通过增强暗场显微镜与高光谱成像技术鉴定组织学样本中的金属氧化物纳米颗粒

摘要

增强暗场显微镜结合光谱成像与光谱图谱分析，能够以高于传统方法的速度和准确性，对组织学样本中的纳米材料进行筛选、定位和鉴定。本文旨在提供在组织学样本中对金属氧化物纳米颗粒进行暗场成像和高光谱图谱分析的方法。

摘要

纳米材料在工业、制造业和生物医学研究中的应用日益广泛。因此，对能够辅助识别、定位和表征生物样品中纳米级材料的工具与技术的需求不断增长。目前可用的方法（如电子显微镜）通常资源消耗较大，导致大多数科研机构难以负担其使用成本。增强型暗场显微镜结合高光谱成像系统可能为这一瓶颈提供解决方案，可实现对组织学样品中纳米颗粒的快速且成本较低的表征。该方法不仅支持高对比度的纳米级成像，还能实现纳米材料的识别。在该技术中，组织学组织样品的制备方式与常规光学显微镜样品相同。首先分析阳性对照样品，以生成参考光谱，从而实现对样品中目标材料的检测。同时分析不含目标材料的阴性对照样品，以提高特异性（减少假阳性结果）。随后，可通过高光谱显微成像方法及相应软件对样品进行成像与分析，或将样品光谱与上述参考光谱进行比对，从而生成目标材料在样品中分布位置的图谱。该技术尤其适用于具有高度特异性反射光谱的材料（如贵金属），但也适用于其他材料，例如类金属氧化物。该方法可提供仅通过传统组织学手段难以获得的信息；尽管电子显微技术可能具备更高的灵敏度和分辨率，但其资源消耗远高于光学显微镜，且耗时更长。

引言

随着纳米材料在各种工业和应用领域中的使用日益增加，人们需要比传统方法（如电子显微镜）更快速、更经济且更便捷的纳米级成像与表征技术。为了观察纳米颗粒（NP）与细胞、组织及生命系统的相互作用，已采用多种光学技术，包括微分干涉差（DIC）显微镜¹以及基于渐逝场的方法，如全内反射（TIR）或近场扫描光学显微镜（NSOM）^2,3。然而，这些属于高端分析技术，大多数非专业实验室难以获得⁴。电子显微镜，包括透射电子显微镜（TEM），也已被用于研究纳米颗粒与细胞的相互作用^5,6,7,8。高角度环形暗场（HAADF）扫描透射电子显微镜已被用于研究纳米颗粒与病毒的相互作用⁹。共聚焦显微镜是另一种常用于研究纳米颗粒-细胞相互作用的技术¹⁰。

近年来，基于暗场的高光谱成像（HSI）技术已被用作研究生物基质中纳米颗粒（NPs）的一种有前景的分析工具¹¹。HSI 系统可生成空间和光谱数据的三维表示，称为高光谱立方体或数据立方体¹²。光谱变化的空间图可用于材料识别。已知材料的光谱特征可被生成并用作参考谱库，以与未知样品进行比对。HSI 系统的主要优势之一是能够将成像与光谱学相结合，从而确定未知纳米颗粒在体内（in vivo）或离体（ex vivo）的位置与分布，并将其与已知的、成分相似的参考颗粒相关联。

与传统成像技术相比，使用高光谱成像（HSI）系统具有多项优势：所需样品制备步骤极少；样品制备过程通常具有非破坏性；图像采集与分析速度更快；该技术成本效益高¹³；并且更容易实现对混合成分和/或复杂基质中化合物的空间分布与分析¹⁴。

对于涉及珍贵样品的纳米材料研究，最重要的考虑因素之一是能否采用一种非破坏性成像方法，从而有可能通过一种或多种方法对样品进行重复检测。进行重复或多种分析的目的在于构建综合性的数据集，而这些数据无法通过单一方法获得。在这一方面，研究样品的光学特性是分析样品最安全的方式。通过使用增强暗场显微镜（EDFM）和高光谱成像（HSI）系统研究样品的光学响应——主要是反射率，同时也包括吸收率和透射率——可实现对特征的识别与表征¹⁵。潜在的表征终点包括对纳米颗粒或团聚体的相对尺寸和形状的评估，以及纳米颗粒在样品内部分布情况的分析。

