本文介绍的头固定小鼠胡须信号瞬目条件反射制备方法，可在允许小鼠在圆柱形跑轮上自由行走的同时，精确刺激特定胡须。将胡须刺激作为条件刺激（CS），与眼周电击非条件刺激（US）配对，可在该装置上实现可靠的联想学习。
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本文内容
摘要
摘要
眨眼条件反射是研究学习与记忆神经机制的常用范式。为了更好地利用现有的大量细胞水平研究学习与记忆的科学方法，拥有一个稳定的颅骨平台非常理想。由于小鼠通常难以耐受束缚，因此通常在它们于实验箱内自由活动时进行训练。条件刺激（CS）和非条件刺激（US）信息通过连接到小鼠头部的束缚线缆传递，并记录眨眼反应。在本文介绍的头部固定装置中，小鼠可在头部被固定的条件下按其意愿自由奔跑，从而便于实验操作。使用该训练装置可实现可靠的眨眼反应条件化，该装置支持以胡须刺激作为条件刺激（CS），以眼周电刺激作为非条件刺激（US），并通过分析眼睑的肌电图（EMG）活动来检测眨眼反应。
引言
眨眼条件反射是一种经典条件反射形式，也是研究联想学习与记忆神经机制的模型系统。该现象已在多种物种中得到研究，包括人类、兔子、猫、大鼠和小鼠。该实验范式包含两个配对呈现的刺激：一个中性的条件刺激（CS；例如，声音、闪光或胡须刺激），以及一个显著的非条件刺激（US；例如，对眼部的气流刺激或眼周电击）。非条件刺激会引发一种非条件性的、反射性的眨眼反应（即，UR）。经过多次CS与US的配对呈现后，受试者逐渐学会将条件刺激与非条件刺激关联起来。这种学习表现为条件反应（CR）的出现，即仅由条件刺激单独引发、且发生在非条件刺激呈现之前的眨眼反应。
痕迹性眨眼条件反射包括一个数 hundred 毫秒的无刺激间歇期，该间歇期将条件刺激（CS）和非条件刺激（US）分隔开（图1）。由于痕迹性条件反射需要个体意识到刺激之间的关联性，因此它属于陈述性学习的一种形式1。这一时间间隔要求动物在大脑前脑区域（如海马）中保留CS的神经“痕迹”，从而使US与CS建立关联1-6。除了前脑区域外，痕迹性条件反射还依赖于小脑的功能7。
因此，眨眼条件反射是研究记忆多个方面的有用范式，包括习得、巩固和提取。在进行眨眼条件反射实验期间，对照组动物会以随机顺序接受非配对刺激，以检测是否存在伪条件作用或敏感化反应，这些....
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方案
所有涉及小鼠的操作均依照美国国立卫生研究院发布的指南，并根据西北大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 圆柱体（图2A）
- 按照 Chettih 等 和 Heiney 等 的方法，使用一根长泡沫圆柱体制作圆柱体14-15。截取一段10 cm长的圆柱体，并在其中心钻孔，以安装直径为12.7 mm（0.5 in.）的金属轴。按照 Heiney 等 的方法，将带轴的圆柱体安装在金属光学面包板上，或其他支撑结构（例如，有机玻璃）上15。
- 在圆柱体两侧各竖直安装一根直径为12.7 mm的金属杆。
- 将两个直角支架固定在金属杆上。
- 通过直角支架固定另外两根金属杆（长5 cm，直径12.7 mm）。将这两根杆的末端削成斜面，并调整其高度，使其末端位于圆柱体中心的正上方（图2G）。
- 在已调平的杆末端钻孔并攻螺纹，以安装两颗4-40机械螺钉，用于固定连接器的翼部（图2G）。
2. 组装微须刺激系统（图2B）
- 从普通梳子上截取一段10个齿的梳齿部分。
- 在梳子顶部切一个约2-3 mm宽、约5 m....
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结果
8至10周龄雄性C57Bl6/J小鼠在固定头部的圆柱形跑步机装置上进行痕迹性瞬目条件反射训练。其中8只小鼠接受配对的条件刺激（CS）与非条件刺激（US）呈现（条件化组），9只小鼠接受非配对的CS与US呈现（假条件化组）。
显示了一只经条件化处理的小鼠产生条件化反应的典型肌电图记录 图3 和 4每次试验的肌电图记录均经过整流，并以10毫秒的时间常数进行积分。 图5 显示了每只小鼠在10个实验阶段中，条件刺激（A）和伪条件刺激（B）两种情况下，所有试验中整流并积分后的EMG反应轨迹的平均结果。条件反应的演变过程可见于 图 5A，且反应在接近US出现时逐渐增强。这种变化在伪条件化反应中未观察到 图5B.
