淀粉样蛋白-β（Aβ）注射动物模型可实现对特定数量和种类的Aβ片段进行给药，并减少各研究组内的个体差异。本方案描述了无需使用立体定位仪器即可进行脑室内（ICV）注射Aβ的方法，可在正常小鼠中诱导出类似阿尔茨海默病的行为异常。
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摘要
摘要
淀粉样蛋白-β（Aβ）是家族性和散发性阿尔茨海默病（AD）的主要病理介质。在AD患者的大脑中，可观察到Aβ寡聚体和斑块的进行性积聚。此类Aβ异常被认为会阻断长时程增强作用，损害突触功能，并引发认知缺陷。临床与实验证据表明，脑内Aβ水平的急性升高可导致类阿尔茨海默病表型的出现。因此，在许多情况下，有必要提供一份详细的操作方案，以描述如何通过脑室内（ICV）注射Aβ急性建立AD小鼠模型。本方案涵盖了Aβ注射小鼠实验的各个步骤，从多肽的制备到行为异常的检测。方案中简明地阐述了注射前的器械与动物准备、通过脑室内注射将Aβ注入小鼠大脑，以及评估认知障碍程度的过程，并重点提供了有效实施Aβ脑室内注射的操作要点。通过定向注射Aβ模拟AD的某些特征，研究人员可绕过衰老过程，专注于研究Aβ异常所引发的下游病理变化。
引言
由于淀粉样蛋白-β（Aβ）是阿尔茨海默病（AD）的病理特征，因此AD动物模型的开发主要集中于神经元中Aβ的过表达。由于淀粉样前体蛋白（APP）或早老素（PS）的突变会导致Aβ稳态失衡，最终引发家族性AD1，因此携带APP或PS基因突变的小鼠模型已被广泛接受。在众多转基因小鼠中，典型的模型包括：TG2576、PDAPP、APP/PS1和APP23。这些小鼠大脑中通常会出现Aβ聚集，并最终形成老年斑；斑块形成后伴随显著的认知功能障碍，表现为学习和记忆行为测试中的表现较差。这些能够自然模拟人类AD病理的转基因小鼠模型的建立，使我们能够监测疾病进展，从而为AD研究领域做出了重要贡献。然而，使用转基因小鼠成本高且耗时，因为小鼠需要数月时间才能形成Aβ斑块，而出现Aβ诱导的突触或行为异常则需要更长时间2,3。最初为克服转基因小鼠模型的不足而开发的非转基因模型，也因其独特优势而被广泛使用。可通过直接向脑内注射Aβ来建立病原体诱导的AD模型，而AD样认知缺陷也可通过其他化学或物理手段诱发，例如注射神经毒性化合物（如东莨菪碱）、在与认知相关脑区（如海马）诱导病灶，或造成皮层损伤4。然而，非病原性诱导的认知障碍并不能准确反映AD的基本病理生理机制，而仅能模拟其症状性结果。相比之下，病原体诱导的AD模型——即Aβ注射小鼠模型——不仅可表现出类似AD的行为异常，还能再现Aβ病理改变，而Aβ病理是家族性和散发性AD共有的特征。
尽管在脑....
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方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）以及韩国科学技术院（KIST，首尔，韩国）机构动物护理与使用委员会动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 动物准备
- 准备一组7周龄雄性ICR小鼠（或C57BL/6小鼠）。
- 让小鼠在运输后经历3-7天的适应期，以恢复稳态。通常每笼饲养4-5只小鼠，并维持环境温度为22-23 °C 湿度40%，12小时光照/12小时黑暗循环。提供水和食物 随意.