本文中，我们描述了专门用于通过基于像素光谱匹配算法（即光谱角制图，SAM）的高光谱成像（HSI）系统，在死亡后组织中定位金属氧化物纳米颗粒的成图方法。我们选择这一特定应用，是因为其有望补充当前及未来的 体内 纳米毒理学研究，其中使用动物模型评估暴露于工程纳米材料对健康的影响。该方法的应用还可为利用组织或动物模型的纳米尺度药物递送研究提供信息。特别是，可利用该系统研究纳米颗粒在器官和组织中的吸收、分布、代谢与排泄过程。目前，多种应用正在被探索用于生物医学研究。¹¹.

该方法可用于评估暴露于多种元素成分纳米颗粒的不同生物样本（如各类组织类型、支气管肺泡灌洗样本和血涂片）^16-19此外，该方法还可用于研究纳米颗粒的生物分布 体内 和 体外，这在纳米尺度药物递送研究中具有重要意义¹¹除了生物样本外，EDFM 和 HSI 还可用于评估环境样本（如废水）中的纳米颗粒²⁰职业暴露评估也可受益于该技术的应用，因为它可用于评估个人防护装备在防止纳米颗粒穿透方面的有效性。此外，研究团队目前正在开发类似的EDFM和HSI方案，用于分析职业暴露评估中收集的纳米颗粒滤膜样品。尽管不同类型样品在EDFM和HSI前的制备方法可能有所不同，但关键在于样品的制备方式应确保其能够被光学系统清晰成像。通常情况下，样品制备应遵循传统明场显微镜观察的要求。目前市面上已有多种高光谱成像系统可供选择。¹¹.

