方法文章

一种用于脑部特异性敲低miRNA的简单替代性立体定位注射方法

DOI：

10.3791/53307

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2015年12月26日

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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microRNA 在大脑中发挥着关键作用，并且是神经退行性疾病建模的潜在靶点。然而，由于 microRNA 序列较短且脑组织难以接近，调控其表达水平具有较大挑战性。本视频介绍了一种在小鼠中利用神经肽设计拮抗寡核苷酸（antagomir）并实现脑部特异性递送的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microRNA（miRNA）是基因表达的关键调控因子。在大脑中，神经发育和神经元功能等重要过程依赖于microRNA的正确表达。通过调控神经元细胞死亡，干扰大脑中的microRNA可用于建立神经退行性疾病的模型。目前，通常采用立体定位注射将miRNA敲低试剂递送至大脑的特定部位。本文讨论了设计针对具有锁核酸修饰（LNA）的miRNA的antagomir的策略，并随后描述了一种可在大脑不同区域实现antagomir均匀递送的脑部特异性递送方法。该方法简便且具有广泛适用性，因为它克服了立体定位注射所需的手术操作、相关组织损伤以及局部递送的局限性。我们制备了神经嗜性细胞穿透肽——狂犬病病毒糖蛋白（Rabies Virus Glycoprotein, RVG）与靶向miRNA-29的antagomir的复合物，并通过尾静脉注射实现脑部特异性递送。该antagomir的设计包含了可特异性靶向miRNA以及与肽段形成非共价复合物的功能元件。在神经元细胞中miRNA的敲低导致了凋亡性细胞死亡及相关行为缺陷。因此，该方法可通过干扰miRNA构建神经退行性疾病的急性模型。

引言

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微小RNA（microRNAs）因其在基因表达调控中的普遍作用以及参与疾病的直接证据，已成为新兴的治疗靶点。目前，微小RNA正被积极研究作为药物靶点的潜力。1,2此外，miRNA 表达的改变与多种疾病相关3 通过人工干扰miRNA表达来模拟这些变化，可用于研究疾病表型相关的细胞通路。组织特异性递送靶向miRNA的药物目前是基于miRNA的药物开发面临的主要挑战。Antagomirs和miRNA模拟物是在调控miRNA水平方面具有前景的干预手段4–6然而，在将antagomirs用于实际应用之前，必须在其设计中引入能够增强其特异性和功效的特殊结构特征。 体内 miRNA 表达的扰动

microRNA 作为目前无法治愈的神经退行性疾病和神经发育性疾病的治疗靶点具有重要意义。血脑屏障限制了抗微小RNA（antagomir）在脑内的递送。立体定位注射在啮齿类动物模型中被广泛用于将分子递送至脑内特定区域7。该方法需要熟练的技术，且在仪器设备和时间上投入较大。立体定位注射具有侵入性，需进行手术操作，至少会造成轻微组织损伤，并且仅限于局部递送。使用具有神经元靶向倾向的细胞穿透肽可克服上述局限，因为这类肽可通过血管途径递送并穿透血脑屏障。一种源自狂犬病毒糖蛋白（Rabies Virus Glycoprotein, RVG）的肽此前已被用于在小鼠中递送针对日本脑炎病毒的siRNA8。我们发现，利用该肽递送antagomir，可有效在小鼠脑内敲低microRNA9。

miRNA 沉默的第二个主要挑战源于 miRNA 的尺寸较小以及存在序列高度相似的异构体。以 mmu-miR-29 家族为例，该家族包含三种序列高度相似的异构体：miR-29a、b 和 c。抗义寡核苷酸（antagomirs）通常在其骨架上进行化学修饰，以提高稳定性并抵抗核酸酶的降解作用。锁核酸（Locked Nucleic Acids, LNAs）具有进一步的优势，不仅能增强热稳定性，还可通过超出空间位阻效应的作用机制诱导靶标降解10。在整个骨架上引入修饰可能有效，但成本较高。我们此前已了解到，修饰数量超过最佳水平后，并不能进一步提升其功效。因此，antagomir 的设计需考虑对其实施最优的化学修饰。

为了使antagomir与神经趋向性肽通过非共价方式形成复合物，可使用带电荷的七至九个精氨酸延伸序列。采用D型精氨酸残基是因为其具有更高的稳定性，不易被蛋白酶降解。七至九个精氨酸序列可有效作为细胞穿透载体，但并不提供细胞类型特异性。通过将RVG肽共价连接至九精氨酸连接子，构建出一种具有神经趋向性且能穿透细胞的肽。该肽中的正电荷残基可与带负电荷的核酸骨架相互作用，从而形成复合物。这些复合物可用于将DNA或RNA有效转染至培养细胞中，以及在体（in vivo）转染至组织中。

