斑马鱼是研究能量稳态的重要模式生物。通过使用对NADH2敏感的氧化还原指示剂刃天青（alamar Blue），我们建立了一种可在96孔板中测定斑马鱼幼体代谢速率的检测方法，该方法可应用于药物或基因筛选。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼是一种重要的模式生物，具有多种内在优势，有望成为研究能量稳态和肥胖的广泛应用模型。斑马鱼体型小，使得胚胎实验可在96孔或384孔板中进行；基于吗啉代和CRISPR的技术便于基因操作，且可通过浸泡方式施加药物处理。此外，斑马鱼适用于正向遗传学筛选，有助于新基因的发现。鉴于斑马鱼作为肥胖研究模型相对较新，有必要开发能够充分挖掘这些优势的工具。本文中，我们描述了一种可同时测量数千个斑马鱼胚胎能量消耗的方法。我们建立了一种基于微孔板的全动物检测平台，使用96孔板分离单个鱼体，并利用 commercially available 的细胞培养活力检测试剂alamarBlue，检测累积的NADH2生成量。在变温动物中，NADH2生成与能量消耗之间存在紧密关联。该能量消耗检测方法使得快速筛选可直接改变能量消耗或改变对药物处理（例如胰岛素增敏剂）响应的药理或遗传干预成为可能。
引言
目前，小鼠是肥胖研究中最主要的模型。小鼠具有较短的世代间隔以及丰富的遗传学工具，迄今为止尚无其他模型可与之匹敌。然而，斑马鱼同样具有较短的世代间隔（3至4个月），在遗传操作的便捷性方面甚至超过小鼠1,2。斑马鱼保留了哺乳动物近90%的基因，同时在子代数量以及用于遗传学和药物筛选的潜力方面远超小鼠3。
为了充分挖掘斑马鱼模型在肥胖研究中的潜力，必须开发相应的检测方法，以研究影响体重调节的因素，包括能量消耗。代谢物通过β-氧化和三羧酸循环进行代谢时会消耗氧气并产生NADH2。因此，NADH2是代谢物经由代谢通路（代谢物氧化）流动的直接指标。在变温动物中，质子（H+）穿过线粒体内膜的泄漏现象会导致NADH2氧化与ATP合成解偶联，但其水平比恒温动物低4至5倍4。因此，在斑马鱼中，NADH2通过氧化磷酸化与ATP生成高度耦合。本文中，我们描述了一种通过测定斑马鱼幼体中NADH2的生成量来间接评估能量消耗的检测方法5。
耗氧量是测量能量消耗的金标准。然而，为了充分利用斑马鱼的高通量潜力，能量消耗检测方法必须适用于高通量分析。依赖封闭腔室循环系统的耗氧量检测系统受限于可用腔室数量，通量较低6。开放空气环境下的 O2 消耗/CO2 产生检测也已应用于斑马鱼5,7。这些基于96孔板的开放式系统适用于高通量检测。但遗憾的是，与环境的气体交换限制了此类检测的灵敏度。我们近期发表了一种利用氧化还原指示剂刃天青（alamarBlue）监测 NADH2 的检测方法5。该方法克服了斑马鱼耗氧量分析中常见的通量和灵敏度限制。
斑马鱼正日益成为研究全身能量稳态的重要模型。部分原因在于斑马鱼适用于正向遗传筛选和药物筛选。此外，包括基因敲低和基因敲入在内的靶向遗传操作也可快速实施。我们此前已证明，该检测方法可与浸泡给药以及基因敲低或基因敲除相结合，用于鉴定影响代谢速率的化合物和基因5。此外，该检测方法的设计充分利用了斑马鱼本身所具有的高通量优势。
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方案
注意：本方案遵循亚利桑那大学负责任研究行为办公室的指导原则，并已获得机构动物护理和使用委员会的批准
1. 斑马鱼繁殖与胚胎培养
- 制备 E3 胚胎培养基8。配制 60 倍浓缩液：将 34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl2●2H2O 和 9.78 g MgCl2●6H2O 溶解于 1.95 L 去离子水（ddiH2O）中，用 NaOH 和 HCl 调节 pH 至 7.2，再用去离子水定容至 2 L。
- 配制 1 倍 E3 胚胎培养基：取 16.5 ml 60 倍浓缩液，加去离子水（ddiH2O）稀释至 1 L，加入 100 µl 1% 亚甲蓝溶液。
- 繁殖
- 将雄性和雌性亲鱼（7–18 月龄）分别饲养，以最大化产卵量。