方案

动物实验方案已获得研究人员合作机构——石溪大学机构动物护理和使用委员会的批准。 本文所用具体材料和设备的清单见表1。

1. 组织样本的制备

1. 按照先前描述的方法^21-23，制备暴露于金属氧化物纳米颗粒的动物组织，用于组织学或免疫组织化学染色。

2. 成像

1. 初始化显微镜
   注意：本研究使用了一台科研级显微镜，配备高性能暗场光源、电动XY载物台控制器、14位深度高光谱相机以及多个物镜（10X空气物镜、40X空气物镜、100X油浸物镜）。本系统在100X（油浸）放大倍数下具有64 nm的空间分辨率。本研究所用的聚光镜具备科勒照明和临界照明功能，可将高度准直的光线以倾斜角度聚焦于样品上。
   1. 接通并开启光源、XY载物台控制器、光学相机（用于暗场成像）、高光谱相机及计算机系统。将光源功率设为75%；将载物台升至最高位置；将导光管连接至聚光镜以增强暗场成像效果，或连接至显微镜背面的准直器用于反射式明场成像。
      注意：将光源设为75%功率可确保整个视场内所有像素获得充分且均匀的照明，既增强了较暗像素的亮度，又保持了明暗像素之间的对比度。
   2. 将聚光镜升至工作位置。小心地在聚光镜镜头上滴加3–5滴A型浸油，避免产生气泡。若形成气泡，需擦除油滴后重新涂抹。
   3. 将载玻片置于载物台上。缓慢提升聚光镜，直至浸油与载玻片接触。当油与载玻片接触时，照明环会迅速变亮，此现象可被明显观察到。
2. 安装10X物镜。通过目镜观察，对焦并调节聚光镜。
   1. 通过粗调焦旋钮上下移动载物台，直至亮度达到最大。
   2. 通过聚光镜调节旋钮上下移动聚光镜，直至找到最大亮度。尝试在视场中形成尽可能明亮的中心光斑。
   3. 根据需要调节聚光镜对中旋钮，将亮斑居中。
   4. 使用细调焦旋钮使亮斑清晰对焦。更换物镜以获得不同放大倍数时，需重新调整焦平面。使用100X物镜时，需在盖玻片上滴加一滴浸油以增强图像质量，并避免物镜镜头受损。
3. 采集图像
   1. 使用载物台控制器寻找感兴趣区域。该区域由实验需求决定。典型特征是与周围区域具有高对比度，因为富含金属氧化物纳米颗粒的区域通常比不含颗粒的区域更亮。
   2. 使用细调焦旋钮将该区域对焦，并根据需要调节聚光镜对焦，以平衡照明。在视场中获得一个高对比度、轮廓清晰的区域。
   3. 确定将采集的图像（用于光学相机）或数据立方体（用于高光谱相机）及其采集顺序。通常使用10X空气物镜、40X空气物镜和100X油浸物镜获取光学图像，并使用100X油浸物镜获取相应的高光谱图像（HSI）数据立方体。
      1. 打开光学成像软件。点击菜单栏中的“设置”。选择“图像捕获按钮”作为捕获事件。选择存储图像格式（本实验使用TIFF格式）；指定文件名；浏览并选择存储图像的文件夹；保留默认延时设置；点击“确定”。
      2. 在“曝光”菜单中选择可生成最高对比度图像的曝光参数（本研究使用0.0%的水平、3.0 dB的增益和35 ms的快门时间）。
      3. 点击菜单栏中的“图像”按钮采集图像。通过更换显微镜物镜，采集多个低倍率暗场图像以及高倍率图像，以提供上下文信息。
         注意：应以与高光谱相机采集数据立方体相同的放大倍数采集光学图像，因为这些光学图像通常具有更大的视场和更佳的视觉效果，便于后续目视检查。对于后续将进行光谱分析的数据立方体，必须使用一致的放大倍数，因为更换物镜可能改变显微镜光学系统的透射光谱，从而改变所采集的光谱，降低光谱角映射器（SAM）的准确性。若将一个数据立方体与使用不同物镜获取的另一个数据立方体进行比较，SAM函数可能无法正常工作。
   4. 通过调节显微镜上的光源旋钮，将光路切换至高光谱相机以选择高光谱相机成像探测器。若光源已导向高光谱相机，则光学相机软件中将不显示图像。请最小化但不要关闭光学成像软件窗口，因为步骤2.4.4中可能需要使用该窗口。
4. 采集数据立方体
   1. 打开高光谱成像软件以采集HSI数据立方体。确保导光管已导向高光谱相机。
   2. 在菜单栏中打开“高光谱显微镜”，并选择“HSI显微镜控制”。
   3. 设置物镜放大倍数和保存路径。务必为所有图像和文件命名以确保唯一性，避免覆盖。通过调整视场或扫描行数（本研究使用720行）来更改区域采集设置，采集更大区域将显著增加所需时间。最后设置曝光时间（本研究为0.25秒）。其余参数保持默认，点击“预览HSI”以查看图像。
      注意：出现的强度图在横轴上显示将要记录的HSI数据立方体，在纵轴上表示将在HSI数据立方体中采集的光谱波长。将光标置于强度图中对应某一光谱波长的位置时，该波长下图像中所有点的强度将被显示。
   4. 根据此预览图像，调节细调焦旋钮以使图像中的峰形更锐利。若此操作困难，由于光学相机的焦距与之相近，可加载光学成像软件并将滑杆切换至光学相机进行对焦，然后返回高光谱成像软件并将滑杆切换回高光谱相机。
   5. 通过调节光源亮度、聚光镜对焦，或取消预览后调节曝光时间来调整预览图像的强度。后者效果最佳，但增加曝光时间会延长成像时间。目标是使主要峰足够高，但不超过探测器的最大强度；此处理想范围为1,000至16,000单位。
   6. 点击“采集”。显微镜将提示采集暗电流图像。移动上方滑杆或光阑（操作需谨慎，以免扰动其他光学元件的对中和对焦），点击“确定”。当提示再次出现时，将滑杆或光阑恢复至正确位置并再次点击“确定”。成像过程最长可达30分钟，但通常约需5分钟。曝光时间越长，成像时间越长。系统设有进度指示器。在进度完成前请勿物理扰动显微镜。
   7. 观察新出现的四个窗口，其名称分别为：“可用波段列表”、“#1zoom”、“#1scroll”和“#1 RGB波段”。最大化“#1RGB波段”窗口，此即为所有后续参考所用的数据立方体。
   8. 右键点击数据立方体，将其保存为TIFF格式并点击“确定”。若成像已完成，请收好所有样品；使用70%水合异丙醇清洁所有接触油的表面；将载物台升至最高位置；将聚光镜降至最低位置并推入非工作位置；关闭或拔掉光源、载物台控制器及相机的电源。

