本方案描述了一种新颖且高效的方法，可快速诱导大鼠对乙醇产生操作性反应；与标准方法不同，该方法无需通过限水或逐步减少糖精/蔗糖浓度来启动反应。
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摘要
摘要
操作式口服自我给药方法常用于研究乙醇在动物中的强化特性。然而，标准方法需要使用糖精/蔗糖渐减法、限水和/或长时间训练，才能在大鼠中启动操作式反应。本文介绍了一种新颖且高效的方法，可快速启动乙醇操作式自我给药反应，该方法便于实验人员操作，且无需限水或糖精/蔗糖渐减，从而消除了在乙醇操作式自我给药研究中使用甜味剂可能带来的混杂因素。采用该方法，Wistar 大鼠通常在不到两周的训练时间内即可建立并维持对20%乙醇溶液的自我给药行为。此外，在30分钟的自我给药阶段，血液乙醇浓度与获得的奖赏次数呈正相关。 Furthermore，纳洛酮（naltrexone）是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗酒精依赖的药物，已被证明可在啮齿类动物中抑制乙醇自我给药行为；在本方法中，纳洛酮以剂量依赖方式减少大鼠对20%乙醇的摄入量及其饮酒动机，从而验证了该新方法可用于研究乙醇在大鼠中的强化特性。
引言
开发用于研究药物强化效应的动物模型，已被证明是研究人类药物成瘾的重要工具。更具体地说，操作式自我给药是一种广泛使用的行为模型，也是评估口服乙醇溶液正向强化效应最有效的方法之一。早期在建立此类模型时面临的一个主要问题是，大多数啮齿类动物对高浓度乙醇具有天然的厌恶味觉，这一现象在缺乏或仅有少量饮酒经验的人群中同样存在1。为克服这一障碍，传统标准方案通常需要采用限水处理和/或逐步降低糖精或蔗糖浓度的方法，以促进自我给药行为的获得与维持。然而，这两种方法均存在不足：它们需要长时间的训练才能启动对乙醇的摄取反应，且获得成功率相对较低。此外，使用甜味剂还可能在自我给药数据的解释中引入潜在偏差。以下方案则不受这些局限性的制约。
简而言之，Samson 及其同事2已证明，需将乙醇溶解于20%蔗糖的甜溶液中，并在为期4周的训练过程中逐渐降低甜味，才能启动大鼠对水中10%乙醇的摄取反应。此外，通常需要6至8周才能实现稳定的乙醇摄入量1-3。该方法存在诸多问题。首先，研究者在能够开始测量乙醇自我给药之前，必须进行长时间的训练。相比之下，在食物限制的动物中，可卡因或海洛因的静脉自我给药仅需0至1天的食物杠杆预训练，且通常在10至12天内即可获得稳定的药物反应行为4,5。该方法的另一局限在于，糖精和蔗糖对大鼠具有高度奖赏性，并可引发与滥用药物相似的脑激活模式，从而在乙醇自我给药研究中引入潜在的混杂因素6-9。最后，采用该方法建立乙醇溶液自我给药的大鼠在习得过程和反应速率方面表现出较大的个体差异1,10，其中相当一部分大鼠因习得失败和/或反应速率不足而持续被排除在实验之外。
相比之下，本方案提供了一种简单且高效的方法，用于获取和维持口服自行摄取20%乙醇水溶液的行为，该方法无需进行限水处理、蔗糖/糖精渐退或长时间获取训练。最近一项研究发现，口服乙醇的自行摄取呈现倒U型剂量反应曲线，在20%乙醇浓度下摄取量最高，这为我们在实验设计中选择20%乙醇溶液提供了依据11。
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方案
所有操作均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行。
1. 动物护理与饲养
- 到达动物房后，将到达时体重为 200 - 225 g 的雄性 Wistar 大鼠以每笼两只的方式饲养于温度（21 °C）和湿度受控的环境中，并采用反转的 12 小时光照-黑暗循环。
注意：根据实验设计的不同，大鼠也可单只单独饲养。 - 在开始实验前，让大鼠在屏障系统动物房内适应环境及光照周期至少一周，并每天进行抓取操作。每周称重一次。
- 在整个实验期间，让大鼠自由获取饲料和自来水（无需进行水剥夺即可建立行为反应12）。所有行为学测试均应在光照-黑暗循环的暗期于暗光测试室内进行。
注意：尽管我们常规使用年轻成年雄性 Wistar 大鼠（出生后第 62 - 65 天），但本方案理论上也适用于研究其他大鼠品系，以及性别和/或年龄差异。
2. 操作性训练
- 在尺寸相同的操作箱（30.5 × 29.2 × 24.1 cm）中进行所有行为训练和测试，操作箱配备网格地板和铺有垫料的接尿盘（动物之间更换垫料以减少气味线索），并置于装有排风扇用于通风的隔音箱内。
