由腺病毒感染正常细胞分离病毒复制车厢富集亚核分数

Summary

我们提供了一种从腺病毒 （Ad） 感染的人类细胞中分离病毒复制区室 （RC） 的新策略。这种方法代表了一种无细胞系统，可以帮助阐明调节病毒基因组复制和表达的分子机制，以及在 RC 建立的病毒-宿主相互作用的调节。

Abstract

腺病毒 （Ad） 感染人类细胞期间，宿主细胞核发生剧烈重组，通过将病毒和细胞蛋白募集到病毒基因组占据的位点，导致形成核微环境。这些位点称为复制区室 （RC），可被视为病毒诱导的核结构域，其中病毒基因组位于其中，参与复制、转录和转录后加工的病毒和细胞蛋白被募集。此外，参与抗病毒反应的细胞蛋白，如肿瘤抑制蛋白、DNA 损伤反应 （DDR） 成分和先天免疫反应因子也被纳入 RC。尽管 RC 似乎在促进高效和富有成效的复制周期方面发挥着关键作用，但尚未对其组成和相关活动进行详细分析。为了促进腺病毒 RC 的研究，以及可能来自在细胞核中复制的其他 DNA 病毒的腺病毒 RC，我们采用了一种基于速度梯度的简单程序来分离 Ad RC，并建立了一个无细胞系统，该系统适合对这些病毒诱导的亚核结构进行形态学、功能和组成研究，以及研究它们对宿主细胞相互作用的影响。

Introduction

腺病毒包含复制在被感染细胞核的双链DNA基因组。当病毒DNA进入细胞核，它局部化相邻的PML核机构^1。随着病毒的早期基因的表达，核架构大幅改组，诱导形成病毒性微环境，被称为病毒复制车厢^（RC）2。由于腺病毒（广告）RC是网站，病毒基因组复制和病毒晚期基因表达发生，他们提供了一个环境，招募所有参与这些过程中必要的病毒和细胞的因素。有趣的是，各种细胞蛋白负责细胞抗病毒反应，如DNA损伤反应的，先天免疫应答和抑制肿瘤是增选到这些病毒网站^2。因此，广告RC可以考虑监管中心之一，促进高效病毒复制，同时伴随调节蜂窝的抗病毒反应，表明这些结构是关键的病毒 - 宿主细胞相互作用的理解。尽管如此，钢筋混凝土形成的分子机制，其组合物和相关活动是知之甚少。

腺病毒的RC，以及RC从复制在核中的其他DNA病毒不相关联的膜，而相比之下，细胞质的RC ^3。此外，这些病毒诱导的结构是可能的蛋白质和核酸的待全部由。 RC形成在感染的细胞的RNA病毒（通常被称为病毒工厂）已被分离，同时它们的细胞质定位的和膜结合的状态，这促进了对它们的详细的形态，功能和生化特征⁴的优势。

据我们所知，核病毒的RC没有被隔离，这可能是由于所述的核内米的核结构和不存在的复杂性embranes这将有利于他们的孤立。他们的研究一直依靠而不是在免疫荧光显微镜，荧光原位杂交和....

Protocol

1. HFF细胞培养和Ad-感染

1. 传播的Ad5 WT病毒在HEK-293细胞和滴度荧光形成单元（FFU）上HFF细胞单层如前面^8中所述 。
2. 生长人类包皮成纤维细胞（HFF）的10ml DMEM / 10％胎牛血清（FBS）中无菌培养100mm平皿在37ºC和5％ _的 CO 2的加湿培养箱中。确定使用Neubauer室通过在4个16平方集计数细胞的细胞数量。通过计算细胞在4个16平方集的平均数和¹⁰ 4乘以该数而得到每毫升细胞数，对于包括在步骤1.3每次感染后，用1×10 ⁷ HFF细胞。
3. 模拟侵染或感染HFF细胞在用1ml的Ad5的在每个培养皿的DMEM，在30聚焦的MOI 100mm组织培养皿5型腺病毒（Ad5的）野生型（WT）（H5pg4100 ^8）形成单位，或FFU每个细胞。孵育2小时啊umidified细胞培养培养箱中37ºC和_5％的CO 2，小心摇动菜每15分钟，以确保病毒接种物在细胞上均匀分布。在此时间后，除去培养基并加入新鲜的DMEM补充有10％FBS和在湿润的细胞培养培养箱孵育16，24或36小时，在^37℃，并 _5％的CO 2。继续执行步骤2.1。