3. 参考光谱库的建立

1. 参考光谱的选择
   1. 选择一个已知含有目标材料的阳性对照，且该材料应与实验样本处于相同的基质中，因为高光谱成像（HSI）的光谱特征依赖于基质。
      1. 本研究中，使用注射了高剂量金属氧化物纳米颗粒的猪皮作为阳性对照，与经皮肤暴露实验获得的猪皮组织样本进行比较。悬浮液中金属氧化物纳米颗粒的光谱图谱已生成并分析，但由于基质不同，其不适合作为组织学实验样本的阳性对照。
   2. 使用高光谱相机，按照步骤2.4所述方法获取阳性对照的数据立方体（datacube）。
      1. 设置光强时需格外谨慎，因为这是内部粒子滤波器识别材料的主要指标。任何超过探测器饱和点（此处为16,000单位）的光强将导致数据无效（参见步骤2.4.5）。
   3. 在图像窗口中右键单击，然后左键点击“Z-profile spectrum”，将弹出一个“光谱轮廓”窗口。在数据立方体上左键点击感兴趣的像素，特别是最亮的区域或可明确识别为代表目标材料的像素，观察“光谱轮廓”窗口中对应的光谱曲线，并记录其最低值和最高值及其对应的波长。
      1. 在检测阳性对照样本时，应点击相对于周围组织明显更亮的感兴趣区域，尤其是那些可清晰识别出颗粒的区域。这些颗粒最有可能是目标材料，特别是金属类物质。
   4. 在“粒子分析”（Particle Analysis）菜单下使用“粒子滤波器”（Particle Filter）工具，识别数据立方体中存在的颗粒。在新弹出的窗口中，观察“Spectral Max Must Exceed”参数，该值应根据步骤3.1.3的观察结果确定。设置该值使其高于背景像素，但低于目标材料的强度。“Valid Data Max”为最大光强值（此处为16,000单位）。
      1. 其余参数保留默认设置，但可通过调整“Size Threshold”框按尺寸排除对象。可在此时或分析运行后保存数据。本实验采用以下参数：Spectral Max Must Exceed: 5,000；Valid Data Max: 16,000；Size Threshold (pixels): 400。设置完成后，点击“OK”。
   5. 观察生成的图表，其中显示了在设定光强阈值内检测到的颗粒详情；该数据可导出。若已知目标材料的特征最大反射波长，则选择具有相似“Max WL”值的颗粒；否则，点击“select all”。然后点击“Export”→“To Spectral Library”，选择文件名后点击“OK”。
2. 去除假阳性光谱
   1. 选择一个作为阴性对照的样本。该样本应与所有实验样本以相同方式制备和处理，但必须确保不含与目标材料相似或相同的纳米颗粒。
      注：阴性对照的基质必须与实验样本的基质相同，因为高光谱成像（HSI）的光谱特征依赖于基质。本研究中，使用未暴露于金属氧化物纳米材料的猪皮作为阴性对照。
   2. 使用高光谱相机，按照步骤2.4.7所述方法，从阴性对照中获取多个数据立方体。至少获取一个，但可采集更多以提高选择性（若参考光谱中可能存在污染物，此步骤尤为重要）。
   3. 按照以下步骤，使用高光谱成像软件将步骤3.1中收集的光谱库（阳性对照）依次与步骤3.2.2中获取的每个阴性对照数据立方体进行比对过滤：
      注：将过滤后的光谱库保存为独立文件，并作为目标材料的参考光谱库。
      1. 在主程序工具栏的“分析”（Analysis）菜单下点击“Filter Spectral Library”。点击“Open”→“New File”，选择步骤3.1中为阳性对照创建的光谱库作为输入文件，点击“OK”。
      2. 在“Spectral Data”框中选择“Image”作为外部数据源。保留“Processing Parameters”框中的默认设置。为过滤后的光谱库指定输出名称（应与原始文件不同，以免丢失原始或原始采集的光谱库）。点击“OK”。
      3. 当提示选择源图像时，点击“Open”→“New File”，选择步骤3.2.2中获取的第一个阴性对照数据立方体。
         注：软件将分析该光谱库，并移除与阴性对照数据立方体中任何光谱相匹配的光谱。通过从筛选条件中去除背景信号，可减少假阳性的可能性。处理完成后将显示摘要（注意该摘要不会自动保存）。
      4. 如需进一步过滤，从步骤3.2.3.1开始重复操作，但步骤3.2.3.2中选择上一次过滤生成的光谱库（即步骤3.2.3.3完成后生成的结果）；在步骤3.2.3.3中选择步骤3.2.2中的下一个数据立方体。
         注：若样本散射大量光（e.g.，碳纳米管）和/或在将阳性对照光谱库与阴性对照进行比对时无剩余光谱，则可能需要对光源光谱进行校正和归一化。本研究未出现此类情况，因此未进行该校正。