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讨论
经典的眨眼条件反射是一种关联学习形式，是研究学习与记忆神经基础的有用工具。以往在小鼠等啮齿类动物中进行眨眼条件反射实验时，通常使用允许动物自由活动的实验箱。而采用 Chettih et al. 和 Heiney et al. 所描述、并由 Siegel et al. 最近应用于光诱发的痕迹型眨眼条件反射实验中的装置，建立了一种头固定的小鼠眨眼条件反射准备方法，具有多项优势，例如可实现过去无法开展或受限的某些实验操作（如 in vivo 双光子钙成像）14-16。此类准备方法还便于结合其他技术，例如使用四电极阵列进行 in vivo 电生理记录。由于小鼠在被束缚时容易产生应激反应，该头固定装置的设计旨在固定头部的同时，尽量减少对动物的束缚程度。尽管该准备方法允许小鼠在圆柱形跑步机上自由行走，但也有研究者成功地在固定平台上的头固定小鼠中采集到了行为数据24。
然而，在使用头部固定圆筒系统时会出现一些问题。一个问题是，当最初将未经训练的小鼠放置在圆筒上时，.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由美国国防部（W81XWH-13-01-0243）和美国国立卫生研究院（R37 AG008796）资助。我们感谢西北大学机械加工车间的 Alan Baker 制作了固定头部的圆筒装置。我们感谢 Shoai Hattori 博士在 MATLAB 和 Solidworks 方面提供的指导。我们感谢 John Power 博士提供的用于控制实验的 LabView 软件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Exervo TeraNova 泡沫轴 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | 用于圆柱体 |
| 有机玻璃（Plexiglas） | 定制；厚度1 cm | ||
| 金属棒（直径12.7 mm） | 定制 | ||
| 4-40 机械螺钉（长0.25 英寸） | Amazon Supply | B00F33Q8QO | 用于圆柱体 |
| 经典设计发梳 | Conair | 93505WG-320 | 用于胡须刺激 |
| 双层矩形弯曲致动器 | Piezo Systems | T220-A4-303X | 用于胡须刺激 |
| 焊料和助焊剂套件 | Piezo Systems | MSF-003-NI | 用于胡须刺激 |
| 磁性底座 | Thor Labs | MB175 | 用于胡须刺激 |
| 磁性底座用螺纹杆 | 定制 | ||
| 基于Electronic Connector Corp.的221系列尼龙条连接器的条带 | 定制，参考Weiss和Disterhoft，2008年 | ||
| TO-220型晶体管 | Amazon Supply | B0002ZPZYO | 用于连接器；用于翼片 |
| Relia-Tac 插座 | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | 用于连接器 |
| Relia-Tac 插针 | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | 用于头件 |
| 0-80不锈钢机械螺钉（长1英寸） | Amazon Supply | B000FN68EE | 锁紧螺钉 |
| 0-80不锈钢机械螺钉六角螺母（厚5/32英寸） | Amazon Supply | B000N2TK7Y | 锁紧螺钉头 |
| Loctite 超级胶水-液体 | Loctite | 1365896 | 氰基丙烯酸胶；用于锁紧螺钉 |
| 快干环氧树脂 | Ace Hardware | 18613 | 用于连接器和胡须刺激系统 |
| 以太网电缆导线 | 可拆分以太网电缆，使用其中单根导线作为连接器导线 | ||
| 聚酰亚胺涂层不锈钢导线（长2 英寸，直径0.005英寸） | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | 用于头件、肌电图（EMG）和电刺激导线 |
| 未涂层不锈钢导线（直径0.005 英寸） | AM Systems | 792800 | 用于头件，接地导线 |
| Tenma 可变自耦变压器 | Tenma | 72-110 | 用于胡须刺激；通过变阻器调节弯曲致动器的电流 |
| 放大器 | A-M Systems | 1700 | 用于滤波和放大肌电图（EMG）信号的放大器 |
| WPI A385R 刺激隔离器 | World Precision Instruments | 31405 | 用于电刺激 |
| Isothesia（异氟烷） | Henry Schein: 动物健康 | 50031 | 用于手术；麻醉剂 |
| Buprenex 注射用CIII类药品 | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | 用于手术；镇痛剂 |
| Akwa Tears：润滑性眼用软膏 | Akorn | NDC 17478-062-35 | 人工泪液软膏，用于麻醉期间防止眼睛干燥 |
| 聚维酮碘消毒垫 | PDI | NDC 10819-3883-1 | 用于手术；消毒剂 |
| 酒精消毒垫 | 可从任何标准药店购买 | ||
| 不锈钢外科手术刀柄（3号） | Integra Miltex | 4-7. | 用于手术 |
| 不锈钢外科手术刀片 | Integra Miltex | 4-310 或 4-315 | 用于手术；10号或15号手术刀片 |
| 3% 过氧化氢 | 可从任何标准药店购买 | ||
| 微型夹 | Roboz | RS-5459 | 用于手术，固定皮肤 |
| 00-90不锈钢机械螺钉（长0.0625 英寸） | Amazon Supply | B002SG89X4 | 用于手术，缠绕接地导线 |
| 专业旋转工具 | Walnut Hollow | 29637 | 手钻，用于手术中在颅骨上钻孔 |
| 倒锥形钻头 | Roboz | RS-6282C-34 | 倒锥形钻头，34号；用于手术中在颅骨上钻孔 |
| 雕刻切削钻头 | Dremel | 106 | 雕刻切削钻头；1.6 mm钻头；用于手术中在颅骨上钻孔 |
| C&B Metabond-Quick! 水泥系统 "B" 快速基质 | Parkell | S398 | 用于手术；粘接固位水泥系统；防止头件脱落的关键材料 |
| C&B Metabond-Quick! 水泥系统 透明L-粉末 | Parkell | S399 | 用于手术；粘接固位水泥系统；防止头件脱落的关键材料 |
| C&B Metabond-Quick! 水泥系统 "C" 通用TBB催化剂 0.7 ml | Parkell | S371 | 用于手术；粘接固位水泥系统；防止头件脱落的关键材料 |
| C&B Metabond-Quick! 水泥系统 带温度指示条的陶瓷混合皿 | Parkell | S387 | 用于手术；粘接固位水泥系统；防止头件脱落的关键材料 |
| 瑞士镊子，型号#5 | World Precision Instruments | 504506 | 用于手术 |
| Puritan 棉签 | VWR International | 10806-005 | 用于手术 |
| Dental Caulk Grip 水泥套件 | Dentsply | 675570 | 用于手术；牙科水泥 |
参考文献
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vande....
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