以细胞特异性方式破坏小鼠LINC复合物模型的验证

摘要

核膜蛋白在许多基本生物学过程中发挥着核心作用，并与多种人类疾病相关。本方案描述了一种基于 Cre/Lox 的新型小鼠模型，可实现对 LINC 复合物破坏的时空特异性调控。

摘要

细胞核在发育中及成体组织内的迁移与锚定，高度依赖于一类被称为核骨架与细胞骨架连接体（LINC复合物）的大型大分子蛋白复合物。这些蛋白支架跨越核膜，将细胞核内部与周围细胞质骨架的组分连接起来。LINC复合物由两类在进化上保守的蛋白家族组成：Sun蛋白和含有C端分子特征基序（分别为SUN结构域和KASH结构域）的Nesprin蛋白。Sun蛋白是位于内层核膜的跨膜蛋白，其N端位于核质内的结构域与核纤层相互作用，而其C端的SUN结构域则伸入核周间隙，并与Nesprin的KASH结构域相互作用。经典的Nesprin异构体具有长度可变的N端，该部分伸入细胞质并和细胞骨架的组分相互作用。本实验方案描述了一种显性负性转基因小鼠策略的验证方法，该策略可特异性地在特定细胞类型中破坏内源性的SUN/KASH相互作用。我们的方法基于Cre/Lox系统，规避了生殖系LINC复合物失活模型所伴随的围产期致死性和细胞非自主性表型等多种缺陷。因此，该模型为研究LINC复合物在多种组织发育与稳态过程中的功能提供了有力工具。

引言

核膜（NE）将核质与细胞质分隔开来。它由内层和外层核膜（分别称为 INM 和 ONM）组成，二者在核孔处相连。由这两层膜所界定的腔隙称为核周间隙（PNS）。外层核膜是粗面内质网（ER）的延伸结构，而内层核膜则紧贴核纤层，后者是由 A 型和 B 型核纤层蛋白代表的第 V 型核中间丝构成的网状结构^1,2。连接核骨架与细胞骨架的 LINC 复合物（LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton）是一类跨越整个核膜的大分子组装体，可将细胞核内部与细胞骨架丝及分子马达在物理上连接起来（图 1A）。这类复合物依赖于两组核膜整合跨膜蛋白家族中进化上保守基序之间的相互作用：Sun（Sad1/Unc84）蛋白和 Nesprin（Nuclear Envelope SPectRINS）蛋白。在哺乳动物中，Sun1 和 Sun2 是位于内层核膜的跨膜蛋白，其 N 末端的核质区域可直接与 A 型和 B 型核纤层蛋白相互作用^3-5。在内层核膜的另一侧，即核周间隙内，Sun 蛋白含有一个进化上保守的约 150 个氨基酸残基组成的 C 末端区域，称为 SUN 结构域。SUN 结构域可直接与进化上保守的 KASH（Klarsicht/Anc-1, Syne Homology）结构域结合，后者是 Nesprin 蛋白的分子特征。KASH 结构域由约 30 个 C 末端氨基酸残基组成，伸入核周间隙，随后连接一个跨膜结构域⁶。至少存在四个不同的 Nesprin 基因（Nesprin1-4），它们编码含有 KASH 结构域并定位于核膜的蛋白质⁷。Nesprin 蛋白的胞质区域大小不一，从小约 50 kDa（Nesprin4）到惊人的 1,000 kDa（Nesprin1 巨型蛋白）不等，其中包含多个血影蛋白重复序列以及特定的基序，使其能够与肌动蛋白、plectin 和分子马达等细胞骨架组分相互作用^8-13。

在脊椎动物和无脊椎动物中的研究表明，Lamin/Sun/Nesprin/分子马达构成了一条在进化上保守的“轴”，调控细胞核的迁移与锚定。已有多个LINC复合物组分的基因敲除（KO）小鼠模型被报道，这些模型为理解Sun蛋白和Nesprin蛋白在哺乳动物发育过程中于核膜（NE）所发挥的作用提供了重要框架^9,14,15。然而，这些模型存在若干显著缺陷，主要包括：1）由于细胞非自主效应，表型解读困难；2）难以区分含KASH结构域与不含KASH结构域的Nesprin异构体在表型中的各自贡献¹⁶；3）在多种细胞类型中，核膜上的Sun蛋白和Nesprin蛋白存在功能冗余，需通过复杂的育种策略才能在小鼠中完全阻断所有SUN-KASH相互作用¹⁷；4）同时缺失Nesprin1和Nesprin2的KASH结构域的小鼠在围产期致死，因而无法分析成年个体的表型¹⁸。