4. 图像分析

1. 光谱角制图
   1. 从光谱菜单的“映射方法”子菜单中，使用高光谱成像软件打开“光谱角制图器”（Spectral Angle Mapper，SAM），在按照步骤2.4完成所有实验数据立方体的采集后执行此操作。光谱角制图器通过几何分析光谱在不同波长下的强度变化来比较光谱即它通过归一化两个光谱的强度，并比较绘制各光谱曲线所需的角度来进行比对。²⁴.
   2. 数据立方体打开后，在弹出窗口中选择实验数据立方体的名称，然后点击“OK”。如果未列出任何文件名，则点击“open”；“new file”，选择实验数据立方体，然后点击“OK”。
      1. 观察一个名为“Endmember Collection:SAM”的新弹出窗口。在菜单栏中点击“Import”，然后选择“from Spectral Library file”。此时将出现一个名为“Spectral Library Input File”的弹出窗口。打开在步骤3.2.3中创建的参考光谱库文件，然后点击“OK”。此时会看到一个名为“Input Spectral Library”的新弹出窗口。
      2. 单击“全选项目”；单击“确定”，右键单击“颜色”，选择“对所有项应用默认颜色”。单击“全选”，然后单击“应用”，接着选择输出文件名并单击“确定”。光谱角制图器将需要数秒时间来分析并保存数据。
   3. 在高光谱成像软件中打开数据立方体。在图像窗口的叠加菜单中选择“分类”，然后浏览至文件名并点击“确定”。用户现在可将谱库中的任意光谱叠加，以查看其在图像中的分布位置。
   4. 如果需要统一的颜色方案（例如为了便于其他软件进行分析，如步骤 4.2 所述），请在图像窗口中通过“叠加”菜单打开“交互式类别工具”后，从其“选项”菜单中选择“合并类别”选项。
   5. 高亮所有要合并的分类（通常为“要合并到基类中的分类”列表中除“未分类”外的所有项），然后从“基类”列表中选择单个光谱，点击“OK”。此后，该颜色将代表所有选定的光谱。
   6. 点击所选颜色，所有匹配的谱图将显示为该颜色。
   7. 要获得在黑色背景上显示匹配光谱的双色图像，请点击默认为黑色的“未分类”颜色框。观察双色图像。再次点击“未分类”颜色框可撤销此步骤。
   8. 右键单击将图像另存为 TIFF 格式，包括当前激活的任何叠加内容。
      注意：后续图像处理将使用双色图像。
   9. 在“交互式分类工具”窗口的选项菜单中选择“类别分布”，以获取映射统计信息。该数据表示未映射（未分类）的像素数量以及被识别为目标材料的像素数量。请注意，像素数量并不等同于被映射的颗粒数量。此信息不会自动记录。
2. 高光谱映射图像中的颗粒分析
   1. 在 NIH ImageJ 软件中打开图像。
   2. 使用图像菜单中的调整子菜单中的“阈值”功能。选择能够区分目标颗粒与其他所有物质的参数。本研究使用以下阈值参数：默认阈值方法，红色，HSB 色彩空间，勾选暗背景复选框，以及勾选色调、饱和度和亮度的通过复选框。
      注意：此步骤在不同案例中可能存在显著差异。在分析映射数据立方体时，可通过将所有相关类别统一为单一颜色，并在生成图像前将该颜色与所有未分类颜色叠加，从而简化操作（步骤 4.1.4 至 4.1.8）。
   3. 使用“分析”菜单中的“分析颗粒”功能，以获取面积、平均值、最小值和最大值等信息。本研究中使用的参数设置如下：大小为0-无穷大，圆度为0-1，不显示图像，勾选“显示结果”复选框。
   4. 用于统计分析时，将此数据导出至其他软件程序，以便与相似对照样本中颗粒的数量和大小进行统计学比较。我们建议使用电子表格软件对 ImageJ 数据进行分析。在完成步骤 4.2.4 后，结果表中显示的数据应复制到电子表格中。可对第一列（无标题列）使用 MAX 函数以确定颗粒数量，对“Area”列使用 AVERAGE 函数以计算颗粒的平均大小。未来将开展实验验证，以探究该方法在测定平均大小时相对于既定粒径标准的准确性。例如透射电子显微镜（TEM）。

