衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca2+）的荧光与生物发光成像

摘要

衰老过程中细胞内 Ca²⁺ 重塑可能引起兴奋性毒性及神经元损伤，这些过程由 Ca²⁺ 超载介导。本研究旨在利用荧光和生物发光成像技术，对大鼠海马神经元长期培养模型（一种神经元衰老模型）中胞质和线粒体 Ca²⁺ 的动态变化进行检测，以探究衰老脑组织中的 Ca²⁺ 重塑现象。

摘要

与神经退行性疾病和缺血相关的神经元细胞死亡易感性在衰老大脑中显著增加，但其潜在机制尚不清楚。兴奋性毒性被认为参与了上述两种损伤所诱导的神经元损害，该过程由谷氨酸受体激活介导，进而促进 Ca²⁺ 流入和线粒体 Ca²⁺ 过载。细胞内 Ca 的显著变化²⁺ 细胞内钙稳态或重塑²⁺ 稳态可能在老年神经元中加剧神经元损伤。为研究Ca²⁺ 在衰老过程中的重塑研究中，我们采用了活细胞成像技术，对大鼠海马神经元进行长期培养，这些神经元在某些方面类似于衰老神经元。 体内为此，首先从新生大鼠海马组织中新鲜分离海马细胞，并将其接种于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。随后，将培养物分别在控制培养基中维持数天或数周，以分别研究年轻和成熟的神经元。其次，将培养的神经元负载fura2，并进行胞质Ca²⁺浓度的测定。²⁺ 使用数字荧光比率成像技术测定细胞内钙浓度。第三，将培养的神经元转染表达靶向线粒体的低亲和力水母发光蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）串联体的质粒。24小时后，细胞内的水母发光蛋白与腔肠素重新结合，随后对神经元进行生物发光成像，以监测线粒体钙水平。²⁺ 浓度。该三步法可实现对胞质和线粒体 Ca²⁺ 对相关刺激（例如谷氨酸受体激动剂NMDA）的反应，并比较这些及其他反应是否受到衰老的影响。该方法可能为衰老如何影响胞质和线粒体Ca²⁺提供新的见解²⁺ 对特定刺激的反应，以及针对预防衰老相关疾病中神经元细胞死亡的特定药物的测试。

引言

兴奋性毒性是导致缺血等神经系统损伤以及阿尔茨海默病等某些神经退行性疾病中神经元损伤和细胞死亡的最重要机制之一 ¹。这种神经毒性主要由谷氨酸作用于Ca²⁺-可渗透的离子型NMDA受体（NMDAR） ²将培养的神经元暴露于谷氨酸可导致兴奋性毒性 ³，可导致神经元凋亡 ⁴我们及其他研究者此前曾报道，神经元对NMDA诱导的凋亡的易损性可能随发育过程而改变 体外 和衰老 ^5-8.

普遍认为，细胞质游离Ca²⁺浓度的升高²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_细胞) 会导致细胞活化。然而，如果该升高幅度过大和/或持续时间足够长，则可能触发细胞死亡 ⁹此外，有研究提出，兴奋性毒性需要线粒体 Ca²⁺ 摄取 ¹⁰，因为用线粒体解偶联剂处理神经元可保护其免受谷氨酸诱导的细胞死亡 ¹¹如果线粒体摄取过多的 Ca²⁺，线粒体通透性转换孔的开放可能导致细胞色素c及其他促凋亡因子的释放，从而诱导细胞凋亡。我们最近的研究表明，这种线粒体Ca²⁺ 摄取与年龄依赖性兴奋性毒性的易感性直接相关，通过直接测量NMDA诱导的线粒体Ca²⁺ 单个海马神经元的摄取 ⁵，本文报道了一种方法。海马体参与学习、记忆及其他认知过程等生理活动 ¹²极易受到衰老和神经退行性疾病的影响 ¹³。有研究提出，在数周后 体外培养的海马神经元表现出多种老年神经元的典型特征 ¹⁴因此，长期培养的海马神经元可为研究Ca²⁺介导的衰老过程中兴奋性毒性增强的机制

因此，本方法的总体目标是研究细胞内Ca显著变化²⁺ 稳态或 Ca²⁺ 衰老大脑中的重塑，包括差异性 Ca²⁺ 由NMDA受体激动剂在长期培养的海马神经元中引发的反应。该方法包括大鼠海马神经元培养的详细描述，以及细胞质和线粒体Ca²⁺的监测²⁺ 分别通过荧光和生物发光成像检测单个神经元中的浓度。细胞质 Ca 的荧光成像²⁺ 在培养的神经元中是一种标准操作。然而，该方法对于亚细胞水平的Ca²⁺ 包括线粒体 Ca 的测量²⁺原因包括合成探针缺乏适当的靶向性以及对Ca的亲和力不合适²⁺ 浓度可能从低 µM 水平变化至 mM 水平。Ca 的使用²⁺ 基于蛋白质的探针，例如水母素（aequorin），已实现对细胞器亚结构的靶向定位，并可利用不同类型的钙离子衍生物²⁺ 使用不同的腔肠素或缺失特定Ca的突变探针进行亲和力测定²⁺ 结合位点 ¹⁵通过这种方式，对表达线粒体靶向aequorin的细胞进行生物发光成像，可实现对线粒体Ca²⁺的监测²⁺ 单个神经元中的浓度。然而，该过程可能需要使用光子计数相机或超灵敏CCD相机进行生物发光成像 ^16-18该方法可能产生新的结果，但应在更成熟的脑衰老模型中加以验证，例如老年动物的脑切片。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序均依照欧洲委员会第123/Council of Europe号公约和欧盟指令86/609/EEC的规定，经巴利亚多利德大学动物饲养设施批准的方案进行。

1. 大鼠海马神经元的短期与长期培养

1. 聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片的制备
   1. 将直径为12 mm的玻璃盖玻片在乙醇中灭菌至少24小时。在无菌条件下使其干燥。
   2. 将盖玻片均匀分布在培养皿中的一条石蜡膜上，每个盖玻片表面覆盖200 μL溶液。 µ1 毫升 1 毫克/毫升多聚-D-赖氨酸。置于过夜孵育。
   3. 次日，在无菌条件下，用双蒸馏无菌水每15分钟洗涤盖玻片一次，持续90分钟。
   4. 用500 μL将四孔多孔培养板加满 µ每孔加入 l Neurobasal 培养基。Neurobasal 培养基应添加 10% 胎牛血清、2% B27、1 µg/ml 庆大霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。
   5. 将盖玻片放入多孔培养板中，置于37℃湿润环境中孵育。 ºC 和 5% CO₂ 孵育器中保存备用。
2. 从新生大鼠中分离海马神经元
   1. 准备1.8 ml木瓜蛋白酶溶液（直接购买），置于小瓶中（20 µl/ml）下无菌操作：以获得20的终浓度 µl/ml 加入约 40 µ1.8 ml Hank's 液加 0.6% BSA 中的木瓜蛋白酶µl 应根据供应商的条件进行计算。Hank's 0.6% BSA 的配制方法为：将 85 ml HBSS 培养基与 15 ml 4% 牛血清白蛋白（BSA，通过将 4 g BSA 溶解于 100 ml HBSS 中制备）混合。在无菌操作台中进行配制。
   2. 将木瓜蛋白酶在含0.6% BSA的Hank's液中37℃孵育30分钟 º使用前将溶液在 0.22 μm 滤膜过滤 µm 滤膜，使用前过滤。
   3. 在900 ml双蒸灭菌水中加入杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末（13.5 g/L），配制Ham's F-12培养基。然后加入6 g HEPES和336 mg NaHCO₃₃ 使用 4 N NaOH 将 pH 值调节至 7.42。加入无菌水定容至 1 L，然后使用 0.20 μm 滤膜过滤。 µm 聚醚砜（PES）瓶顶滤器。该操作需在无菌操作台中进行。最后用 CO 饱和溶液₂ 使用前需在无菌条件下操作。将溶液于4℃保存。 ºC，并冷藏使用。
   4. 通过断头法处死新生（P0）大鼠幼崽，并用无菌HBS培养基清洗头部。使用无菌剪刀打开颅骨。用刮勺取出脑组织，并迅速在Ham's F-12培养基中清洗。
   5. 使用解剖刀在每个半球上进行斜切图1B），并将其转移至含有Ham's F-12培养基的培养皿中。
   6. 在解剖镊和放大镜的辅助下，小心地去除脑膜。
   7. 使用放大镜在大脑皮层上一个典型的凹陷位置识别海马体。然后，用眼科剪刀小心地从一侧边缘开始分离海马体，将其从皮层上逐步剥离并取出。
   8. 将海马组织转移至含有无钙无镁无菌Hank's培养基的4孔板中²⁺ 和 Mg²⁺ 加入0.6% BSA并洗涤海马组织。使用同一把眼科剪刀，在不移除培养基的情况下将组织切成小块（约2 × 2 mm）。
   9. 将海马组织块转移至含有1.8 ml预过滤木瓜蛋白酶溶液的样品瓶中，随后在37℃孵育 ºC，偶尔轻轻摇动。15 分钟后，加入 90 µDNase I 溶液的体积（50 µg/ml 终浓度），再孵育 15 分钟。
   10. 将组织转移至一个10 ml离心管中，用新鲜的Neurobasal培养基洗涤组织碎片。通过5 ml塑料移液管反复吹打组织碎片，获得细胞悬液。
   11. 在160 × g下离心细胞悬液5分钟。使用无菌塑料巴斯德吸管弃去上清液，并用1 ml自动化移液器在1 ml神经基础培养基中小心重悬沉淀。
   12. 使用血球计数板测量细胞密度。将盖玻片覆盖在血球计数板上，加入10 μL细胞悬液。 µ细胞悬液。确保细胞悬液均匀进入计数室，避免产生气泡。在显微镜下计数细胞数量，并进行相应计算，以获得适宜的细胞滴度（40–80个细胞/滴） µl 含 30 x 10³ 细胞。细胞总数取决于所使用的动物数量。
3. 大鼠海马神经元的短期与长期培养
   1. 在含有500的四孔多孔培养板上 µ预先准备好并置于培养箱中保温的 Neurobasal 培养基，接种约 30 × 10³ 约50微升液滴中的细胞 µ向多孔板的每个孔中加入 l，孔内含一片经多聚-D-赖氨酸包被的 12 mm 直径玻璃盖玻片。
   2. 在37℃、湿润的培养箱中培养原代海马神经元细胞 ºC 和 5% CO₂₂ 2-5 天的培养箱培养 体外 （DIV，短期，年轻培养物）或 >实验前培养15天（长期、老化培养），期间不更换培养基。

2. 细胞质 Ca ²⁺ 浓度的荧光成像

1. 荧光成像用测试溶液的制备。
   1. 配制外部 HEPES 缓冲盐溶液（HBS），其中含有（单位：mM）：NaCl 145、KCl 5、MgCl₂ 1、CaCl₂ 1、葡萄糖 10、钠-HEPES 10（pH 7.42）。
   2. 配制无 Mg²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBS），其中含有（单位：mM）：NaCl 146、KCl 5、CaCl₂ 1、葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。
   3. 将 NMDA 溶于无 Mg²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBS）中，终浓度为 100 µM，并加入 10 µM 甘氨酸。
   4. 通过溶解以下成分（单位：mM）配制以 KCl 替代 NaCl 的 HBS 溶液：KCl 145、MgCl₂ 1、CaCl₂ 1、葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。
2. 用荧光钙探针 fura2/AM 负载海马神经元细胞。
   1. 从培养箱中取出含盖玻片的细胞培养物，在室温下用 HBS 培养基洗涤，将其转移至新的四孔多孔板中，每孔加入 500 µl HBS 培养基。
   2. 在室温（25 ºC）避光条件下，用 4 µM fura2/AM（溶于相同 HBS 培养基中）孵育细胞 60 分钟。
   3. 60 分钟后，用新鲜 HBS 培养基洗涤盖玻片。
3. 记录培养细胞胞质内 [Ca²⁺] 的荧光图像。
   1. 打开光源、显微镜、灌流系统、荧光相机和计算机。
   2. 将盖玻片置于倒置显微镜载物台上专用于开放式 12 mm 玻璃盖玻片的温控平台上，使用 40X 物镜（油镜，NA:1.3）选择观察视野。持续用预热至 37 ºC 的 HBS 培养基对细胞进行灌流，可选择性加入待测物质。维持灌流速度约为 5–10 ml/min。
      注：活细胞灌流系统安装在适用于开放式 12 mm 玻璃盖玻片的温控平台上。采用配备阀门控制器的 8 通道重力驱动灌流系统进行溶液灌流。真空泵用于吸除多余液体。溶液通过管内加热系统进行加热。
   3. 在两个激发波长下关闭快门，采集背景图像。
   4. 以 340 nm 和 380 nm 激发波长交替照射细胞，使用荧光相机每 5–10 秒记录一次 520 nm 发射光，该信号经 fura-2 二向色镜过滤。
   5. 记录结束后，将 520 nm 发射光的完整图像序列保存至计算机，用于后续分析。
4. 记录的荧光图像分析。
   1. 打开实验文件。在 aquacosmos 软件中点击“Ratio”（比值），选择所需的比值范围。对所得图像进行逐像素比值计算，生成一系列比值图像。
   2. 通过调整“背景消除”功能扣除背景信号，点击“开始计算”。
   3. 点击“all times sequence”（全部时间序列）按钮，清除原有的感兴趣区域（ROIs）。为对单个细胞进行定量分析，建立新的与单个神经元对应的感兴趣区域（ROIs）。对每个 ROI 内所有像素在每幅图像中的比值进行平均，获得各 ROI（细胞）的比值荧光记录。
   4. 为绘制单个记录曲线，将各 ROI 对应的比值荧光值导出至绘图软件。
   5. 使用合适的数据分析与绘图软件，进行相应计算，以评估每次刺激所引起的比值荧光上升幅度。

3. 线粒体 Ca²⁺ 浓度的生物发光成像

1. 转染培养的海马神经元与 mitGAmut 质粒。
   注意：首先将含有线粒体靶向序列和缺失Ca²⁺的突变型水母发光蛋白（aequorin）的mitGAmut质粒转染至细胞中²⁺ 结合位点与绿色荧光蛋白（GFP）融合。该构建体可检测线粒体Ca²⁺水平的显著升高²⁺ 摄取，并可通过GFP荧光鉴定转染细胞。该质粒由P. Brûlet及其同事开发并惠赠。 ¹⁸ （法国国家科学研究中心，巴黎）
   1. 制备不含胎牛血清、B27、庆大霉素和2 mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基（Neurobasal TF）。
   2. 准备50 µ神经基础培养基TF加2.5 µl 转染试剂置于一个离心管中（溶液A）。准备50 µ神经基础培养基TF加4微升 µ将含 g mitGAmut 质粒的溶液 B 加入装有溶液 A 的小管中。轻轻将溶液 B 加至溶液 A 上层，室温静置 20 分钟，勿振荡，使其自然混合。
   3. 将含有海马神经元的盖玻片转移至含有 200 µ新鲜 Neurobasal 培养基。
   4. 逐滴加入100 µ每盖玻片加入 A 和 B 溶液各 l，孵育 30 分钟。移除培养基，用新鲜的 Neurobasal TF 洗涤细胞一次。将盖玻片放回原 Neurobasal 培养基中。
   5. 在37℃下将神经元继续培养24小时 ºC 和 5% CO₂ 转染后，以确保探针的有效表达和靶向。
2. 生物发光成像用测试溶液的制备
   1. 配制含有100 NMDA的HBS溶液 µM 或 145 mM KCl（同上，步骤 2.1）。配制含有 10 mM Ca 的 HBS 溶液²⁺ 加100去氧胆酸钠 µM.
3. 线粒体靶向水母素与腔肠素 n 的重组
   1. 将含有转染海马神经元的盖玻片转移至含有200 μL预热成像缓冲液的四孔板中 µHBS 的升
   2. 加入4 µ腔肠素 n (200 微升) µM) 至 200 µHBS 的终浓度为 4 l µM，轻轻混匀，在室温（25 ℃）孵育 2 小时 ºC）以及避光条件下。
4. 记录线粒体[Ca ²⁺ ].
   1. 打开显微镜、光源、灌注系统、生物发光相机和计算机。
   2. 将重悬的盖玻片转移至恒温（37 ºC）将灌流室连接，以每分钟5-10毫升的速度持续灌注预热的HBS溶液。
   3. 使用40倍物镜（油镜，NA：1.3），在荧光显微镜下选择一个含有表达apoaequorin的细胞的视野，这些细胞可通过绿色荧光蛋白（GFP）表达在FITC滤光片下观察到的荧光信号来识别。典型视野中可能包含1-2个转染细胞。使用CCD相机采集GFP荧光图像。
   4. 关闭显微镜光源。移除位于光路中的含二向色镜的盒子。关闭激发光源，并合上暗箱以确保完全黑暗。
   5. 以预热至37℃的HBS培养基，以5–10 ml/min的流速灌注细胞，可选择性加入待测溶液 ºC.
   6. 使用配备图像处理器的光子计数相机，每10秒采集一次光子发射图像。
   7. 每次实验结束时，用含 0.1 mM 皂苷和 10 mM CaCl₂ 的溶液对细胞进行透化处理₂ 在 HBS 中以释放所有剩余的光子发射。
      注意：必须对这些光子发射进行累加以估算总光子发射量，该数值是钙定标所必需的²⁺ 浓度
   8. 将生物发光图像与光子计数成像前采集的GFP相关荧光图像一同存储在计算机中。
5. 线粒体[Ca²⁺]生物发光成像分析 ²⁺ ].
   1. 使用特定软件定量光子发射。光子发射可转换为线粒体游离 Ca²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_中期）使用 Brini 等人描述的算法 ¹⁵.
   2. 打开实验文件并加载GFP荧光图像。根据实验开始时采集的荧光图像，借助特定软件绘制转染细胞的轮廓，以选定感兴趣区域（ROIs）。
   3. 将相同的感兴趣区域（ROI）粘贴到每张图像上。使用特定软件计算每个 ROI 内的总光子发射量，以获得每个细胞在各个时间点的发光强度值（L）。
   4. 使用特定软件将生物发光图像中的所有光子发射信号相加，包括皂苷素透化后获得的信号，以获得包含全部光子发射的生物发光图像。
   5. 将每个感兴趣区域的光子发射值导出至特定软件以进行计算。为此，请点击“Graph”以计算每个时间点每个ROI的生物发光值。选择“total value”和“use current ROI to all images”，然后点击“calculate”。保存“txt.file”并将数据导出至工作表。对于每个ROI，[Ca²⁺]_中期 使用以下算法进行计算：
      
      [Ca²⁺](M) = [R + (R · K_TR) - 1] / [K_R - (R · K_R)];
      
      其中，
      R = [L/(L_总计λ)]^1/n
      L 是每个感兴趣区域在测量时刻发射的发光强度。
      L_总计 是每个感兴趣区域在测量时点减去当时组织中所含计数后剩余的总发光量。 λ，K_TR，K_R 且 n 是常数，其取值取决于所用腔肠素（野生型或 n 型）与水母素（野生型或突变型）的组合以及记录温度 ¹⁶对于此处使用的组合（突变型AEQ与腔肠素n），在37 ºC，我们使用了以下数值：K_R = 8.47 × 10⁷，K_TR = 165.6 × 10³，n = 1,204 和 λ = 0,138.
6. 使用合适的数据分析和绘图软件，进行相应的计算，以估算每次刺激引起的生物发光增强的幅度。

结果

本文介绍了一种简单的方法，用于评估衰老神经元中Ca²⁺的重塑过程以及NMDA对胞质和线粒体[Ca²⁺]的影响。图1展示了从新生大鼠分离并培养海马神经元的操作流程示意图。实验开始前，需准备无菌的、经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片，并将其置于4孔板中。随后处死新生大鼠并取出脑组织。分离出海马组织后，使用木瓜蛋白酶进行细致的组织分散。分离得到的细胞经洗涤后接种于包被的盖玻片上。细胞随后在体外培养2–5天（DIV）或>15天（DIV），分别获得年轻或衰老的神经元培养物，并用于Ca²⁺成像实验。

采用上述策略，可从同一标本中获得年轻和年老的神经元，用于检测例如NMDA在年轻培养物与较老培养物中对胞质[Ca²⁺]的影响是否存在差异。图2显示，100 µM NMDA在较老的培养物中诱导的胞质[Ca²⁺]升高幅度大于在年轻培养物中的升高幅度。同样，NMDA可诱导年老神经元发生细胞死亡，但在年轻神经元中则不引起细胞死...

讨论

细胞内Ca²⁺重塑²⁺ 衰老大脑中的稳态失调与认知功能下降、缺血性损伤易感性增加、兴奋性毒性以及神经退行性变相关。为验证这一假设 体外，Ca²⁺ 成像技术已有多种可用方法。然而，老化海马神经元的活体培养并不可靠。最近有研究发现，大鼠海马神经元的长期培养呈现出许多典型的衰老特征 体内 包括活性氧积累、脂褐素颗粒形成、异染色质灶、pJNK 和 p53/p21 通路的激活、胆固醇流失以及钙密度的变化²⁺ 通道和NMDA受体 ¹⁴因此，Ca²⁺ 在年轻和老龄大鼠海马神经元培养物中的成像实验可能为Ca²⁺ 衰老大脑中的重塑。长期培养海马神经元的一个关键条件包含两个方面。首先，如上所述，必须以非常低的密度接种细胞。其次，细胞在添加补充剂的Neurobasal培养基中培养，且不更换培养基。该方法可允许胶质细胞存在，同时避免其过度生长。此类培养的示意图如图所示 图1.

使用合成的 Ca^2+...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
HBSS 培养基	Gibco	14170-088
Ham's F-12 培养基	Gibco	31330-038
DNase I（来自牛胰腺）	Sigma	D5025-15KU
胎牛血清	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
庆大霉素	Gibco	15750
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-032
12 mm 玻璃盖玻片	Labolan	0111520/20012
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003127
4 孔多孔培养板	Nunc	176740
培养皿	JD Catalan s.l.	2120044T
无菌移液管	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
腔肠素 n	Biotium	BT-10115-2250 uG
皂苷	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
甘氨酸	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜	Carl Zeiss Inc.
Xcite 照明系统	EXFO
ORCA ER 荧光相机	Hamamatsu
VIM 光子计数 CCD 相机	Hamamatsu
VC-8 阀门控制器	Warner Instruments
SH-27B 加热系统	Warner Instruments
Aquacosmos 软件	Hamamatsu Photonics