注意：大鼠在训练第一天即开始进行操作性条件反射训练（需按压杠杆以获得强化物），训练时间位于暗周期开始后1至8小时之间。在酒精训练前，不进行酒精预暴露，也不进行食物或液体的形状塑造训练。 - 每个操作性条件箱均配备刺激灯、注射泵，以及位于液体杯 receptacle 两侧的两个可伸缩杠杆。通过计算机及相应软件连接并控制各实验箱。
注意：大多数供应商会提供自给药套装，其中包含所有必要组件，以及用于控制实验舱的软件和接口。 - 编写一个操作性条件反射程序，根据制造商的说明，启动固定比率（FR）强化程序，使用20%乙醇作为强化物（即在指定数量的反应之后才给予一次强化）。例如，在固定比率1（FR1）程序中，大鼠需完成一次反应即可获得一次强化物（参见补充代码文件部分中的FR1程序示例）。执行以下命令。
- 伸出两个操纵杆以标记会话的开始并提示酒精可用。
注意：按压与乙醇相关联的杠杆（有效杠杆）一次，即可获得一定体积的乙醇作为奖励。 100 μL 在相邻的饮水孔中注入20%乙醇水溶液，并启动一个伴随的5秒超时周期，该周期由杠杆上方提示灯的亮起作为信号。提示灯在训练第1天即开始使用。 - 在暂停期期间，尽管反应不会带来预设的后果，仍需记录其发生情况。需同时记录另一杠杆（非激活杠杆）上的反应，尽管这些反应从不产生行为后果。注意：非激活杠杆用作评估非特异性行为的对照。
- 记录主动杠杆上的反应次数（反应速率）以及获得的20%乙醇奖励次数。
- 30 分钟后，收回两个杠杆，以表示该实验阶段结束，并提示酒精供应终止。
- 保存并归档所有数据。
- 伸出两个操纵杆以标记会话的开始并提示酒精可用。
- 在开始训练前，检查每个操作箱中所有设备的正常运行情况（可伸缩杠杆、液体分配器）。
- 使用190 Proof（95%）乙醇与自来水稀释配制20% v/v乙醇溶液。
注意：乙醇溶液可室温保存。根据生产厂家不同，乙醇原液浓度可能高达99.98%。此外需注意，尽管在大多数已发表的文献中，乙醇浓度通常以体积/体积（v/v）表示，但也有部分文献以质量/体积（w/v）表示。 - 用20%乙醇溶液填充注射器，并确保输注管路中无泄漏或气泡。手动推动少量乙醇通过输注管路，以确保从第一次强化反应开始乙醇能够准确注入 receptacle 中。用纸巾将 receptacle 擦干，并在开始实验前确保其为空。
- 加载控制20%乙醇强化FR程序的软件
- 在30分钟的训练时段内，采用固定比率1（FR1）程序训练未经操作性条件反射和药物暴露的大鼠自给20%乙醇，无需限水。
- 使用运输笼将大鼠从动物房转运至测试室。
- 将每只大鼠分配至一个实验舱室。从运输笼中取出每只大鼠，并将其放入指定的自我给药实验舱室内。
- 尽量保持每天实验条件的一致性。因此，应每天在大致相同的时间，将大鼠置于相同的自给药实验箱中进行测试。
- 启动软件以开始FR1强化程序，使用20%乙醇作为强化剂。
- 实验结束后，将大鼠从自给药实验箱中取出，并送回动物饲养室。
- 为手动确认动物是否已消耗酒精溶液，可使用纸巾检查容器是否干燥。或者，使用1或2 mL注射器收集容器中剩余液体，以估算未消耗的体积。
注意：为了获得更精确的测量结果（但成本也更高），可以为每个实验舱配备与液体杯 receptacle 相连的舔舐记录系统（lickometer system），以精确记录大鼠在自给药期间产生的舔舐次数。 - 用表面消毒剂清洁每个腔室的壁和格栅地板。
- 使用后，用70%乙醇溶液清洗输液管路以进行维护。不使用时，应盖上盖帽，以防霉变和灰尘污染。
- 每次实验结束后，收集并分析生成的数据。具体而言，计算主动杠杆按压次数的平均值、获得的酒精奖励次数的平均值，以及非主动杠杆按压次数的平均值。
注意：在大多数论文中，酒精消耗量也以克/千克（体重）的乙醇摄入量表示。乙醇摄入量可使用以下公式计算：
根据消耗的体积（mL）、获得的奖励次数 ± 每次奖励的单位体积/奖励以及乙醇在室温下的密度（0.789 g/mL）计算。
例如，如果一只体重为400 g的大鼠获得了20次20%（v/v）乙醇溶液奖励：
- 每周进行5至6次训练，直至行为表现稳定（定义为至少完成15次训练，且最近3次训练中获得的奖励总数变化不超过15%）。
注意：当大鼠在固定比率1（FR1）程序上达到稳定基线后，可根据制造商说明修改操作性条件反射程序，以增加获得酒精奖赏所需的行为反应次数。例如，可将固定比率提高至FR2或FR3，以尽量减少偶然强化的发生。 - 测定血液乙醇浓度：