结果

高光谱显微技术因其能够以类似于分光光度法的方式识别材料而具有重要应用价值。如图1所示，每种材料都具有多个特征光谱及其独特的反射率整体形状。此外，图1还展示了光谱曲线的基质依赖性：三种金属氧化物在组织学组织样本中的光谱曲线（上图）与它们在水相悬浮液中的光谱曲线（下图）存在差异。通过将特征光谱曲线与相同基质中的未知样本进行比对，该技术可用于判断某种材料的存在与否，并可对样本中材料的相对含量进行半定量比较。

由阳性对照皮肤样本创建的参考光谱文库适用于与实验性皮肤样本进行比对。如图2所示，参考光谱文库能够很好地匹配相应的阳性对照，而不会匹配相应的阴性对照。

该技术最重要的优势在于能够检测样品中极低含量的目标物质，并将其与污染物区分开来。例如，在每20-30克体重大鼠吸入低至40 µg的剂量时，即可在肺部观察到单个纳米管²⁵。图3展示了在皮肤组织学样本中的这一能力：在暗场光学图像中（第2列），部分颗粒清晰可见，而另一些颗粒则需通过高光谱成像（第3列）才能检测到，这些颗粒可能在明场显微镜（第1列）或其他方法下被遗漏。使用暗场高光谱成像还可提高特异性，优于简单的明场显微镜。随后，这些图像可进一步进行更定量的分析，尤其是通过ImageJ进行的颗粒分析。

增强型暗场显微镜具有多种不同的应用，即使在不使用高光谱成像的情况下也是如此。其首要优势在于能够生成高质量、高对比度的图像。这一点在图3中得到了充分展示，其中目标颗粒相较于明场图像中的对应颗粒更易于识别。这些图像也可用于定量颗粒分析，但在缺乏高光谱成像的情况下，必须谨慎操作，以避免将污染物颗粒与目标颗粒混淆。

图1. 参考光谱库（组织基质）与光谱库（悬浮纳米颗粒）的比较。该图展示了从与实验样品相同基质中的目标纳米材料生成参考光谱库的重要性。第一行显示了本研究中每种材料（氧化铝、二氧化硅和二氧化铈）的参考光谱库（RSL）。请点击此处查看该图的放大版本。

本RSL是通过本方案中描述的方法创建的，其中阳性对照组织样本经过阴性对照组织样本的过滤。第二行显示了从玻璃载片上液体悬浮状态下的目标纳米颗粒中创建的光谱库（SL）。对于氧化铝，RSL在500和650波长处出现双峰，而在氧化铝纳米颗粒悬浮液SL中，在约600处观察到更平缓且特征较不明显的峰。对于二氧化硅，RSL在约650波长处出现一个峰，而在二氧化硅纳米颗粒悬浮液SL中，在约600处观察到更平缓且特征较不明显的峰。对于氧化铈，RSL在520和620波长处出现双峰，而在氧化铈纳米颗粒悬浮液SL中，在约560处观察到特征较不明显的峰。这表明，纳米颗粒所嵌入的基质会导致光谱发生偏移，在为特定实验选择对照以创建光谱库时，这种偏移可能相当显著。

