大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、外侧隔核和纹状体特异性 子宫内 C57BL/6小鼠中的电穿孔技术

摘要

本方案详细描述了如何通过特定方法转染C57BL/6中枢神经系统的不同区域 in utero 电穿孔。本方案包含针对发育为大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、侧隔核和纹状体区域的转染详细操作步骤。

摘要

在子宫内 电穿孔是一种广泛使用的技术，可用于在啮齿类动物中枢神经系统中快速高效地进行基因的时空操控。该技术既可实现目的基因的过表达，也可用于shRNA介导的功能缺失研究，因此具有广泛的应用前景。通过靶向特定区域内的特定细胞，可进一步拓展这一非常有用的方法的潜在应用范围。为了高效地靶向特定区域，必须掌握一些关键细节，例如胚胎发育阶段、施加的电压，以及最重要的电极位置。

本文提供了一种详细的实验方案，可实现对 C57BL/6 小鼠中枢神经系统多个区域的特异且高效的 in utero 电穿孔转染。具体展示了如何转染将来发育为压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角 1-3 区（cornu ammonis 1-3）、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑以及下丘脑的脑区。本方案提供了相应胚胎发育阶段的准确信息，包括合适的胚胎时期以及对应的电穿孔电压参数。尤为重要的是，提供了一张角度图谱，标明了正极应放置的准确位置。该标准化操作流程有助于实现高效的 in utero 电穿孔，还可能减少实验所需动物数量。

引言

自2001年三个独立研究小组首次报道以来^1-3，in utero电穿孔已成为分析啮齿类动物中枢神经系统基因表达的广泛应用标准技术。与基因敲除小鼠的制备相比，尽管后者的技术在不断改进，但仍耗时且昂贵，而in utero电穿孔因其操作简便而备受青睐。因此，in utero电穿孔能够实现快速高效的基因功能获得与缺失研究⁴。

为了转染大脑区域，将含有带负电荷质粒的溶液注射至脑室中。在施加电脉冲期间，带负电荷的DNA会向阳极迁移，因此只需改变阳极的位置即可选择性地转染特定区域。已有大量研究表明，中枢神经系统的多个区域均可作为靶标^3,5-8。例如，近期研究实现了对海马体、梨状皮层或纹状体的特异性转染^9-11。然而，关于电极放置位置的适宜参数往往缺乏标准化，且在不同小鼠品系之间并不总是易于重复应用。

特定胚胎时期的转染远非易事。在为特定实验选择设置时，必须考虑诸多影响因素 在子宫内 电穿孔。首先，为了最佳地转染相应的胚胎发育阶段，需要了解合适的电压参数。高电压会降低胚胎存活率，而低电压则会减少转染效率。 ^2,3,12电极板的尺寸也起着至关重要的作用，因为使用过大的电极板会降低刺激特异性，或因影响心律而导致死亡 ^4,12,13施加的电压....

方案

伦理声明：小鼠的处理及实验操作均遵循欧洲、国家及机构关于动物护理的指南。

1. 子宫内 电穿孔

注意：in utero 电穿孔操作按照先前已发表的方法进行^12,14。因此，以下仅对该方法作简要描述（图1）。

1. 准备工作
   1. 制备无内毒素的高级转染级Fast Green染色质粒溶液（含1,5 pCAGGS），方法如前所述¹².
   2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（直径0.8–0.9，35°角拉制并研磨）进行注射。
   3. 对器械进行灭菌。
2. 外科手术
   1. 手术开始前至少30分钟给予镇痛剂（卡洛芬，4 mg/kg体重，皮下注射，24小时缓释剂型）。
   2. 麻醉时间最长保持在35-45分钟（根据Guedel分期，为III期——外科麻醉期）¹⁵ - 最长25-30分钟。
   3. 用异氟烷麻醉孕鼠（诱导麻醉：2.8%，在麻醉舱中进行；手术维持：2.5%，通过面罩给药）。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。
   4. 涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。
   5. 用7.5%聚维酮碘溶液对手术区域进行消毒，并用无菌纱布覆盖小....

结果

图2，展示了特定的示例 在子宫内 对即将发育为压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角1-3区、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑和下丘脑的区域进行电穿孔转染。转染结果展示于推荐角度旁图2）。为了更清晰地显示角度 体内 电极的位置（0.5 mm）也在胚胎上标出图5，胚胎 在子宫内，羊膜囊中的胚胎，解剖后的胚胎）。为了提供一个概览 表1 总结了特定转染的相关事实。

此外，研究证明电极的尺寸对转染特异性具有关键作用（图6）。电极板尺寸越大，转染区域也越大，如图6所示。此外，过大的电极会覆盖胚胎过多区域，从而增加影响胚胎心律的风险（图7）。例如，10 mm的电极板可覆盖整个E12胚胎（图7）。

讨论

本方案详细描述了如何转染C75BL/6小鼠的压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角1-3区、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑以及下丘脑。结合所提供的全部信息，这是首个提供完整必要信息的方案，可轻松重现C57BL/6小鼠上述脑区的转染操作。以往的文献大多仅聚焦于少数特定脑区，因此针对特定脑区转染所需的详细操作信息缺乏标准化。

电极的位置、大小以及针对相应胚胎发育阶段所施加的电压是实现高效且特异性转染的关键步骤，本文对此进行了精确描述。所提供的角度图有助于确定电极在特异性电穿孔过程中的方向。此外，电极的位置还分别展示于子宫内的胚胎、羊膜囊中的胚胎以及完全分离的解剖胚胎上。所有这些信息均旨在帮助确定电极的正确放置位置。

使用适当的电压是本方案中的关键环节。高电压会降低存活率，而低电压则会降低转染效率^2,3,12。本方案中提供的电压建议是针对 C57BL/6 小鼠的，与 CD1 小鼠略有不同^2,3,12。CD1 小鼠对较高电压的耐受性优于 C57BL/6 小鼠，因此在转染 CD1 小鼠.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EndoFree 质粒大提试剂盒	QIAGEN	12362
快绿染料	Roth	0301.1
pCAGGS	Addgene
硼硅酸盐玻璃毛细管（直径 0.8-0.9 mm）	Wold Precision Instrument Inc.	1B100F-4
异氟烷（Forene）	Abbott	PZN 4831850
卡洛芬（Rimadyl）	Pfizer GmbH	批准号：400684.00.00
眼膏（Bepanthen 眼鼻软膏）	Bayer	PZN 01578681
0.9% 苯甲醇 0.9% 生理盐水溶液	美因茨大学医学中心药房
纱布（ES-Kompressen）	Hartmann	407835
无菌 5-0 Perma-Hand 丝线缝合线	Ethicon Johnson & Johnson	K890H
环形镊子 1/1.5 mm	Fine Science Tools	11101-09
环形镊子 4.8/6 mm	Fine Science Tools	11106-09
环形镊子 2.2/3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Adson 镊子—带齿直型 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
虹膜剪—精细直型 锐/钝 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille 剪刀—直型 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 镊子—不锈钢	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo 持针器—带锁 钨碳合金 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
电穿孔仪 CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
显微研磨器 EG-44	Narishige
P-97 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Company	P-97
铂电极 650P 0.5 mm	Nepagene	CUY650P0.5
铂电极 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
铂电极 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
铂电极 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
麻醉系统	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
加热板	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
温度控制器 220V 交流电	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV