衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca2+）的荧光与生物发光成像

摘要

衰老过程中细胞内 Ca²⁺ 重塑可能引起兴奋性毒性及神经元损伤，这些过程由 Ca²⁺ 超载介导。本研究旨在利用荧光和生物发光成像技术，对大鼠海马神经元长期培养模型（一种神经元衰老模型）中胞质和线粒体 Ca²⁺ 的动态变化进行检测，以探究衰老脑组织中的 Ca²⁺ 重塑现象。

摘要

与神经退行性疾病和缺血相关的神经元细胞死亡易感性在衰老大脑中显著增加，但其潜在机制尚不清楚。兴奋性毒性被认为参与了上述两种损伤所诱导的神经元损害，该过程由谷氨酸受体激活介导，进而促进 Ca²⁺ 流入和线粒体 Ca²⁺ 过载。细胞内 Ca 的显著变化²⁺ 细胞内钙稳态或重塑²⁺ 稳态可能在老年神经元中加剧神经元损伤。为研究Ca²⁺ 在衰老过程中的重塑研究中，我们采用了活细胞成像技术，对大鼠海马神经元进行长期培养，这些神经元在某些方面类似于衰老神经元。 体内为此，首先从新生大鼠海马组织中新鲜分离海马细胞，并将其接种于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。随后，将培养物分别在控制培养基中维持数天或数周，以分别研究年轻和成熟的神经元。其次，将培养的神经元负载fura2，并进行胞质Ca²⁺浓度的测定。²⁺ 使用数字荧光比率成像技术测定细胞内钙浓度。第三，将培养的神经元转染表达靶向线粒体的低亲和力水母发光蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）串联体的质粒。24小时后，细胞内的水母发光蛋白与腔肠素重新结合，随后对神经元进行生物发光成像，以监测线粒体钙水平。²⁺ 浓度。该三步法可实现对胞质和线粒体 Ca²⁺ 对相关刺激（例如谷氨酸受体激动剂NMDA）的反应，并比较这些及其他反应是否受到衰老的影响。该方法可能为衰老如何影响胞质和线粒体Ca²⁺提供新的见解²⁺ 对特定刺激的反应，以及针对预防衰老相关疾病中神经元细胞死亡的特定药物的测试。

引言

兴奋性毒性是导致缺血等神经系统损伤以及阿尔茨海默病等某些神经退行性疾病中神经元损伤和细胞死亡的最重要机制之一 ¹。这种神经毒性主要由谷氨酸作用于Ca²⁺-可渗透的离子型NMDA受体（NMDAR） ²将培养的神经元暴露于谷氨酸可导致兴奋性毒性 ³，可导致神经元凋亡 ⁴我们及其他研究者此前曾报道，神经元对NMDA诱导的凋亡的易损性可能随发育过程而改变 体外 和衰老 ^5-8.

普遍认为，细胞质游离Ca²⁺浓度的升高²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_细胞) 会导致细胞活化。然而，如果该升高幅度过大和/或持续时间足够长，则可能触发细胞死亡 ⁹此外，有研究提出，兴奋性毒性需要线粒体 Ca²⁺ 摄取 ¹⁰，因为用线粒体解偶联剂处理神经元可保护其免受谷氨酸诱导的细胞死亡 ¹¹如果线粒体摄取过多的 Ca²⁺，线粒体通透性转换孔的开放可能导致细胞色素c及其他促凋亡因子的释放，从而诱导细胞凋亡。我们最近的研究表明，这种线粒体Ca²⁺ 摄取与年龄依赖性兴奋性毒性的易感性直接相关，通过直接测量NMDA诱导的线粒体Ca²⁺ 单个海马神经元的摄取

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序均依照欧洲委员会第123/Council of Europe号公约和欧盟指令86/609/EEC的规定，经巴利亚多利德大学动物饲养设施批准的方案进行。

1. 大鼠海马神经元的短期与长期培养

1. 聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片的制备
   1. 将直径为12 mm的玻璃盖玻片在乙醇中灭菌至少24小时。在无菌条件下使其干燥。
   2. 将盖玻片均匀分布在培养皿中的一条石蜡膜上，每个盖玻片表面覆盖200 μL溶液。 µ1 毫升 1 毫克/毫升多聚-D-赖氨酸。置于过夜孵育。
   3. 次日，在无菌条件下，用双蒸馏无菌水每15分钟洗涤盖玻片一次，持续90分钟。
   4. 用500 μL将四孔多孔培养板加满 µ每孔加入 l Neurobasal 培养基。Neurobasal 培养基应添加 10% 胎牛血清、2% B27、1 µg/ml 庆大霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
   5. 将盖玻片放入多孔培养板中，置于37℃湿润环境中孵育。 ºC 和 5% CO₂ 孵育器中保存备用。
2. 从新生大鼠中分离海马神经元
   1. 准备1.8 ml木瓜蛋白酶溶液（直接购买），置于小瓶中（20 µl/ml）下无菌操作：以获得20的终浓度 µl/ml 加入约 40 &....

结果

本文介绍了一种简单的方法，用于评估衰老神经元中Ca²⁺的重塑过程以及NMDA对胞质和线粒体[Ca²⁺]的影响。图1展示了从新生大鼠分离并培养海马神经元的操作流程示意图。实验开始前，需准备无菌的、经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片，并将其置于4孔板中。随后处死新生大鼠并取出脑组织。分离海马后，使用木瓜蛋白酶对组织进行细致的分散处理。分离得到的细胞经洗涤后接种于包被好的盖玻片上。细胞随后分别在2–5 DIV或>15 DIV条件下培养，以获得年轻或衰老的神经元培养物，并用于Ca²⁺成像实验。

采用上述策略，可从同一标本中获得年轻和年老的神经元，用于检测例如NMDA在年轻培养物与较老培养物中对胞质[Ca²⁺]的影响是否存在差异。图2显示，100 µM NMDA在较老的培养物中诱导的胞质[Ca²⁺]升高幅度大于在年轻培养物中的升高幅度。同样，NMDA可诱导年老神经元发生细胞死亡，但在年轻神经元中则无此效应^5.......

讨论

细胞内Ca²⁺重塑²⁺ 衰老大脑中的稳态失调与认知功能下降、缺血性损伤易感性增加、兴奋性毒性以及神经退行性变相关。为验证这一假设 体外，Ca²⁺ 成像技术已有多种可用方法。然而，老化海马神经元的活体培养并不可靠。最近有研究发现，大鼠海马神经元的长期培养呈现出许多典型的衰老特征 体内 包括活性氧积累、脂褐素颗粒形成、异染色质灶、pJNK 和 p53/p21 通路的激活、胆固醇流失以及钙密度的变化²⁺ 通道和NMDA受体 ¹⁴因此，Ca²⁺ 在年轻和老龄大鼠海马神经元培养物中的成像实验可能为Ca²⁺ 衰老大脑中的重塑。长期培养海马神经元的一个关键条件包含两个方面。首先，如上所述，必须以非常低的密度接种细胞。其次，细胞在添加补充剂的Neurobasal培养基中培养，且不更换培养基。该方法可允许胶质细胞存在，同时避免其过度生长。此类培养的示意图如图所示 图1.

使用合成的 Ca^2+.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
HBSS 培养基	Gibco	14170-088
Ham's F-12 培养基	Gibco	31330-038
DNase I（来自牛胰腺）	Sigma	D5025-15KU
胎牛血清	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
庆大霉素	Gibco	15750
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-032
12 mm 玻璃盖玻片	Labolan	0111520/20012
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003127
4 孔多孔培养板	Nunc	176740
培养皿	JD Catalan s.l.	2120044T
无菌移液管	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
腔肠素 n	Biotium	BT-10115-2250 uG
皂苷	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
甘氨酸	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜	Carl Zeiss Inc.
Xcite 照明系统	EXFO
ORCA ER 荧光相机	Hamamatsu
VIM 光子计数 CCD 相机	Hamamatsu
VC-8 阀门控制器	Warner Instruments
SH-27B 加热系统	Warner Instruments
Aquacosmos 软件	Hamamatsu Photonics