图 2. 参考光谱库（组织基质）在猪皮组织阳性对照和阴性对照上的映射结果。该图用于验证参考光谱库（RSL）适用于实验样本的映射：每个RSL（左列）均能良好地映射到相应的阳性对照（中列），而不会映射到相应的阴性对照（右列）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 暴露于金属氧化物纳米颗粒的实验用猪皮肤组织的高光谱成像图谱。从上到下的行分别对应皮肤的不同层次，从表层到最深层依次为：表皮、真皮和皮下组织。第一行显示的是暴露于悬浮液中氧化铝纳米颗粒（NPs）的皮肤样本表皮的角质层；第二行暴露于二氧化硅纳米颗粒悬浮液；第三行暴露于二氧化铈纳米颗粒悬浮液。每一列展示了使用不同技术对皮肤相同区域的成像结果。第一列为明场显微镜图像（40倍放大；比例尺 = 50 µm），其中红色方框内的区域在第二列中通过增强暗场显微镜（EDFM）进一步放大观察（100倍放大；比例尺 = 10 µm），白色箭头指示高对比度的纳米颗粒。第三列由高光谱相机（HSI）获取，显示相同的高对比度纳米颗粒（白色箭头）。EDFM 和 HSI 图像均为 100 倍放大；比例尺 = 10 µm。第四列显示的是 HSI 图像与各暴露组相应的参考光谱库（RSL）匹配后的映射结果，其中氧化铝纳米颗粒显示为绿色，二氧化硅纳米颗粒为红色，二氧化铈纳米颗粒为黄色。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

对于经过常规组织学染色的组织样本，可通过EDFM、高光谱成像（HSI）映射及图像分析技术的结合，实现对金属氧化物纳米颗粒的鉴定与分析。尽管组织学或免疫组织化学（IHC）的样本制备具有一定的灵活性，例如，使用固定或冷冻组织；染色类型），为获得最佳观察效果，样本切片厚度应控制在5-10 µm。本实验所用样本经甲醛固定、石蜡包埋后，使用旋转式切片机切为6 µm厚度，置于载玻片上，经苏木精和伊红染色后加盖盖玻片。所用猪皮肤组织来自 离体 皮肤渗透毒理学协作研究被用于本研究。组织样本暴露于金属氧化物纳米颗粒（氧化铝、二氧化硅、二氧化铈）的水悬浮液中。利用EDFM检测感兴趣区域（高对比度元素）是关键的第一步，有助于后续的HSI成像与分析。必须首先对阳性和阴性对照样品进行成像与分析，以建立用于比对的光谱库。将阳性对照采集的光谱导出至阳性对照光谱库中。随后，从阳性对照光谱库中减去阴性对照图像中的所有光谱，以提高特异性（减少假阳性）。由此获得的过滤后光谱库即被视为参考光谱库（RSL），用于目标物质的分析。所有组织样本均经历相同的成像过程，并基于RSL进行映射。最终图像仅在黑色背景上显示含有目标元素的区域。该图像可使用ImageJ软件中的阈值设定与颗粒分析功能，计算每视野中映射颗粒的面积。从ImageJ获得的数值数据可导出至电子表格中进行进一步分析。

需要考虑到生物样本本身存在固有差异，且染色方法可能影响通过EDFM和HSI进行的可视化效果，因此应根据特定类型样本所能获得的最佳高对比度图像来确定曝光参数。尽管可通过光谱库的筛选减少假阳性结果，但获得可靠阴性对照至关重要，这些阴性对照必须避免被目标元素污染，因为与污染相关的光谱可能会从阳性对照的光谱库中被过滤掉，从而增加假阴性率。此外，高光谱成像软件可检测的光谱强度范围不能超过该软件本身的限制（本研究中为16,000单位）：当某些区域积累的颗粒数量过多，导致光谱强度超过强度上限时，这些区域将被排除在光谱库之外，以避免增加假阴性结果的风险。

尽管高光谱成像（HSI）系统相较于传统方法具有诸多优势，但仍存在一些缺点和局限性需要考虑。其一是采集的大量光学数据可能需要强大的计算能力。其二是HSI可能耗时较长，尤其是在初始阶段建立参考光谱库时。此外，每次图像采集可能需要数分钟时间，使其比简单的暗场成像更慢；然而，它仍然比电子显微镜所需的样品制备和成像过程更快。另外，复杂的系统可能产生多个特征光谱，这需要开发高度特异性的对照方法，也使得建立标准化、通用的参考光谱库变得困难²⁶。最后，该技术的分辨率低于探针或电子显微技术（如原子力显微镜或透射电子显微镜），后者能够分辨单个原子。该技术的分辨率受限于其光子本质，因而无法作为纳米级颗粒尺寸测量或亚微米级材料精确定位的高精度工具。尽管该技术可能能够定位大于1 µm的特定组织区域或细胞器内的颗粒（例如细胞核），但更小的细胞器或结构特征则难以通过此方法准确可视化。还需注意的是，鉴于其空间分辨率，该方法无法区分单个纳米颗粒与团聚体¹¹。

