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方法文章

大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、外侧隔核和纹状体特异性 子宫内 C57BL/6小鼠中的电穿孔技术

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DOI：

10.3791/53303

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2016年1月18日

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

本文内容

摘要

本方案详细描述了如何通过特定方法转染C57BL/6中枢神经系统的不同区域 in utero 电穿孔。本方案包含针对发育为大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、侧隔核和纹状体区域的转染详细操作步骤。

摘要

在子宫内 电穿孔是一种广泛使用的技术，可用于在啮齿类动物中枢神经系统中快速高效地进行基因的时空操控。该技术既可实现目的基因的过表达，也可用于shRNA介导的功能缺失研究，因此具有广泛的应用前景。通过靶向特定区域内的特定细胞，可进一步拓展这一非常有用的方法的潜在应用范围。为了高效地靶向特定区域，必须掌握一些关键细节，例如胚胎发育阶段、施加的电压，以及最重要的电极位置。

本文提供了一种详细的实验方案，可实现对 C57BL/6 小鼠中枢神经系统多个区域的特异且高效的 in utero 电穿孔转染。具体展示了如何转染将来发育为压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角 1-3 区（cornu ammonis 1-3）、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑以及下丘脑的脑区。本方案提供了相应胚胎发育阶段的准确信息，包括合适的胚胎时期以及对应的电穿孔电压参数。尤为重要的是，提供了一张角度图谱，标明了正极应放置的准确位置。该标准化操作流程有助于实现高效的 in utero 电穿孔，还可能减少实验所需动物数量。

引言

自2001年三个独立研究小组首次报道以来1-3，in utero电穿孔已成为分析啮齿类动物中枢神经系统基因表达的广泛应用标准技术。与基因敲除小鼠的制备相比，尽管后者的技术在不断改进，但仍耗时且昂贵，而in utero电穿孔因其操作简便而备受青睐。因此，in utero电穿孔能够实现快速高效的基因功能获得与缺失研究4。

为了转染大脑区域，将含有带负电荷质粒的溶液注射至脑室中。在施加电脉冲期间，带负电荷的DNA会向阳极迁移，因此只需改变阳极的位置即可选择性地转染特定区域。已有大量研究表明，中枢神经系统的多个区域均可作为靶标3,5-8。例如，近期研究实现了对海马体、梨状皮层或纹状体的特异性转染9-11。然而，关于电极放置位置的适宜参数往往缺乏标准化，且在不同小鼠品系之间并不总是易于重复应用。

特定胚胎时期的转染远非易事。在为特定实验选择设置时，必须考虑诸多影响因素 在子宫内 电穿孔。首先，为了最佳地转染相应的胚胎发育阶段，需要了解合适的电压参数。高电压会降低胚胎存活率，而低电压则会减少转染效率。 2,3,12电极板的尺寸也起着至关重要的作用，因为使用过大的电极板会降低刺激特异性，或因影响心律而导致死亡 4,12,13施加的电压、电极板的大小和位置是最需要考虑的重要因素，但还有其他影响电穿孔效果的因素，例如施加的DNA溶液量。

我们开发了一种详细的方案，可实现对C57BL/6小鼠不同脑区快速且高效的转染12。本方案提供了关于所用电压参数及电极板尺寸的详细信息，以提高转染特异性。此外，还说明了应注入质粒溶液的脑室位置，并给出了质粒溶液用量及电极放置位置的建议。通过在图谱中标注精确的位置信息，并进一步可视化这些位置，可简便地实现对压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马CA1-CA3区、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑以及下丘脑的特异且高效的in utero电穿孔转染。

