA 是否存在 DNA 污染，使用 5 ng 总 RNA，并采用步骤 4.9 中描述的循环条件。
    1. 若无 DNA 污染，则不应产生扩增产物。若存在 DNA 污染，将样品与 10 U DNase I、10 U RNase 抑制剂、0.1 M Tris-HCl（pH 8.3）、0.5 M KCl 和 15 mM MgCl2 混合，37 ºC 孵育 30 分钟。随后按照步骤 5.1 重新分离 RNA。
  4. 为分析与 RCf 相关的病毒 mRNA，使用针对腺病毒晚期 mRNA 不同基因家族设计的引物（Table 1），对每个核内组分中的 100 ng RNA 进行 RT-PCR 扩增。
    1. 进行逆转录（RT）时，在 20 µl 反应体系中，使用各核内组分的 100 ng RNA，加入 M-MuLV RT 酶，42 ºC 反应 1 小时，70 ºC 反应 10 分钟。
    2. 进行扩增时，取 1 µl cDNA 进行 PCR 反应，条件同步骤 4.9。采用以下循环参数：95 ºC 预变性 3 分钟，随后进行 25 个循环（95 ºC 变性 1 分钟，退火温度见 Table 1，退火 1 分钟，72 ºC 延伸 30 秒），最后 72 ºC 延伸 3 分钟。
  5. 将 RT-PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶中以 90 V 电泳分离。用终浓度为 0.5 µg/ml 的溴化乙锭染色，并进行成像，以验证病毒晚期 mRNA 与 RCf 的结合情况。溴化乙锭的操作应遵循步骤 4.10 中的说明。

6. RCf 的免疫荧光可视化

注意：为避免样品受到灰尘颗粒污染，应在层流柜中进行此操作，并在使用前对所有溶液进行过滤。

  1. 将步骤 2.10 中获得的 RCf 组分直接点样 5 µl 到硅烷化载玻片上。
  2. 在室温下让样点自然干燥约 5 分钟。
  3. 通过在 RCf 样点旁缓慢且间接地滴加 500 µl PBS 液滴，并倾斜载玻片使 PBS 缓慢流过样点以实现再水化。从侧面吸除多余的 PBS。
  4. 用 500 µl 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 覆盖样本，在室温下封闭 2 小时。
  5. 通过在样本上缓慢且间接地滴加 500 µl PBS，轻轻洗涤载玻片 3 次。倾斜载玻片以去除多余的 PBS。
  6. 将样本与针对病毒 E2A DNA 结合蛋白（B6-89）的一抗按 1:500 比例溶于 PBS 中，在室温下孵育 2 小时。用 20 µl 抗体溶液覆盖点样区域，并在湿盒中孵育以防止干燥。
  7. 通过在样本上缓慢且间接地滴加 500 µl PBS/0.02% Tween 20，轻轻洗涤样本 3 次。倾斜载玻片以去除多余的洗涤液。
  8. 将样本与偶联了激发波长为 488 nm 荧光染料的山羊抗小鼠 IgG 二抗按 1:2,000 比例溶于 PBS 中，在 4 ºC 孵育 1 小时。用 20 µl 抗体溶液覆盖点样区域，并在湿盒中孵育以防止干燥。
  9. 通过在样本上缓慢且间接地滴加 500 µl PBS/0.02% Tween 20，轻轻洗涤样本 3 次。倾斜载玻片以去除多余的洗涤液。
  10. 在载玻片的点样区域滴加 2 µl 含 10% 甘油的 PBS 作为封片剂，盖上盖玻片。用透明指甲油封边，并于 -20 ºC 保存。
  11. 使用荧光显微镜在 488 nm 波长下，以 63 倍物镜和 1.4 数值孔径（NA）观察样本。

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结果

由于病毒复制室（RC）是由蛋白质和核酸组成的核内病毒诱导结构，与其他核区室相似，已证明可根据其生物化学特性通过速度梯度法进行分离。分离方案中的关键步骤如图1所示。每一步均需通过明场显微镜监测样品，以确保不同亚细胞组分的完整性。例如，在细胞膨胀过程中，需标准化低渗缓冲液中的孵育时间，以膨胀细胞质但避免损伤细胞核。细胞匀浆后，应获得不含细胞质成分（包括内质网膜）的完整细胞核。此外，超声处理时间也需标准化，以确保破裂所有细胞的核膜，同时不破坏复制室（RC）的结构。

在获得核内组分后，需要包括关键对照以确定其关联性与富集程度 真正 RCf 中的复制中心（RC）标记物。腺病毒复制中心通常通过免疫荧光法使用针对病毒 E2A-72K 蛋白（DBP）的抗体在感染细胞中进行可视化。DBP 是一种直接参与病毒基因组复制的病毒蛋白；因此，DBP 在 RCf 富集颗粒中的存在表明该病毒蛋白与分离颗粒之间存在直接关联，如图所示。 图1此外，通过Western Blot在RCf中检测到DBP，证实了该蛋白与分离的RC存在关联...

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讨论

为了阐明病毒感染调控细胞活动的分子机制，了解复制中心（RC）的组成及其相关活性将具有重要意义。因此，为了对复制中心进行详细分析，我们建立了一种无细胞体系，利用病毒诱导结构的大小和生化组成特性，通过基于蔗糖垫速度梯度的简单方法，分离富含复制中心的核内组分。该实验流程中需根据所用细胞类型进行优化的关键步骤包括：i）标准化细胞膨胀时间，以避免细胞核破裂；ii）形成良好的蔗糖梯度，以确保各组分能够有效分离；iii）在整个操作过程中通过明场显微镜持续监测样品状态；iv）超声处理的时间和强度应适当，以确保所有细胞核被裂解，同时复制中心不被破坏；v）所有分步分离操作均需在冰上进行，以防止核结构被破坏。

该技术可能遇到或可预见的局限性包括：i）核仁以及可能其他具有相似尺寸和生化组成的核内结构或区域会在复制区室（RC）组分中共同被分离，导致复制区室相对于其他类似核结构的相对丰度因病毒种类、细胞类型及感染后时间的不同而有所变化；ii）随着病毒复制周期的推进，不仅复制区室的大小和组成可能发生改变，其颗粒的致密程度也可能发生变化，因此有必要设计实验以确定感染后不同时间点复制区室颗粒的详细超微结构变化，从而...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

本工作得到了来自 CONACyT-SEP（SEP-2008-84582；CB-2011-01-168497）以及 Promep-SEP 为 R.A.G. 提供的资助；P.H. 获得了 CONACyT（447442）提供的奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGibco12100-046使用前在37 ºC水浴中预热
胎牛血清Gibco12484-028
蔗糖，超纯级Research Organics0928S配制2.55 M的储存液，4 ºC保存
玻璃匀浆器（Dounce homogenizer）Kontess Glass Company884900-0000
Branson 1800 超声波清洗仪BransonZ769533 SIGMA使用前开启15分钟
山羊抗小鼠IgG1二抗，Alexa Fluor 488标记Life TechnologiesA-21121以PBS按1:2,000比例稀释后使用
硅烷处理载玻片SigmaS4651-72EA在超净工作台内打开
SuperSignal West Pico 化学发光底物Pierce ThermoScientific34080

参考文献

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