C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

摘要

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。

摘要

系统性红斑狼疮（SLE）是一种具有多种临床和免疫学表现的自身免疫性疾病。多种自发性和诱导性动物模型可模拟人类疾病的共同特征，其中包括bm12转移模型。当将bm12脾细胞或纯化的CD4 T细胞转移至C57BL/6小鼠后，这些小鼠会迅速产生大量滤泡辅助性T细胞（Tfh）、生发中心（GC）B细胞和浆细胞，并随之出现高水平的循环抗核抗体。由于该模型使用遗传背景均一的C57BL/6小鼠，研究人员可在相对较短的时间内快速、便捷地研究转基因或基因敲除小鼠品系中的疾病进展。本文描述了该模型的诱导方法，以及通过多色流式细胞术对Tfh、GC B细胞和浆细胞进行定量分析的实验方案。重要的是，这些方案也可用于表征大多数SLE小鼠模型中的疾病状态，并可用于在其他疾病模型中鉴定Tfh、GC B细胞和浆细胞。

引言

系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，其典型特征是抗核抗体（ANA）的产生和肾小球肾炎。在部分患者中，该疾病还伴随多种其他继发性病变，包括皮肤、心肺和肝脏损害。在美国，SLE的患病率估计差异较大，约为15万至150万^1,2，尤其在女性和少数族裔中发病率较高³。尽管SLE的病因尚不明确，但目前认为其由多种遗传和环境因素相互作用所致，最终导致系统性自身免疫反应。

已采用多种动物模型来研究导致疾病发生和进展的因素。系统性红斑狼疮（SLE）的经典小鼠模型包括具有遗传易感性的小鼠品系，如 NZB × NZW F1 模型及其 NZM 衍生品系、MLR/lpr 品系和 BXSB/Yaa 品系，以及可诱导模型，例如异戊烷（pristane）诱导模型和慢性移植物抗宿主病（cGVHD）模型⁴。早期在移植物抗宿主病（GVHD）模型中关于自身抗体产生的报道使用了多种小鼠品系或仓鼠品系进行亲本至F1代的移植^5–8；目前研究狼疮样疾病更常用的方法包括 DBA/2 亲本→(C57BL/6 × DBA/2) F1 模型，以及本文所述的 bm12 移植模型。每种模型均有其局限性，但通常具有一组共同的特征，这些特征与人类疾病的临床表现相关。小鼠模型中最常报道的参数包括脾肿大、淋巴结病、肾炎、抗核抗体（ANA）的产生，以及在细胞水平上滤泡辅助性T细胞（Tfh）、生发中心....

方案

动物实验在无特定病原体条件下进行，遵循国际实验动物评估和认可委员会以及本机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指南。

注意：如果可能，建议在供体或受体小鼠中使用表达同源标记（如 CD45.1）的小鼠，因为这有助于监测供体移植物的移植效率以及供体 CD4 T 细胞群体的特异性扩增。如果考虑将其他经过遗传修饰的小鼠作为供体或受体，需确保该品系已正确回交至 B6 背景，否则转移的细胞可能会被排斥——这一点将在代表性结果与讨论部分进行更详细的阐述。

注意：以下步骤详述了从4只bm12供体小鼠中收获细胞的体积，所获细胞足以注射12至16只小鼠。6至12周龄的bm12小鼠大约可获得1亿至1.4亿个淋巴细胞，其中约25%为CD4 T细胞。若起始使用的小鼠数量不同或使用不同品系的小鼠，应相应调整体积。C57BL/6小鼠的细胞产量通常相似，但CD4 T细胞比例接近20%。

注意：所有步骤均在室温下进行，并使用室温培养基，以避免热休克和冷休克，防止影响淋巴细胞的长期存活率。组织采集和组织处理步骤均应在生物安全柜中采用无菌技术操作。本方案中所有培养基均为含10%热灭活胎牛血清的IMDM，除非另有说明，下文简称为“完全培养基”。

1. 一种用于基因分型bm12小鼠的新方法

注意....

结果

患病小鼠在短短14天内即出现脾肿大，其脾脏质量与细胞数量可达健康小鼠的2-3倍（图2）。

脾细胞依次根据光散射特性（FSC-A 与 SSC-A）设门，排除双联体（FSC-W 或 FSC-H 与 FSC-A），选择活细胞（活力染料染色程度低），并筛选出 CD4⁺TCRβ⁺ 细胞（图 3A）。根据 CD45.1 和 CD45.2 的差异区分供体细胞与受体细胞（图 3B，左下）。供体细胞主要分化为滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）表型，表现为 PD-1、CXCR5、Bcl-6 和 ICOS 表达上调（图 3B, C）。部分受体来源的 CD4 T 细胞群体也分化为 Tfh 细胞（图 3B，右下）。在过继转移的细胞经历初期的死亡和/或迁移后，供体来源的 Tfh 细胞呈对数扩增，在注射后第 14 天小鼠脾脏中达到 1000–2000 万个细胞（图 3D）.......

讨论

bm12 诱导模型是研究系统性红斑狼疮（SLE）细胞与分子过程的一种相对简便且高效的方法。通过过继转移的针对自身抗原的 CD4 T 细胞发生慢性活化，可导致滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）、生发中心 B 细胞及浆细胞的积聚，这些细胞可通过流式细胞术进行检测，具体方法如本文所述。未来利用该模型的研究可快速、简便地探究候选基因与新型疗法在自身免疫生发中心反应中的作用，这些反应与 SLE 患者体内发生的病理过程相似，并最终调控自身抗体的病理性积聚。此外，本文所述的流式细胞术分析方法也可用于研究其他涉及免疫球蛋白产生的小鼠模型，包括但不限于自身免疫、感染和过敏等疾病过程。

与所有人源疾病的动物模型一样，该模型也存在一定的局限性。鉴于疾病发展迅速且程度显著，参与系统性红斑狼疮（SLE）发展的所有基因在此模型中未必都对致病性具有必要性。此外，当实验数据提示在基因修饰的受体中Tfh细胞扩增极微弱时，必须谨慎排除移植物排斥反应的可能性。应使用同源标记在收获时确认供体细胞的存在，因为受体细胞本身也可分化为Tfh细胞（图3B），这可能掩盖供体细胞缺失的情况。通过使用同源.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	杰克逊实验室	001162	CD45.1+ BoyJ 小鼠品系
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	杰克逊实验室	001162	Bm12 小鼠品系
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	用于基因分型的限制性消化酶
1X RBC 裂解缓冲液	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
血浆分离管（PST）	BD	365974	含二钾 EDTA 的采血管
血清分离管（SST）	BD	365967	含凝血活化剂 / SST 凝胶的采血管
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	高密度细胞分离溶液
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	高密度细胞分离溶液
GL-7-生物素	eBioscience	13-5902-82
链霉亲和素-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
可固定活力染料 ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS 管插件，带架	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ 圆底管	BD	352017