- 为确认大鼠在自给药实验中摄入的奖赏物是否被消耗，需在自给药结束后测定其血液乙醇浓度。当大鼠达到稳定基线水平后，于实验结束立即从尾侧静脉采血。将23 G针头插入血管并采集血液 50 µL 使用毛细管采集血液样本。
- 转移 50 µL 将血样加入10 mL 顶空瓶中，并添加 50 µL 以1:1,000的异丙醇作为内标。使用乙醇标准品配制10至300 mg/dL的标准曲线。采用顶空进样器结合色谱柱对样品进行处理。13 根据制造商的设置。
- 渐进比率
- 使用渐进比率（PR）程序评估动物对获取奖赏的动机14PR 是一种操作性时间表，其中获取强化物所需的行为次数逐渐增加（换句话说，大鼠需要为每一次后续奖励付出更多的努力）。
注意：与固定比率（FR）实验会话不同，进度比率（PR）实验会话不设时间限制，只有在连续30分钟内未完成任何比率时才会终止。- 将大鼠放入指定的操作箱中，在PR强化程序下使其对20%乙醇进行反应：除在单次实验会话内逐步增加反应需求或反应成本外，所有实验条件均与FR程序中使用的条件保持一致（参见步骤2.3）即，获得一次乙醇奖励所需在有效杠杆上按压的次数）按照以下公式递增：1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32……注：PR程序的示例见补充代码文件部分。
- 在连续30分钟未获得奖励后，终止PR实验会话。
注：断点定义为PR阶段期间最后完成的反应要求。
- 使用渐进比率（PR）程序评估动物对获取奖赏的动机14PR 是一种操作性时间表，其中获取强化物所需的行为次数逐渐增加（换句话说，大鼠需要为每一次后续奖励付出更多的努力）。
3. 验证酒精自我给药操作模型的预测效度
注意：当大鼠已建立稳定的自我给药基线后（见步骤2），可通过测试纳洛酮（一种目前经美国食品药品监督管理局批准用于治疗酒精依赖的药物）在减少20%乙醇自我给药行为中的有效性，来评估该模型的预测效度。我们建议在训练期间达到的最高固定比率（FR2）条件下进行该测试，此时动物的反应率较为稳定且较高。一旦确认模型具有预测效度，即可用于评估新的候选药物。
- 测试日前，为大鼠在每次自我给药会话前30分钟皮下注射生理盐水，以使其适应注射操作；至少连续进行两次自我给药会话，或直至生理盐水注射对乙醇摄取行为无显著影响（定义为最后两次会话中获得的总奖励次数变化不超过15%）。
- 将纳曲酮溶解于生理盐水中，并调节pH至中性，以利于动物注射。在每次会话前30分钟，按1.0 mL/kg的剂量体积通过皮下途径给药。注意：文献提供了充分证据支持选择0.1–1 mg/kg范围内的剂量，因此本方案采用0.1、0.3和1 mg/kg三个剂量。
注意：研究表明纳曲酮可通过皮下和腹腔注射两种途径给药，但其效力存在差异，皮下注射的效力约为腹腔注射的30倍15。因此，我们推荐使用皮下注射途径，因为在0.1至1 mg/kg的浓度范围内，多个实验室已验证并重复证实了该给药方式的有效性12,15,16。 - 在测试日，采用被试间设计，按照平衡/随机顺序，对大鼠在四种纳曲酮剂量周期（0、0.1、0.3和1 mg/kg）之一的会话前30分钟进行注射。
- 每完成一个剂量周期后，让大鼠经历至少连续两次自我给药会话以确保药物完全清除，或直至其对乙醇的反应恢复至基线水平。注意：因此，在测试结束时，所有大鼠均接受了全部四种剂量的注射。
- 此阶段结束后，选择最有效的剂量（1 mg/kg），并利用递增比率程序测试纳曲酮对动物饮酒动机的影响（参见步骤2.12）。
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结果
图1展示了在FR1程序下训练的、无操作性条件反射和药物接触史的Wistar大鼠（共八个不同队列，总计239只大鼠）在30分钟自给药实验中自行摄取20%乙醇的代表性行为，实验过程中未实施饮水限制，也未使用水杨酸盐/蔗糖渐减法。采用该方案后，大鼠迅速开始按压杠杆以获取乙醇奖励，在首次实验中即获得超过10次奖励（图1A）。至自给药第10次实验时，大鼠在活动杠杆上的反应率达到稳定状态，在FR1程序下平均获得23.7 ± 0.7次奖励（图1B），相当于平均乙醇摄入量为0.86 g/kg。
图2展示了不同剂量的纳曲酮对酒精自我给药行为的影响。为了评估乙醇寻求动物模型的预测效度，应验证纳曲酮（一种目前经美国食品药品监督管理局批准用于治疗酒精依赖的药物）在采用延长固定比率3（FR3）强化程序训练的动物群体中的有效性。预计纳曲酮治疗将导...