- 在需要取卵的前一天，关闭光照 1–2 小时。按先前所述方法9设置交配组合（1 条雄鱼与 1–2 条雌鱼）于交配笼中。交配笼的设计可使卵在产出后穿过成鱼所在内槽的穿孔底部，从而避免被成鱼捕食。
- 可选步骤：如需定时繁殖（例如进行吗啉代寡核苷酸注射实验时），可用透明塑料隔板将雄鱼和雌鱼分隔开，次日早晨移除隔板，以实现定时产卵和受精。对于吗啉代研究，应进行功效分析以确定每组处理所需的胚胎数量。若缺乏效应大小或变异程度的预估数据，可先进行初步试验（n = 8）。
- 将交配笼中的卵倒入培养皿中（每 10 cm 培养皿放置 100–150 个胚胎）。待卵沉降至皿底后，倾去上清液，并用细尖一次性移液管吸除残留液体。重新加入第 1.1 步配制的 E3 胚胎培养基。
- 制备火焰抛光的一次性移液管，用于后续卵和鱼的转移。用剪刀在一次性刻度移液管的 0.25 ml 刻度处剪断，然后在本生灯火焰上对切口进行火焰抛光，以去除毛边。
- 将胚胎鱼在 28.5 ○C 条件下，置于含斑马鱼 E3 胚胎培养基的 10 cm 培养皿中培养至受精后 4 天（dpf）。每天两次使用火焰抛光的刻度一次性移液管移除未受精卵或死亡胚胎（呈现不透明白色外观）。每天更换一次 E3 胚胎培养基：倾去旧培养基，用细尖一次性移液管吸除残留液体，再加入预热至 28.5 ○C 的新鲜 E3 胚胎培养基。
2. 准备检测溶液
- 根据表1配制测定溶液。使用0.22 µm滤器对测定溶液进行无菌过滤。在开始测定前，将无菌的测定溶液置于28.5 ○C水浴中预热。
| 成分 | 总体百分比 | 体积 (µl/10 ml) |
| 60x E3 胚胎培养基 | 1.667 | 166.7 |
| 双去离子水 (ddi) H20 | 96.233 | 9623.3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
表1. 检测培养基
3. 执行检测
- 用无菌过滤的 E3 胚胎培养基将斑马鱼胚胎冲洗 3 次。将同一批次中所有存活的斑马鱼胚胎收集至一个烧杯中。无菌过滤 75 ml E3 胚胎培养基。使用细尖一次性移液管，尽可能吸除斑马鱼胚胎周围的 E3 胚胎培养基。重新加入 20 ml 无菌过滤的 E3 胚胎培养基。重复移除并更换 E3 胚胎培养基 3 次。
- 将 1 条鱼接种至 96 孔黑色侧壁透明底板的 93 个孔中。使用经火焰抛光的刻度塑料一次性移液管（步骤 1.5）逐个捕获胚胎，并轻柔地将其排入孔内，完成胚胎鱼的转移。将从盛有冲洗后鱼的烧杯中取出的 E3 胚胎培养基转移至 3 个空白孔中。以确保空白孔所接触的水质与含鱼孔完全相同。此步骤完成后，含鱼孔和空白孔的液体体积均应至少达到一半（200 µl）。
- 用检测溶液替换所有 96 个孔（包括空白孔）中的 E3 胚胎培养基。该步骤应针对 96 孔板的 12 列逐列进行。使用细尖一次性移液管，吸除板上某一列每个孔中的 E3 胚胎培养基（共 8 个孔），注意避免触碰斑马鱼胚胎。向每个移除液体的孔中加入 300 µl 检测溶液。对板上全部 12 列重复执行移除 E3 胚胎培养基并替换为检测溶液的操作。
- 可选：为检测化合物引起的代谢率变化，配制浓度为所需处理浓度 100 倍（100X）的溶液。注意确保 100X 溶液中 DMSO 浓度不超过 10%，以使最终 DMSO 浓度不超过 0.1%。向每个处理孔中加入 3 µl 的 100X 溶液。
注意：应进行功效计算以评估所需处理孔的数量。然而，在缺乏对反应幅度或变异程度的预估时，可先进行初步试验，设置 8 个加化合物处理孔和 8 个加载体对照处理孔（均含鱼）。- 向对照孔（无药物处理）中加入 3 µl 载体对照液。为确保化合物引起的荧光反应源于鱼体内的作用，需在 96 孔板中对 3 个空白孔也施加药物和载体处理。
- 使用荧光酶标仪读取加鱼孔板的荧光值，激发波长设为 530 nM，发射波长设为 590 nM。
- 将孔板置于设定为 28.5 ○C 的加湿培养箱中（在整个检测过程中保持孔板避光，以防检测溶液发生光漂白）。该检测可持续 1 至 24 小时不等，具体时长取决于研究目的。若测试短效且不稳定的化合物，较短的检测时间可能更为合适；而对于稳定化合物的测试或遗传效应的研究，延长检测时间更有利于利用累积信号的优势。