本方案描述了一种旨在破坏所有SUN-KASH相互作用的新型小鼠模型 在 体内以细胞自主且发育调控的方式实现，从而规避了上述诸多缺陷。该基于 Cre/lox 的小鼠模型依赖于两个关键概念：1）已知任何Nesprin蛋白的KASH结构域均足以在细胞培养系统中将EGFP靶向定位于核膜；2）SUN结构域可广泛地与KASH结构域相互作用，因此任何KASH结构域的过表达都将饱和所有内源性SUN结构域，并以显性负性方式使LINC复合物失活。 ¹⁷ (图1B）本方案描述了用于验证小脑浦肯野细胞中所有SUN-KASH相互作用均被阻断的组织取材与处理步骤。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠繁殖与基因分型

1. 将 Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) 小鼠与 Tg(PCP2-Cre) 小鼠杂交，以获得 Tg(^PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 小鼠^19,20。注意：尽管本方案其余部分重点使用 Tg(PCP2-Cre) 小鼠品系以将 EGFP-KASH2 的表达限制在小脑的浦肯野细胞中，但也可采用类似步骤与其他任何 Tg(Cre) 小鼠品系进行实验（图 2A）。
2. 进行基因分型，以鉴定同时携带 EGFP 和 Cre 转基因的仔鼠，方法如前所述¹⁹。

2. 解剖和组织采集所需材料的准备

1. 配制 100 ml 含 30% 蔗糖的 PBS 溶液（30 g 蔗糖/100 ml 1×PBS），并于 -20°C 保存。组织取材当天，将溶液解冻，并将约 30–35 ml 蔗糖溶液装入 35 ml 注射器中，用于心脏灌注。
2. 配制 40 ml 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液（10 ml 16% 多聚甲醛与 30 ml PBS 混合）。将约 30–35 ml 4% 多聚甲醛溶液装入 35 ml 注射器中，用于心脏灌注。
3. 在 10 cm 组织培养皿中加入 10 ml PBS，用于组织解剖。
4. 配制含 16 mg/ml 氯胺酮和 3 mg/ml 赛拉嗪的混合麻醉剂。
5. 准备 70% 乙醇溶液用于解剖操作。

3. 解剖与组织采集

1. 使用1 ml注射器，按每25克体重500 µl的剂量注射氯胺酮/赛拉嗪混合溶液，等待约15分钟。或者，使用其他机构批准的、适用于目标生物系统的镇静方法。
2. 动物镇静后，轻轻捏压后肢足掌以确认无痛觉反应，将四肢固定于泡沫板上，使小鼠背部朝下。
3. 用70%乙醇喷洒腹部，从下腹部至肋骨顶部做切口，以暴露心脏。
4. 在心脏右心房做一小切口，将装有30%蔗糖溶液的注射器插入左心室。
5. 以约2–5 ml/min的速度灌注溶液。注射器排空后取出，并更换为4%多聚甲醛（PFA）溶液重复灌注。
6. 解除泡沫板上的固定，取下小鼠头部以暴露脑组织。
7. 使用镊子和剪刀去除头部周围的皮肤。用针头在颅骨后部刺一小孔，再用剪刀和解剖镊小心剥离颅骨。
8. 待脑组织充分暴露后，用镊子取出小脑并置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。用手术刀沿矢状面将小脑切成两半，转移至30%蔗糖溶液中，4°C下过夜。注意：如需制备石蜡切片，应在组织包埋与切片前，先将小脑在4% PFA中4°C固定过夜。

4. 组织处理与切片

1. 制备干冰与2-甲基丁烷的混合物，使浴液温度平衡5分钟。
2. 将OCT包埋剂填充至冷冻模具中，并将半侧小脑组织放入模具内。
3. 在解剖显微镜下，使用镊子调整小脑的位置，使组织的剖切面（靠近小脑中线处）朝上。
4. 将冷冻模具转移至干冰混合液中5分钟，直至OCT包埋剂在组织周围形成坚实的白色基质。注意：如需保存，冷冻样本可置于-20°C环境中。
5. 标记经多聚赖氨酸预处理的载玻片，用于收集组织切片；按照制造商说明书设置冷冻切片机，以获取15 µm厚的小脑切片。收集切片时，小心地将切片与载玻片的多聚赖氨酸涂层面接触。为保持切片的方向性，此步骤中切勿旋转载玻片。
6. 将组织切片储存于-20°C，直至进行染色与成像操作。