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方案

伦理声明：小鼠的处理及实验操作均遵循欧洲、国家及机构关于动物护理的指南。

1. 子宫内 电穿孔

注意：in utero 电穿孔操作按照先前已发表的方法进行12,14。因此，以下仅对该方法作简要描述（图1）。

  1. 准备工作
    1. 制备无内毒素的高级转染级Fast Green染色质粒溶液（含1,5 pCAGGS），方法如前所述12.
    2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管（直径0.8–0.9，35°角拉制并研磨）进行注射。
    3. 对器械进行灭菌。
  2. 外科手术
    1. 手术开始前至少30分钟给予镇痛剂（卡洛芬，4 mg/kg体重，皮下注射，24小时缓释剂型）。
    2. 麻醉时间最长保持在35-45分钟（根据Guedel分期，为III期——外科麻醉期）15 - 最长25-30分钟。
    3. 用异氟烷麻醉孕鼠（诱导麻醉：2.8%，在麻醉舱中进行；手术维持：2.5%，通过面罩给药）。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。
    4. 涂抹眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。
    5. 用7.5%聚维酮碘溶液对手术区域进行消毒，并用无菌纱布覆盖小鼠，纱布用0.9%苯甲醇生理盐水溶液浸湿，仅暴露手术区域。
    6. 用手术刀切开腹腔（皮肤切口：1.5–2 cm，肌肉切口：1–1.5 cm）。
    7. 用经兽医人员或委员会指示的温热0.9%苯甲醇生理盐水溶液或其他无菌等渗溶液润湿，以防止打开的腹腔干燥。 
    8. 使用环形镊小心取出子宫角（使用环形镊，切勿用手接触子宫）。
  3. DNA注射与电穿孔。注意：靶向特定区域的具体操作细节见第2节。
    1. 缓慢将带有颜色的DNA溶液按所示注入脑室 图1 并通过制备的硼硅酸盐毛细管对第2部分进行操作。
    2. 根据相应的胚胎发育阶段施加适当的电压（例如，通过特制的镊子型铂电极（周期长度50毫秒，间隔暂停950毫秒）施加36–38 V（E14阶段）。 在施加电压期间脉冲式使用电穿孔电极板，以尽量减少子宫壁的损伤。
  4. 电穿孔后/术后护理
    1. 小心地将子宫角放回腹腔内。
    2. 分别缝合肌肉和皮肤切口。
    3. 让小鼠静置于温控支持装置上 用于恢复。
    4. 在术后4小时、24小时和48小时监测小鼠恢复期间的行为、进食和饮水情况。如有需要，可追加给予镇痛药（卡洛芬，4 mg/kg体重，24小时缓释剂型），持续2天。

2. 特定脑区的转染

注意：正极的位置表示为穿过充满DNA溶液的心室（右侧或第三脑室）的垂直中线与正极位置之间的夹角。当填充左侧脑室时，位置呈镜像反转。在图4中显示了耳泡原基的位置，这些位置提供了重要的参考点。