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方案

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注意：所有涉及动物实验的操作均已获得新德里基因组学与综合生物学研究所机构动物伦理委员会（IAEC）的批准（批准编号：IGIB/AEC/10/2013）。本实验方案专门优化用于将Antagomir-29靶向递送至脑组织，以实现miR-29的敲低。

1. 抑制性寡核苷酸设计策略

  1. 从 miRBase11（http://www.mirbase.org/）获取成熟 miRNA 序列。
  2. 利用 miRBase 记录中的“基因家族”链接获取相关 miRNA 家族成员的序列
    （http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009）。
  3. 对序列进行反向互补：可通过 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html 提供的工具便捷地完成序列反向互补操作。
  4. 根据以下原则标记使用 LNA 进行修饰的位置：
    1. 选择相距 3-4 个碱基的胸腺嘧啶（T）残基进行 LNA 修饰，因为 LNA 修饰的嘧啶比嘌呤更稳定12。
    2. 若上一步获得的修饰位点少于五个，则选择间隔 3-4 个残基的胞嘧啶（C）残基。
    3. 优先将五个修饰位点安排在反义寡核苷酸（antagomir）的 5’ 端，以避开种子序列。

2. 抗微小RNA-神经肽复合物的制备

注意：这是实验方案中最关键的步骤，需要进行标准化。为了标准化该方案，可用任何荧光标记的寡核苷酸（FLO）替代antagomir9。肽应具有高纯度（HPLC级，纯度98%）。肽与antagomir的序列及电荷见表1。

  1. 根据antagomir的摩尔电荷、毒性及小鼠体重确定注射antagomir的摩尔数。根据antagomir与肽的摩尔电荷比计算需注射肽的摩尔数。
    注意：为实现小鼠脑内有效递送并控制毒性，需标准化antagomir与肽的摩尔电荷比。可采用不同摩尔电荷比的荧光标记寡核苷酸与肽进行标准化实验。我们发现，当Antagomir-29及其对照以每克小鼠体重4微克（4 μg/g）的剂量给药时，均表现出毒性。  Antagomir-29 和对照物的使用剂量为每克体重 2 微克，但该有效浓度可能因不同的微小 RNA 而异。
  2. 将肽和antagomir分别从原液用无菌10% D-葡萄糖在微量离心管中稀释至步骤1中计算出的所需终浓度。
  3. 将含有肽溶液的微量离心管置于涡旋振荡器上，以中等速度涡旋。
  4. 加入1/3rd 将antagomir溶液逐滴缓慢加入肽溶液管中，同时在涡旋混合器上充分混匀。
  5. 继续在涡旋振荡器上混合溶液1分钟，然后静置1分钟。
  6. 重复步骤4和5两次，将剩余的antagomir溶液与同一微量离心管中的肽溶液混合。缓慢加入对于形成单一分散且转染效率高的复合物至关重要。快速加入可能导致复合物聚集并发生沉淀。
  7. 将复合物在室温下孵育30分钟，期间勿涡旋振荡。在孵育过程中，使小鼠适应即将进行注射操作的实验室环境。

3. 尾静脉注射Antagomir-神经肽复合物

  1. 固定动物时，将小鼠放入合适尺寸的固定器或断头固定锥中。
  2. 用预先浸有温水（约 40°C）的棉签清洁尾部表面，以促进血管扩张，提高静脉的可见度。
  3. 使用小容量（0.5 – 1.0 cc）胰岛素注射器，以 15–20° 角度接近尾部。注意避免向注射器内引入空气。从尾部远端开始注射复合物。拔出针头后，立即将消毒棉签直接按压在注射部位约 5–10 秒，以防止出血。
  4. 将小鼠放回独立通风笼具中，每笼 3–5 只，并提供玉米芯垫料和纸巾作为环境丰富材料。切勿将未注射与已注射的小鼠同笼饲养。