2.制备亚核馏分富含有腺病毒RC

1. 收获的Ad5感染....

Results

因为病毒复制室（RC）是蛋白质和核酸，类似于其他核结构域组成的亚核病毒诱导的结构，他们证明了通过基于生物化学特征速度梯度以便能够进行隔离。在分馏协议关键步骤示于图1.在每一步骤中，样品需要通过亮视野显微镜进行监测，以确保不同的亚细胞级分的完整性。例如，肿胀的细胞时，需要在低渗缓冲液孵育时间以溶胀细胞质避免了对细胞核进行标准化。细胞均化，完整的细胞核，自由细胞质成分包括内质网的膜后，需要获得。而且，声波处理时间的需要，以破裂所有细胞的核膜不中断的RC标准化。

获得子核级分之后，键控件需要包括确定区域合作框架的关联和善意 RC标志物富集。腺病毒的RC使用抗体针对病毒的E2A-72K蛋白（DBP）通常显现在感染细胞的免疫荧光。舒张压是一种病毒蛋白直接参与病毒基因组的复制;因此，舒张压在颗粒中的存在富集在RCF演示此病毒蛋白与孤立粒子的直接关联， 如图1，此外，检测舒张压在RCF通过Western印迹的证实这种蛋白质的分离的关联RC。 在图2中示出，通过后期倍感染后（36.......

Discussion

为了阐明控制病毒感染调节细胞活动的分子机制，了解与 RC 相关的组成和活性将是有用的。因此，为了对RC进行详细分析，我们建立了一种无细胞系统，该系统利用这些病毒诱导结构的大小和生化成分，使用依赖于蔗糖垫的速度梯度的简单程序分离富含RC的亚核部分。根据所使用的细胞类型，需要标准化的程序的关键步骤是：i）标准化细胞溶胀时间以避免细胞核破坏;ii） 形成蔗糖梯度，以便可以适当分离馏分;iii） 通过明场显微镜在整个过程中持续监测样品;iv） 超声处理时间和强度，以确保所有细胞核都裂解但 RC 不会被破坏;v） 所有分馏步骤都应在冰上进行，以避免破坏核结构。

可能遇到或可以预期的技术的局限性是：i） 核仁和其他具有相似尺寸和生化成分的亚核结构或结构域在 RC 组分中被共分离，使得复制区室与其他类似核体的相对丰度取决于病毒、细胞类型和用于分离的感染后时间;ii） 正如 RC 的大小和组成随着病毒复制周期的进展而变化一样，RC 颗粒的致密性也可能发生变化，因此有必要进行旨在确定 RC 颗粒在感染后不同时间的详细超微结构变化的实验，以评估颗粒成分和活性的变化， 但它们的稳定性是否会有所不同。虽.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	37 º 温热C 胎
牛血清	Gibco	12484-028
蔗糖，超纯	研究有机物	0928S	制备 2.55 M 储备液并储存在 4 ºC
Dounce均质器	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800超声波浴	兰森	Z769533 SIGMA	使用前 15 分钟开启。
山羊抗小鼠 IgG1 二抗，Alexa Fluor 488 偶联物	Life Technologies	A-21121	以 1：2,000 稀释度在 PBS
硅烷制备载玻片	Sigma	S4651-72EA	在层流柜中打开
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Pierce ThermoScientific	34080