  1. 大脑皮层区域的转染（图2A，表1）。
    1. 按照第1.2节所述进行手术操作。在体电穿孔转染皮层区域时使用E14胚胎。
    2. 通过预先准备的硼硅酸盐毛细管，向右侧侧脑室注射1.5–2 µl含4 µg DNA的DNA溶液。
      1. 使用环形镊子小心调整胚胎位置，确保穿刺部位上方无可见血管。
      2. 缓慢注射DNA溶液，注射位置约为冠状缝后方0.75 mm、矢状缝外侧0.5 mm处（图3）。插入深度应为1.2 mm（E14，从子宫壁表面测量）。观察是否出现边界清晰的蓝绿色染色区域。
    3. 使用特制的镊子型铂电极施加电压（脉冲周期50毫秒，间歇950毫秒）。
      1. 选用3 mm或5 mm的电极片。
      2. 电压范围为36–38 V。
      3. 将电极中心置于耳泡前部稍前方。
      4. 若需转染压后皮层，电极角度为330–0°；若需转染运动皮层，角度为0–40°；若需转染体感皮层，角度为40–95°；若需转染梨状皮层，角度为95–110°（图2A）。
    4. 按照第1.4节所述进行电穿孔后/术后护理。电穿孔后4天（E18）处死小鼠，并按第3节所述分析胚胎。
  2. 海马体的转染（图2B，表1）。
    1. 按照第1.2节所述进行手术操作。在体电穿孔转染海马结构时使用E15胚胎。
    2. 通过预先准备的硼硅酸盐毛细管，向右侧侧脑室注射2 µl含4 µg DNA的DNA溶液。
    3. 使用特制的镊子型铂电极施加电压（脉冲周期50毫秒，间歇950毫秒）。
      1. 选用3 mm或5 mm的电极片。
      2. 电压范围为38–40 V。
      3. 将负极电极中心置于耳泡前部，正极电极中心置于耳泡中部。
      4. 若需转染齿状回，电极角度为190–210°；若需转染阿蒙角（CA）3区，角度为210–230°；若需转染CA2区，角度为230–250°；若需转染CA1区，角度为250–275°（图2B）。
    4. 按照第1.4节所述进行电穿孔后/术后护理。在海马结构完全形成后（出生后p21）进行分析，方法见第3节。
  3. 外侧隔核和纹状体的转染（图2C，表1）
    注意：电极角度与海马体转染所用角度存在重叠。为有效转染外侧隔核和纹状体并避免非预期的海马体转染，需使用更早期的胚胎阶段（E12）。
    1. 按照第1.2节所述进行手术操作。在体电穿孔转染外侧隔核和纹状体时使用E12胚胎。
    2. 通过预先准备的硼硅酸盐毛细管，向右侧侧脑室注射1 µl含4 µg DNA的DNA溶液。
    3. 使用特制的镊子型铂电极施加电压（脉冲周期50毫秒，间歇950毫秒）。
      1. 使用0.5 mm电极。
      2. 施加33 V电压。
      3. 将电极中心置于耳泡水平位置。
      4. 若需转染外侧隔核，电极角度为100–170°；若需转染纹状体，角度为170–240°（图2C）。
    4. 按照第1.4节所述进行电穿孔后/术后护理。电穿孔后6天（E18）处死小鼠，并按第3节所述分析胚胎。
  4. 丘脑和下丘脑的转染（图2D，表1）
    1. 按照第1.2节所述进行手术操作。在体电穿孔转染丘脑和下丘脑时使用E12–E13胚胎。
    2. 通过预先准备的硼硅酸盐毛细管，向侧脑室（左侧或右侧）注射1–1.5 µl含4 µg DNA的DNA溶液。等待2–3分钟，直至溶液扩散至第三脑室。也可直接向第三脑室注射。
      注意：此方法可提高特异性，但可能导致存活率下降（损伤风险较高）。
    3. 使用特制的镊子型铂电极施加电压（脉冲周期50毫秒，间歇950毫秒）。
      1. 使用0.5 mm或3 mm电极。
      2. 电压范围为33–35 V。
      3. 将电极中心置于耳泡后方稍后位置。
      4. 若需转染丘脑，电极角度为25–40°；若需转染下丘脑，角度为90–180°（图2D）。
    4. 按照第1.4节所述进行电穿孔后/术后护理。电穿孔后6天（E18）处死小鼠，并按第3节所述分析胚胎。

3. 灌注固定

  1. 准备工作
    1. 将 4% 多聚甲醛（PFA）预热至 37 °C。
    2. 用 PBS（4 °C）填充一支 50 ml 注射器，另一支注射器装入预热的 PFA。避免产生气泡。
    3. 将两支注射器连接至三通旋塞阀，第三端连接带翼输液套管（蝶形针）。
    4. 用 PBS 冲洗带翼输液套管。
  2. 灌注
    1. 通过皮下注射盐酸氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（7.5 mg/kg）对小鼠（妊娠期或出生后转染的小鼠）进行深度麻醉。
    2. 通过脚趾夹捏无反应确认小鼠已进入手术耐受状态。
    3. 在肋骨下方切开腹腔。
    4. 小心剪开膈肌。
    5. 沿两侧向上至锁骨处剪开，小心打开胸腔。
    6. 将蝶形针尖端插入左心室（从心脏心尖开始）。
    7. 剪开左心耳。
    8. 用 PBS 缓慢灌注小鼠（约 10 ml）。
    9. 切换三通旋塞阀。
    10. 用 5–10 ml 的 4% PFA 对小鼠进行灌注。
    11. 使用剪刀剪下小鼠头部，并从枕骨大孔开始解剖脑组织。解剖步骤参照先前发表的方法16。
    12. 将脑组织在 4% PFA 中后固定 2 天。置于 4 °C 避光保存。

4. 免疫组织化学

  1. 生成70 µm切片（例如， 使用振动切片机。
  2. 可选：通过抗体染色增强荧光。
    1. 室温下封闭切片1小时（0.1-0.2% Triton X-100，5%正常山羊血清）
    2. 过夜孵育适当抗体（抗-GFP，1:1,000）
    3. 用0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤3至5次。
    4. 3–5 小时，加入合适的荧光标记二抗（Alexa Fluor 488 标记的抗兔 IgG，1:1,000）孵育。
    5. 可选：用4-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.2 g/ml溶于0.1 M磷酸缓冲液）复染1分钟。
    6. 使用合适的荧光显微镜分析荧光。