4. 行为学实验

注意：注射后与行为学实验之间应保持3-4小时的时间间隔，以使小鼠在注射后充分恢复。将小鼠带至安静的房间。  在此适应期间不要打扰动物。

  1. 将小鼠置于新环境中适应30分钟，然后开始以下行为学检测。每次行为学检测之间间隔10分钟。
  2. 后肢抓握测试：
    注：该测试用于指示运动功能障碍和神经功能损伤。
    1. 在透明背景下，轻轻抓住小鼠尾根部将其提起。
    2. 观察后肢位置持续10-15秒。野生型小鼠会将后肢向外伸展远离腹部，而共济失调小鼠在悬空时间超过50%的情况下会将一个或两个后肢向腹部回缩13。
    3. 将小鼠放回笼中。
  3. 边缘行走测试：
    1. 轻轻抓住小鼠尾巴将其提起，并放置于笼子边缘上。
    2. 特别观察小鼠在笼角处的表现。野生型小鼠能够轻松通过角落，无恐惧表现且不失去平衡；而共济失调小鼠在沿笼边缘行走及经过角落时会出现失衡、僵直或颤抖现象。
  4. 小鼠足迹检测：
    注：进行本检测前，需在狭窄跑道（长约70 cm、宽约5 cm、高约5 cm的侧壁）底部预先放置吸水纸。
    1. 用一只手轻轻抓住小鼠，用刷子将墨水涂抹于其后肢。
    2. 将吸水纸平铺于狭窄跑道底部。
    3. 让小鼠在跑道内沿吸水纸从一端直线行走或奔跑至另一端。
    4. 每只小鼠重复此过程共三次，每次使用新的吸水纸。
    5. 测量前进方向上两个连续足印之间的距离。分析时不包括动物起始和结束阶段的前几个和后几个足印。

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结果

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根据本文所述方法，制备了50微克荧光标记寡核苷酸（FLO）与约850微克RVG肽以1:15摩尔电荷比（FLO : 肽）形成的复合物，并通过尾静脉单次注射。以非嗜神经性狂犬病病毒基质（RVM）肽与FLO的复合物作为递送对照。次日，分离小鼠脑组织和肝脏，制备单细胞悬液。在显微镜下观察细胞的绿色荧光。FLO-RVG复合物成功递送至脑细胞，在注射后最短一天内即可检测到绿色荧光，而在肝脏中未见荧光信号（图2B,2D）；而RVM肽介导的FLO则仅递送至肝脏，在脑细胞中未检测到荧光（图2A,2C）。

为了在小鼠脑内敲低miR-29，设计了针对miR-29的antagomir，并引入五个LNA修饰。使用不靶向任何miRNA的随机序列作为Antagomir对照（Antagomir-control）。将50微克Antagomir-control或Antagomir-29与约850微克RVG肽形成复合物，在连续3天内通过尾静脉注射给药，随后按照图1所示进行每日行为学检测。为达到最大敲低效果，复合物每日注射一次，连续注射3天。第4天不进行...

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讨论

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本文展示了一种广泛适用的方法，用于研究miRNA调控的影响。目前，大多数针对miRNA功能的体内研究通常依赖于构建基因敲除小鼠或表达miRNA海绵的转基因模型。大多数miRNA，即使是细胞类型特异性的miRNA，也在多个器官中表达。例如，最初被认为仅在造血系统中特异性表达的miRNA，由于小胶质细胞的存在，也在脑组织中表达。因此，即使采用细胞类型特异性的敲低策略——即在细胞类型特异性启动子控制下表达针对miRNA的反义分子——仍可能产生多效性效应。以miR-29家族miRNA为例，它们在脑、血细胞以及体内多个其他部位均有表达。因此，用于miRNA调控的遗传学工具适用范围有限，也不适用于药物开发或潜在治疗策略的测试。

通过简单的尾静脉注射即可递送 cargo，这使得该技术具有广泛的可及性。该方法还避免了使用慢病毒进行嗜神经递送。这一方法最初是为敲低嗜神经病毒而开发的，其三个功能域可进行模块化改造，从而实现细胞类型特异性的 miRNA 敲低，这三个功能域分别为细胞穿透肽、嗜神经肽和反义分子。例如，我们发现使用另一种特异性靶向 miR-29 的 antagomir 虽可...

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披露

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作者无任何利益冲突披露。

致谢

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感谢Souvik Maiti在设计antagomir方面的帮助。我们还感谢Rangeetha J. Naik、Rakesh Dey和Bijay Pattnaik在实验方法上的协助。本工作由印度科学与工业研究委员会（BSC0123）资助。HS、MV和RR感谢印度科学与工业研究委员会提供的博士后奖学金。MAS感谢印度大学拨款委员会提供的博士后奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
涡旋振荡器
动物固定器或去角锥形管
狭窄跑道长约70 cm，宽约5 cm，侧壁高约5 cm。
试剂
荧光标记寡核苷酸（siGLO）GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% 无菌D-葡萄糖
Antagomir-29Exiqon定制合成
Antagomir-对照Exiqon定制合成
神经肽RVGG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.定制合成>98% 纯度
神经肽RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.定制合成>98% 纯度
其他
棉球
温水
胰岛素注射器
吸水纸巾
墨水
刷子
消毒剂

参考文献

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标签

microRNA antagomir PCR

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