淀粉样蛋白-β（Aβ）注射动物模型可实现对特定数量和种类的Aβ片段进行给药，并减少各研究组内的个体差异。本方案描述了无需使用立体定位仪器即可进行脑室内（ICV）注射Aβ的方法，可在正常小鼠中诱导出类似阿尔茨海默病的行为异常。
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摘要
摘要
淀粉样蛋白-β（Aβ）是家族性和散发性阿尔茨海默病（AD）的主要病理介质。在AD患者的大脑中，可观察到Aβ寡聚体和斑块的进行性积聚。此类Aβ异常被认为会阻断长时程增强作用，损害突触功能，并引发认知缺陷。临床与实验证据表明，脑内Aβ水平的急性升高可导致类阿尔茨海默病表型的出现。因此，在许多情况下，有必要提供一份详细的操作方案，以描述如何通过脑室内（ICV）注射Aβ急性建立AD小鼠模型。本方案涵盖了Aβ注射小鼠实验的各个步骤，从多肽的制备到行为异常的检测。方案中简明地阐述了注射前的器械与动物准备、通过脑室内注射将Aβ注入小鼠大脑，以及评估认知障碍程度的过程，并重点提供了有效实施Aβ脑室内注射的操作要点。通过定向注射Aβ模拟AD的某些特征，研究人员可绕过衰老过程，专注于研究Aβ异常所引发的下游病理变化。
引言
由于淀粉样蛋白-β（Aβ）是阿尔茨海默病（AD）的病理特征，因此AD动物模型的开发主要集中于神经元中Aβ的过表达。由于淀粉样前体蛋白（APP）或早老素（PS）的突变会导致Aβ稳态失衡，最终引发家族性AD1，因此携带APP或PS基因突变的小鼠模型已被广泛接受。在众多转基因小鼠中，典型的模型包括：TG2576、PDAPP、APP/PS1和APP23。这些小鼠大脑中通常会出现Aβ聚集，并最终形成老年斑；斑块形成后伴随显著的认知功能障碍，表现为学习和记忆行为测试中的表现较差。这些能够自然模拟人类AD病理的转基因小鼠模型的建立，使我们能够监测疾病进展，从而为AD研究领域做出了重要贡献。然而，使用转基因小鼠成本高且耗时，因为小鼠需要数月时间才能形成Aβ斑块，而出现Aβ诱导的突触或行为异常则需要更长时间2,3。最初为克服转基因小鼠模型的不足而开发的非转基因模型，也因其独特优势而被广泛使用。可通过直接向脑内注射Aβ来建立病原体诱导的AD模型，而AD样认知缺陷也可通过其他化学或物理手段诱发，例如注射神经毒性化合物（如东莨菪碱）、在与认知相关脑区（如海马）诱导病灶，或造成皮层损伤4。然而，非病原性诱导的认知障碍并不能准确反映AD的基本病理生理机制，而仅能模拟其症状性结果。相比之下，病原体诱导的AD模型——即Aβ注射小鼠模型——不仅可表现出类似AD的行为异常，还能再现Aβ病理改变，而Aβ病理是家族性和散发性AD共有的特征。
尽管在脑组织中可视化Aβ斑块存在困难，但Aβ注射模型最大的优势在于其可控性，这使其成为阿尔茨海默病（AD）研究中颇具吸引力的模型。研究人员可以排除小鼠模型中的个体差异，从而避免在药物相关研究中产生错误数据。根据候选药物的作用机制，可实现及时的药物干预；具体而言，Aβ聚集抑制剂可在Aβ注射前给予。此外，由于包括个体差异在内的其他因素均被严格控制，研究者可以确定Aβ注射后出现的致病性改变源于Aβ暴露本身。
本方案详细生动地描述了如何在不使用立体定位仪器的情况下，通过向正常小鼠脑室内注射 Aβ 来诱导类似阿尔茨海默病（AD）的表型。最大限度减少注射插入过程中对脑组织造成的损伤，对于防止结构损伤以及损伤引发的炎症至关重要。若小鼠操作技术不熟练，可能导致意外的神经元损伤。此外，在注射过程中实现准确的角度和深度尤为关键，以避免常见错误。除了对脑室内注射进行详尽而生动的说明外，后续部分还展示了本方案所建立模型的可靠性。该方案可作为一种可靠且易于理解的工具，助力阿尔茨海默病研究，为最终为阿尔茨海默病领域带来有意义的发现提供重要基础。
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方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）以及韩国科学技术院（KIST，首尔，韩国）机构动物护理与使用委员会动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 动物准备
- 准备一组7周龄雄性ICR小鼠（或C57BL/6小鼠）。
- 让小鼠在运输后经历3-7天的适应期，以恢复稳态。通常每笼饲养4-5只小鼠，并维持环境温度为22-23 °C 湿度40%，12小时光照/12小时黑暗循环。提供水和食物 随意.