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结果

图2，展示了特定的示例 在子宫内 对即将发育为压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角1-3区、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑和下丘脑的区域进行电穿孔转染。转染结果展示于推荐角度旁图2）。为了更清晰地显示角度 体内 电极的位置（0.5 mm）也在胚胎上标出图5，胚胎 在子宫内，羊膜囊中的胚胎，解剖后的胚胎）。为了提供一个概览 表1 总结了特定转染的相关事实。

此外，研究证明电极的尺寸对转染特异性具有关键作用（图6）。电极板尺寸越大，转染区域也越大，如图6所示。此外，过大的电极会覆盖胚胎过多区域，从而增加影响胚胎心律的风险（图7）。例如，10 mm的电极板可覆盖整个E12胚胎（图7）。

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讨论

本方案详细描述了如何转染C75BL/6小鼠的压后皮层、运动皮层、体感皮层、梨状皮层、海马角1-3区、齿状回、纹状体、外侧隔核、丘脑以及下丘脑。结合所提供的全部信息，这是首个提供完整必要信息的方案，可轻松重现C57BL/6小鼠上述脑区的转染操作。以往的文献大多仅聚焦于少数特定脑区，因此针对特定脑区转染所需的详细操作信息缺乏标准化。

电极的位置、大小以及针对相应胚胎发育阶段所施加的电压是实现高效且特异性转染的关键步骤，本文对此进行了精确描述。所提供的角度图有助于确定电极在特异性电穿孔过程中的方向。此外，电极的位置还分别展示于子宫内的胚胎、羊膜囊中的胚胎以及完全分离的解剖胚胎上。所有这些信息均旨在帮助确定电极的正确放置位置。

使用适当的电压是本方案中的关键环节。高电压会降低存活率，而低电压则会降低转染效率2,3,12。本方案中提供的电压建议是针对 C57BL/6 小鼠的，与 CD1 小鼠略有不同2,3,12。CD1 小鼠对较高电压的耐受性优于 C57BL/6 小鼠，因此在转染 CD1 小鼠...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

技术由 Melanie Pfeifer 和 Nikolai Schmarowski（美因茨大学医学中心显微解剖与神经生物学研究所）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EndoFree 质粒大提试剂盒QIAGEN12362
快绿染料Roth0301.1
pCAGGSAddgene
硼硅酸盐玻璃毛细管（直径 0.8-0.9 mm）Wold Precision Instrument Inc.1B100F-4
异氟烷（Forene）AbbottPZN 4831850
卡洛芬（Rimadyl）Pfizer GmbH批准号：400684.00.00
眼膏（Bepanthen 眼鼻软膏）Bayer PZN 01578681
0.9% 苯甲醇 0.9% 生理盐水溶液美因茨大学医学中心药房
纱布（ES-Kompressen）Hartmann407835
无菌 5-0 Perma-Hand 丝线缝合线Ethicon Johnson & JohnsonK890H
环形镊子 1/1.5 mmFine Science Tools11101-09
环形镊子 4.8/6 mmFine Science Tools11106-09
环形镊子 2.2/3 mmFine Science Tools11103-09
Adson 镊子—带齿直型 12 cmFine Science Tools1106-12
虹膜剪—精细直型 锐/钝 10 cmFine Science Tools14028-10
Mayo-Stille 剪刀—直型 15 cmFine Science Tools14012-15
Dumont #5 镊子—不锈钢Fine Science Tools11251-20
Castroviejo 持针器—带锁 钨碳合金 14 cmFine Science Tools12565-14
电穿孔仪 CUY21 SC Nepa Gene Co.
FST 250 热珠灭菌器Fine Science Tools18000-45
显微研磨器 EG-44Narishige
P-97 微量移液器拉制仪Sutter Instrument CompanyP-97
铂电极 650P 0.5 mmNepageneCUY650P0.5
铂电极 650P 3 mmNepageneCUY650P3
铂电极 650P 5 mmNepageneCUY650P5
铂电极 650P 10 mmNepageneCUY650P10
麻醉系统Rothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Vapor 19.3
加热板Rothacher-Medical GmbHHP-1M
温度控制器 220V 交流电Rothacher-Medical GmbHTCAT-2LV

参考文献

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