- 在预设的时间点（参见步骤 3.6 以帮助确定时间），再次使用与步骤 3.5 相同的参数读取加鱼孔板的荧光值。
4. 评估与处理相关的荧光相对变化
- 通过从实验结束时的荧光值中减去时间为0时的荧光值，计算每个孔的荧光变化量。不含鱼的孔（空白孔）的数值应接近0，远低于含鱼孔的数值。
荧光变化量 = 实验结束时的荧光值 - 时间为0时的荧光值 - 为确定荧光的相对变化，先计算对照孔荧光变化量的平均值，然后将每个孔的荧光变化量除以对照孔荧光变化量的平均值。需要注意的是，对照可以是溶剂对照或基因对照。
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结果
在没有胚胎鱼的情况下，检测溶液不会产生荧光增强（图1）。然而，该检测方法对孔内代谢率的微小变化具有高度敏感性。单条鱼在1小时内即可产生显著区别于空白孔的信号（P<0.0001）。图2展示了胚胎鱼在孵育24小时后所产生的信号的可视化图像。本图拍摄时使用了透明侧壁的孔板，但为了防止邻近孔之间的荧光信号串扰，建议在检测过程中使用黑色侧壁的孔板。
由于NADH2诱导的alamarBlue还原反应不可逆，信号会随时间累积，从而可放大微小的变化。为了说明差异会随时间累积并增大，我们监测了1至5条鱼在1、2和4小时时诱导的荧光相对变化（图3）。在每孔不同数量鱼的情况下，荧光的相对变化均随时间显著增加（P<0.001）。更重要的是，由于信号随时间累积，因此在4小时孵育时，因改变每孔鱼的数量所导致的荧光变化差异幅度比1小时时更为显著。因此，通过延长暴露时间，我们可以增强检测特定处理相关差异的能力。
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讨论
细菌或真菌污染将极大限制本实验的应用。E3胚胎培养基中的亚甲蓝可减少真菌污染的可能性。在整个胚胎培养过程中，关键是要每天两次仔细清除死亡的胚胎。此外，在开始实验当天，必须用无菌的E3胚胎培养基充分冲洗胚胎。这两个步骤可有效降低胚胎发生细菌污染的风险。步骤3.2中所述空白孔的设置可用于检测是否存在细菌污染。能产生可检测信号的细菌污染较为罕见。然而，如果空白孔显示出明显的信号，则应重新进行实验，并更加注意保持胚胎的清洁。如果实验者怀疑污染发生在胚胎收集之前，可按照先前所述方法对胚胎进行漂白处理（第22页）10。或者，如果实验人员怀疑污染发生在收集之后，则可在胚胎培养至4天龄期间使用含青霉素和链霉素的E2培养基（第23页）10。
尽管该检测方法在胚胎中的应用具有重要价值，但我们尚未在成年斑马鱼中验证其有效性。我们推测，由于刃天青难以渗透到组织深处，该检测在成年鱼类中的功能可能受限。此外，在摄食的鱼类中，肠道微生物群可能产生强烈的信号，从而不能真实反映鱼类自身的代谢情况。因此，该检测仅限用于卵黄营养阶段的胚胎鱼类。胚胎鱼类相对不活跃的特性具有独特...
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披露
作者无任何竞争性财务利益需要披露。
致谢
作者感谢 Roger Cone 博士和 Chao Zhang 博士对验证本实验方法应用所做出的贡献，相关内容此前已发表。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1F32DK082167-01（BJR）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AlamarBlue | 菲舍尔科技 | 10-230-103 | 由赛默飞世尔科技制造 |
| 细尖一次性转移移液管 | 菲舍尔科技 | 13-711-26 | 由赛默飞世尔科技制造 |
| 菲舍尔品牌 graduatd 一次性转移移液管 | 菲舍尔科技 | 13-771-9AM | 由赛默飞世尔科技制造 |
| 黑色侧壁透明底 96 孔板 | 菲舍尔科技 | 50-320-785 | 由 E&K 科学产品公司制造 |
参考文献
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