注意：适应过程至关重要，可使小鼠从运输应激中恢复，并适应新的饲养环境、食物、饮水、气味以及新笼具和光照周期。本实验中，小鼠饲养于屏障环境（SPF级）设施内的独立通风笼具（IVCs）中。 - 称量每只小鼠的体重，并排除体重偏离平均值±10%的个体。
- 将受试对象分为两组：溶剂注射组（Aβ(-)）和Aβ注射组（Aβ(+)）。若实验旨在评估某种候选药物的疗效，则将小鼠分为四组：（1）Aβ(-)/药物(-)，（2）Aβ(-)/药物(+)，（3）Aβ(+)/药物(-)，（4）Aβ(+)/药物(+)）。
2. Aβ 肽的制备
- 使用预冷的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）处理通过化学合成5或商业来源获得的Aβ肽，以溶解任何聚集体并使肽均一化6。
- 将Aβ/HFIP溶液在水浴超声仪中进行超声处理5分钟（室温），轻轻涡旋混匀，随后在室温下孵育30分钟。通过氮气吹干完全去除HFIP，并将均一化的Aβ肽于-80 °C保存备用。
- 制备Aβ单体：配制1 mM Aβ二甲基亚砜（DMSO）储备液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释10倍，得到含100 µM Aβ、10% DMSO和90% PBS的溶液。
- 制备Aβ寡聚体。
- 将Aβ单体溶液（含Aβ(1-42)或Aβ(1-40)）分别在37 °C孵育3天或7天（见步骤2.2）。
- 将Aβ溶液置于密封管中，放入含有湿润纸巾的密封袋内，以提供湿润环境，防止孵育期间水分蒸发。
- 通过未修饰蛋白质的光诱导交联结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证所制备的Aβ寡聚体6。
- 配制含10% DMSO的PBS对照溶液，用于溶剂脑室内注射（ICV）。
3. 注射器准备
- 准备一支带有26 G不锈钢针头的微量注射器，用于脑室内注射（ICV注射）。
- 将注射器及所有用于手术操作的器械一同放入高压灭菌器中进行灭菌。灭菌后，将器械置于紫外灯下照射20分钟。
- 用Parafilm封口膜包裹微量注射器针头，将其长度调整至3.8 mm，以确保向脑内注射时深度的最高准确性（图1A）。（对于B6小鼠，应将注射器针头调整至3.6 mm）。
注意：若Parafilm被压缩，会导致注射深度超过腹侧3.6 mm。为防止插入针头时Parafilm被压缩，应多次紧密缠绕针头。 - 用70%乙醇冲洗注射器内腔，重复两次。
- 将注射器及针头置于水浴超声仪中，在室温下超声处理30分钟。
- 用70%乙醇再次冲洗注射器内腔，重复两次。
- 用蒸馏水冲洗注射器，并在通风橱中彻底干燥超过30分钟。在开始Aβ注射前，将洁净的注射器置于紫外灯下照射20分钟。
4. Aβ注射小鼠模型制备
注意：使用消毒剂清洁操作区域以维持无菌条件，并使用70%乙醇和紫外照射对用于脑室内注射的所有外科器械进行灭菌。
- 在脑室内注射前，通过腹腔注射混合物使小鼠麻醉，混合物成分为赛拉嗪（20 mg/kg）和替来他明·盐酸盐/唑拉西泮·盐酸盐（80 mg/kg）。将小鼠置于加热垫上以维持其体温，并通过足部夹捏反应确认麻醉深度是否充分。
- 向双眼滴加无菌磷酸盐缓冲液（PBS），以防止手术过程中角膜干燥（图1B）。
- 准备两面镜子，在其表面绘制多条垂直直线，以便在难以垂直进针时作为参考。
- 将一面镜子（M1）紧贴小鼠身体放置，另一面镜子（M2）置于小鼠头部前方。保持M1与小鼠两眼之间假想中线平行，并使M2与M1垂直，从而使两个平面形成90°夹角（图1C）。若操作者为右利手，则将M1置于小鼠左侧；若为左利手，则将M1置于小鼠右侧。
- 用70%乙醇喷洒小鼠前额中部，并用干燥棉签擦拭。避免润湿过大区域，以防酒精蒸发导致体温下降。
- 使用干净棉签蘸取2%氯己定溶液擦拭同一区域。分别重复使用酒精和氯己定擦拭三次。