其他需要考虑的因素包括：某些材料（如贵金属）具有更高的反射率和独特的光谱特征，这使得利用该工具对其进行分析和光谱成像更为容易。而其他材料，如本研究中所考察的半金属氧化物和碳基纳米材料^{24, 27}，由于其元素组成、形状以及基质的不同，可能会更具挑战性。在Mercer等人进行的两项小鼠吸入研究中，使用了与本研究相似的系统，以利用碳纳米管与周围组织之间极高的对比度来定位其在肺部及继发器官中的分布。然而，这两项研究均未展示高光谱成像技术的应用，可能是因为碳纤维独特的形态已足以作为识别特征。另一个需特别考虑的因素与组织相关：由于通过正常的生物物理过程将目标纳米颗粒沉积到特定器官具有不可预测性（且该过程本身常为研究对象），因此确定合适的阳性对照较为困难，需审慎考虑对照制备方式是否会影响目标材料的状态。例如，若光谱库是基于未经处理的原始纳米颗粒建立的，则可能难以将该光谱库用于在组织或细胞中识别相同的纳米颗粒，因为颗粒自身发生改变后会导致光谱特征发生变化例如，由于 pH 变化、溶解、团聚、蛋白质结合等因素以及整体微环境或基质的影响。最后，该技术在半定量性方面存在局限：其定量能力仅与其他具有相似分辨率的二维显微镜技术相当，因此难以用于表征材料在整体器官中的总负荷等任务。

总体而言，EDFM 和 HSI 相较于传统的纳米材料成像与表征技术（如 TEM、HAADF 和 DIC）具有多项优势。EDFM/HSI 能够实现更快的图像采集与分析，与更为耗时的传统技术相比，节省了时间和成本。此外，EDFM/HSI 的样品制备通常极为简便且具有非破坏性，不仅节省时间，还允许对同一样品进行更灵活的后续分析，因为样品仍可用于其他技术检测。此外，HSI 具有良好的通用性，可适用于多种成分的纳米材料以及不同基质中的分析。研究团队正在进一步优化本文所述方法，以拓展其在其他材料和样品类型中的应用，并深入评估该技术的特异性。目前研究团队正在探索的关键下一步是将这些技术与传统金标准方法进行比对验证例如拉曼、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）等适用于目标材料和组织类型的表征技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CytoViva 150 装置（聚光镜）	CytoViva (Auburn, AL)		安装至 Olympus BX43 显微镜
Olympus BX43 显微镜 - 分析仪插槽 - HSI，配备 10x 和 40x 干式物镜以及 100X 油浸物镜	通过 CytoViva (Auburn, AL) 获得		与 CytoViva 150 装置聚光镜配合使用
Dagexcel-M 数字火线相机 - 制冷型；包含 Exponent 7 软件	通过 CytoViva (Auburn, AL) 获得		增强型暗场成像相机及软件
CytoViva 高光谱成像系统 1.4；包含 Pixelfly 高光谱相机、XY 载物台控制器、ENVI 高光谱成像软件	通过 CytoViva (Auburn, AL) 获得		高光谱相机及软件
洁净室清洗的玻璃载玻片（玻璃 B 型载玻片）	Schott NEXTERION	1025087	与常规玻璃载玻片相比，可减少碎屑和伪影，实现最佳成像效果
洁净室清洗的玻璃盖玻片（#1.0；22 mm x 22 mm x 1.45 mm）	Schott NEXTERION	定制	与常规玻璃盖玻片相比，可减少碎屑和伪影，实现最佳成像效果
A 型显微镜用浸油	Fisher Scientific	12368B	多个供应商
70% 水合异丙醇			多个供应商
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院（NIH）		可在线免费下载的开源软件
金属氧化物纳米颗粒	由工业合作伙伴提供给研究团队		水悬浮液中的氧化铝、二氧化硅和二氧化铈纳米颗粒。由于作者与工业合作伙伴之间存在保密协议，无法披露更多产品信息。