5. 小脑切片的染色与成像

1. 在组织染色前配制以下溶液：
   ~50 ml  PBS
   ~5-10 ml  含4% PFA的PBS溶液
   ~10-20 ml  含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS溶液
2. 解冻小脑切片。重要的是，应尽量减少其暴露于任何持续强光的光源下，以防止EGFP荧光褪色。
3. 使用疏水屏障笔在组织切片周围画出矩形区域。
4. 用4% PFA对切片进行后固定5分钟。加入足量液体以覆盖疏水屏障所划定的整个区域（通常约为500 µl）。使用真空泵或移液器小心去除固定液，注意不要扰动组织切片。
5. 用移液器将PBS轻柔地加至载玻片上，避免扰动组织切片。5分钟后，使用真空泵或移液器小心吸除液体。重复PBS漂洗共三次。
6. 用移液器小心加入适当稀释的一抗溶液（每900 µl溶液中加入3 µl Calbindin 和/或 Nesprin2 抗体），溶剂为含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS。室温避光孵育1小时。
   注意：EGFP-KASH2可在冷冻切片上通过直接荧光显微镜观察，无需使用抗EGFP抗体。然而，若制备的是石蜡切片，则对EGFP-KASH2的成像需使用抗EGFP抗体进行免疫检测。
7. 去除一抗溶液，并用PBS漂洗三次。
8. 将Alexa-Fluor二抗按1:1,000比例稀释于含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS中，并避光保存。
9. 轻柔地去除最后一次PBS漂洗液，加入二抗稀释液，避光孵育1小时。
10. 去除二抗溶液，漂洗并洗涤切片三次。如需进行核染色，可在第一次加入PBS时加入核染料（如DAPI，~300 nM）。
11. 彻底清除组织周围的PBS溶液，在组织切片上滴加约5–7 µl封片剂。将玻璃盖玻片覆盖于组织切片上，室温避光静置约15–30分钟。
12. 使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察EGFP以及步骤5.8/5.9中所用二抗对应的其他波长荧光信号。在小脑切片中，使用20倍物镜观察EGFP-KASH2的核膜边缘结构。

结果

本方案展示了利用 Tg(PCP2-Cre) 小鼠将 Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) 小鼠模型中的 EGFP-KASH2 表达限制在小脑浦肯野细胞中的实用性。在 Tg(^PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 子代中，Cre 重组酶在出生后第 6 天（P6）切除 LacZ/V5 开放阅读框，从而特异性地在浦肯野细胞中表达 EGFP-KASH2（图 2A）。正如预期，EGFP-KASH2 定位于核膜，表现为细胞核周围可见 EGFP 阳性的环状荧光信号（图 2B）。为最大程度地观察任何生理表型，需通过计算与细胞特异性抗体标记共染色的 EGFP-KASH2 阳性细胞所占比例，确认 EGFP-KASH2 在大多数靶向细胞中表达。在此示例中，超过 70% 的钙结合蛋白（Calbindin）阳性浦肯野细胞中检测到 EGFP-KASH2 表达（图 2B）。在这些条件下，我们在 10 月龄的 Tg(^PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 小鼠中未观察到明显的组织学或行为学表型^...

讨论

成功研究LINC复合物作用的最关键步骤 体内 使用Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2)模型的关键在于筛选合适的Cre小鼠品系。事实上，若Cre在参与类似通路的其他细胞类型中也具有活性，则可能使实验结果的解读变得复杂。因此，有必要对邻近细胞进行检测，如此处所示的小脑分子层和颗粒层中的细胞图2B同样，为了最大限度地呈现任何具有生理相关性的表型，重要的是要选择一种在目标细胞类型中具有广泛表达的Cre小鼠品系。此外，对所研究系统中LINC复合物组分在发育过程中的表达模式进行深入表征也至关重要。事实上，Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2)小鼠模型的一个局限性在于，它无法提供有关在特定生物系统中涉及哪些Sun蛋白或Nesprin异构体的信息。然而，通过在转录和蛋白水平上进行严谨的表征，可以克服这一问题。事实上，已有多个研究在这一方面开展了工作，揭示了特定LINC复合物组分在中枢神经系统（CNS）发育与稳态过程中的重要作用。^21,22.

最后，尽管本实验方案主要针对固定中枢神经系统组织的使用，Tg(CA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% 戊二醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15710
OCT 包埋剂	Tissue-Tek	4583
组织粘附载玻片	StatLab	M1000W
驴血清	Sigma Aldrich	D9663
曲拉通 X-100	Sigma Aldrich	T9284
免疫笔（ImmuEdge Pen）	Vector Laboratories	H-4000
抗钙结合蛋白抗体（Anti-Calbindin Antibody）	Sigma Aldrich	C9848
抗增强型绿色荧光蛋白抗体（Anti-EGFP Antibody）	Abcam	ab13970
抗Nesprin2抗体（Anti-Nesprin2 Antibody）			先前在参考文献21中描述
荧光封片介质	Dako	S3023
2-甲基丁烷	Sigma Aldrich	O3551