注意：如有必要，可剃除小鼠前额毛发，以尽量减少污染风险。 - 定位前囟点（bregma）。
- 用拇指和食指紧紧按压小鼠两眼正上方的前额皮肤，力度以使双眼轻微突出为宜。向后牵拉皮肤，使前额绷紧，从而减少皮肤下颅骨的移动。
- 构建一个假想三角形，其三个顶点分别为小鼠的两只眼睛以及拇指与食指接触的位置，该接触点即为前囟点（图1B，红色箭头：bregma）。
- 使用测量尺确定注射位点：位于前囟点后方 -1.0 ± 0.06 mm，矢状缝外侧 1.8 ± 0.1 mm，进针深度为 2.4 mm（图1D，蓝色星号：双侧半球的注射点）。（对于B6小鼠：后方 -0.9 mm，外侧 1.7 mm，深度 2.2 mm）
- 用10 µl Aβ溶液或对照溶剂充满注射器，并留有过量液体，以避免意外注入空气。
- 将注射器置于注射位点（见步骤4.7所述），使其与注射平面垂直。从固定视角观察，调整注射器位置，使其在两面镜子中的反射像均与镜面上绘制的直线对齐（图1C）。
- 开始插入针头，直至包裹针头的Parafilm膜接触皮肤表面。
- 保持持注射器的手稳定，用另一只手在5秒内缓慢注入5 µl Aβ溶液或对照溶剂，过程中不得停顿。确保注射器始终保持垂直。注射完成后，等待3至5秒再拔出注射器，以利于液体扩散。
- 维持初始三角定位姿势，施加适度压力，防止颅骨发生不必要的移动。拔出注射器时不得倾斜。
- 将注射Aβ的小鼠置于加热垫上恢复，并保持其胸卧位。在小鼠恢复意识前不得离开看护，且在完全恢复前不得将其放回含有非手术小鼠的笼具中。
- 按照步骤3.3–3.6清洗注射器。
- 术后连续5–7天监测小鼠活动能力，并观察是否有感染或疾病迹象。
图1. 向侧脑室（ICV）区域注射 Aβ。 （A）包裹 Parafilm 的注射器针头与未改装的注射器针头对比；（B）滴加 PBS 至眼睛以防止干燥；以拇指、食指以及小鼠双眼构成的三角形，以及一条假想的中线（与两眼距离相等）；（C）两面镜子（M1 和 M2），其表面绘有多条垂直线，用于辅助将注射针头垂直插入；（D）在小鼠两侧半球上的注射位点（以蓝色星号标示，位于前囟后 -1.0 ± 0.06 mm，矢状向 1.8 ± 0.1 mm 处）构成的三角形；绿色箭头：Parafilm，红色箭头：前囟 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 通过Y迷宫和脑组织分析验证Aβ注射效果
- 通过 Y 型迷宫实验评估 Aβ 注射小鼠的工作记忆3,7,8
- 注射后等待 3 天，以确保记忆缺陷出现。
- 使用一个黑色塑料制成的 Y 型迷宫进行实验，迷宫包含三个相同的臂，分别标记为 A、B 和 C，各臂从迷宫中心以 120° 角向外延伸（宽度 × 长度 × 高度，10 cm × 40 cm × 12 cm）。
- 将小鼠置于起始臂（臂 A），允许其在迷宫中自由探索 8 分钟。
- 记录小鼠进入各臂的次数，并计算每只小鼠的交替率3,9。
- 直接检查死后脑组织，确认注射是否准确靶向脑室（ICV）区域。
- 按照第 4.1 节所述方法对小鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 将小鼠断头，使用手术剪去除皮肤以暴露颅骨，并清除颅骨上的组织和肌肉。
- 在枕骨缝（顶骨与间顶骨之间）处进行切割，注意不损伤脑组织；随后移除枕骨和间顶骨，再移除顶骨和额骨；使用镊子去除颅骨，并通过提起脑膜将脑组织从颅腔中分离。
- 用预冷的无菌生理盐水清洗脑组织，然后使用手术刀沿冠状面切取脑中的脑室区域（图 2）。
- 根据脑组织上针头穿刺的痕迹确认注射部位（图 2）；检查针道是否到达任一脑室。若针道未触及或穿过脑室，则在实验结果分析中排除该样本的数据。
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结果