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讨论
通过本实验方案，我们介绍了一种新的方法，用于建立并维持大鼠对20%乙醇的稳定口服自我给药行为。与经典的乙醇自我给药模型不同，该方法无需采用饮水剥夺、长时间可及性训练或糖精/蔗糖渐减程序12。此外，目前经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗酒精依赖的药物纳洛酮（naltrexone），能够有效降低采用本方案训练的Wistar大鼠的酒精自我摄入行为及其摄取酒精的动机。该结果为本方案提供了重要的药理学验证，因其与既往研究结果一致，即纳洛酮在非依赖性大鼠中可有效减少酒精摄入16-18。纳洛酮是一种阿片受体拮抗剂，在动物饮酒模型及临床试验中均显示出良好的应用前景。在动物模型中，纳洛酮可有效减少非依赖性动物的酒精摄入和自我给药行为16,17,19，且不影响非特异性行为（如对无效杠杆的按压次数）12。此外，纳洛酮也被证实可减少食物摄入。例如，它能显著降低大鼠对无热量甜味糖精溶液以及高适口性含热量巧克力饮料的液体摄入量20。纳洛酮还可减少蔗糖的自我给药16、饮水剥夺后的饮水量21，以及在双瓶选...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由瑞典研究理事会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 超高度中密度纤维板隔音箱，内部尺寸：22"宽 × 22"高 × 16"深 | Med Associates Inc. | ENV-018MD | |
| 带改良顶部、接废盘和光束传感器的超高度模块化测试舱 | Med Associates Inc. | ENV-007CT-PH | |
| 适用于大鼠或小型灵长类动物的不锈钢格栅地板 | Med Associates Inc. | ENV-005 | |
| 可伸缩杠杆 | Med Associates Inc. | ENV-112CM | 每个SA舱配备2个 |
| 刺激光源，1"白色透镜，安装于模块化面板上 | Med Associates Inc. | ENV-221M | 每个SA舱配备2个 |
| 双杯式液体接收器，配有18号不锈钢管 | Med Associates Inc. | ENV-200R3AM | |
| 单速注射泵，3.33 rpm | Med Associates Inc. | PHM-100 | |
| 液体输送套件 | Med Associates Inc. | PHM-122-18 | |
| SmartCtrl 8输入/16输出控制包 | Med Associates Inc. | DIG-716P2 | |
| MED-PC 软件 | Med Associates Inc. | SOF-735 | |
| http://www.mednr.com/ | Med Associates Inc. | 一个开源网站，旨在为研究人员提供一个共享MEDState Notation代码的平台 | |
| Kendall Monoject 20 ml注射器，标准鲁尔接头 | VWR International | MJ8881-520657 | |
| 乙醇，纯品，190 proof（95%），USP，KOPTEC | Decon Labs | 2801 | |
| 0.9% 氯化钠注射液，USP | Hospira | 0409-4888-50 | |
| 盐酸纳洛酮 | Sigma Aldrich | N3136-1G | |
| 23 G BD PrecisionGlide 针头 | BD | 305145 | |
| Minivette POCT 50 µL，K3EDTA | Sarstedt | 17.2113.150 | 用于毛细血管血液采集 |
参考文献
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