注意：适应过程至关重要，可使小鼠从运输应激中恢复，并适应新的饲养环境、食物、饮水、气味以及新笼具和光照周期。本实验中，小鼠饲养于屏障环境（SPF级）设施内的独立通风笼具（IVCs）中。 - 称量每只小鼠的体重，并排除体重偏离平均值±10%的个体。
- 将受试对象分为两组：溶剂注射组（Aβ(-)）和Aβ注射组（Aβ(+)）。若实验旨在评估某种候选药物的疗效，则将小鼠分为四组：（1）Aβ(-)/药物(-)，（2）Aβ(-)/药物(+)，（3）Aβ(+)/药物(-)，（4）Aβ(+)/药物(+)）。
2. Aβ 肽的制备
- 使用预冷的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）处理通过化学合成5或商业来源获得的Aβ肽，以溶解任何聚集体并使肽均一化<....
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结果
本部分展示了通过确认 Aβ 聚集以及 Y 形迷宫评估记忆缺陷所能获得的结果示例。使用全长 Aβ(1-42) 多肽（含 42 个氨基酸），制备出 Aβ 单体、寡聚体和纤维的混合物（图 3）。经过 HFIP 诱导的单体化步骤后，获得了相对均一的单体（泳道 B）。经过 7 天孵育后，形成了多种尺寸的 Aβ 聚集体（泳道 C）。在 Aβ 寡聚体形式中，三聚体和四聚体为主要组分。通过 Y 形迷宫实验中的交替行为评估 Aβ 注射小鼠的空间工作记忆。在允许每只小鼠自由探索迷宫时，记录其臂选择序列和总入臂次数。认知能力越完整，小鼠越倾向于进入最近较少访问的臂，从而交替选择不同的臂。Aβ 注射小鼠组表现出显著更低的交替率，表明出现了认知缺陷（图 4）。
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讨论
本方案中最重要的步骤是脑室（ICV）注射Aβ。该方案旨在无需使用立体定位仪的情况下，将Aβ注射至小鼠的脑室区域11,12。在正式实验开始前，应先使用蓝色染料代替Aβ进行一系列预实验注射，以熟练掌握注射技术。注射完成后，必须立即检查染料注射是否准确到位。小心取出脑组织，观察相应区域是否被染成蓝色。染色条带应达到脑室区域的深度，但不应超过该深度。建议注射成功率至少达到90%，通常在完成50次或更多脑室注射后可达到此水平。在进行脑室注射时，应避免损伤血管，尤其注意不要将染料注入矢状窦（靠近前囟零点处）。
在注射 Aβ 后，通过 Y 型迷宫行为学实验观察到，Aβ 注射组与对照组之间在记忆障碍方面存在统计学显著差异。可采用多种类型的行为学实验来评估认知障碍的程度，例如 Morris 水迷宫13、物体识别、被动回避实验以及恐惧条件反射实验。Morris 水迷宫用于检测海马依赖的空间记忆缺陷，而恐惧条件反射则用于测试海马依赖的联想学习能力以及杏仁核-海马之间的功能联系。对特定物体的识别适用于评估与阿尔茨海默病（AD）相关的认知功能障碍，被动回避实验可用.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国卫生科技研发计划资助&D项目，由韩国健康产业开发院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 & 福利部，大韩民国（项目编号：H14C04660000）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ICR 小鼠 | Orientbio | 雄性，6-8 周龄，体重 27-29 g | |
| C57BL/6 小鼠 | Orientbio | 雄性，6-8 周龄，体重 21-23 g | |
| Amyloid-beta1-42 | 本实验室合成 | 储存浓度：1 mM/DMSO，注射浓度：100 μM/10% DMSO 和 90% PBS | |
| 脑室内注射针头（26s 规格） | Hamilton | 80308 | |
| 伊文思蓝染料（EBD） | abcamBIochemicals | ab120869 | PBS 中 1% EBD |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II 梯度 PAGE 分析试剂盒 | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% 凝胶 |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra 标准蛋白 | Bio-Rad | 161-0377 | |
| 银染试剂盒 | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet 饲料 | Orientbio | 5053 |
参考文献
- Kam, T. I., Gwon, Y., Jung, Y. K. Amyloid beta receptors responsible for neurotoxicity and cellular defects in Alzheimer's disease. Cell Mol Life Sci. 71, 4803-4813 (2014).
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disea....
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