本部分展示了通过确认 Aβ 聚集以及 Y 形迷宫评估记忆缺陷所能获得的结果示例。使用全长 Aβ(1-42) 多肽（含 42 个氨基酸），制备出 Aβ 单体、寡聚体和纤维的混合物（图 3）。经过 HFIP 诱导的单体化步骤后，获得了相对均一的单体（泳道 B）。经过 7 天孵育后，形成了多种尺寸的 Aβ 聚集体（泳道 C）。在 Aβ 寡聚体形式中，三聚体和四聚体为主要组分。通过 Y 形迷宫实验中的交替行为评估 Aβ 注射小鼠的空间工作记忆。在允许每只小鼠自由探索迷宫时，记录其臂选择序列和总入臂次数。认知能力越完整，小鼠越倾向于进入最近较少访问的臂，从而交替选择不同的臂。Aβ 注射小鼠组表现出显著更低的交替率，表明出现了认知缺陷（图 4）。
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讨论
本方案中最重要的步骤是脑室（ICV）注射Aβ。该方案旨在无需使用立体定位仪的情况下，将Aβ注射至小鼠的脑室区域11,12。在正式实验开始前，应先使用蓝色染料代替Aβ进行一系列预实验注射，以熟练掌握注射技术。注射完成后，必须立即检查染料注射是否准确到位。小心取出脑组织，观察相应区域是否被染成蓝色。染色条带应达到脑室区域的深度，但不应超过该深度。建议注射成功率至少达到90%，通常在完成50次或更多脑室注射后可达到此水平。在进行脑室注射时，应避免损伤血管，尤其注意不要将染料注入矢状窦（靠近前囟零点处）。
在注射 Aβ 后，通过 Y 型迷宫行为学实验观察到，Aβ 注射组与对照组之间在记忆障碍方面存在统计学显著差异。可采用多种类型的行为学实验来评估认知障碍的程度，例如 Morris 水迷宫13、物体识别、被动回避实验以及恐惧条件反射实验。Morris 水迷宫用于检测海马依赖的空间记忆缺陷，而恐惧条件反射则用于测试海马依赖的联想学习能力以及杏仁核-海马之间的功能联系。对特定物体的识别适用于评估与阿尔茨海默病（AD）相关的认知功能障碍，被动回避实验可用...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国卫生科技研发计划资助&D项目，由韩国健康产业开发院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 & 福利部，大韩民国（项目编号：H14C04660000）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICR 小鼠 | Orientbio | 雄性，6-8 周龄，体重 27-29 g | |
| C57BL/6 小鼠 | Orientbio | 雄性，6-8 周龄，体重 21-23 g | |
| Amyloid-beta1-42 | 本实验室合成 | 储存浓度：1 mM/DMSO，注射浓度：100 μM/10% DMSO 和 90% PBS | |
| 脑室内注射针头（26s 规格） | Hamilton | 80308 | |
| 伊文思蓝染料（EBD） | abcamBIochemicals | ab120869 | PBS 中 1% EBD |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II 梯度 PAGE 分析试剂盒 | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% 凝胶 |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra 标准蛋白 | Bio-Rad | 161-0377 | |
| 银染试剂盒 | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet 饲料 | Orientbio | 5053 |
参考文献
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