脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

摘要

我们介绍一种通过向脑核团注射顺行或逆行示踪剂来标记神经元及其突起的技术，该技术使用一种 体外 制备。我们改进了一种现有的i体外 利用荧光标记的小鼠突变体和基础光学设备，通过示踪电穿孔提高标记准确性。

摘要

我们介绍一种结合了 体外 示踪剂注射方案，该方案利用一系列电脉冲和压力脉冲，通过电穿孔增强脑组织外植体对染料的摄取，并在操作过程中采用靶向激光照射及匹配的滤光护目镜。所述技术的 体外 单独使用电穿孔技术即可实现对大脑特定区域相对良好的可视化控制。通过结合激光激发荧光遗传标记物，并利用带通滤光镜眼镜检测其发射信号，可捕获经遗传标记的细胞/细胞核所发出的荧光 和 通过使用荧光示踪染料，研究人员能够更高效地定位目标区域并精确控制注射区域中染料的扩散和摄取，从而显著提高注射的准确性。此外，当GFP表达与特定神经元亚群所表达的神经递质类型相关联时，激光照明技术可提供投射至特定区域的神经元类型信息，从而用于研究特定神经环路的功能特性。

引言

为了定义特定的神经元（微）环路，必须首先确定该环路中的各个参与神经元及其连接模式。自从 Waller 发表关于通过损毁进行神经纤维示踪的研究¹以来，已建立起多种神经解剖学示踪技术。其中一些技术可应用于死后固定的组织^2-4，而另一些则依赖于染料在活神经元中的主动运输，这一现象发现于1971年^5-6。后者可进一步分为两类：一类利用主动逆向运输（从注射区域回溯至某一投射的来源，即投射到该区域的神经元胞体），另一类利用主动顺向运输（从注射区域至某一投射的靶区，即标记神经元的轴突及其终末）。此外，某些情况下将示踪剂注入存活动物体内，动物在注射后可继续存活数天至数周（in vivo 示踪注射）；而在其他情况下，则是对离体脑组织进行注射，并在人工脑脊液中孵育数小时（in vitro 示踪注射）。

在本方案中，我们对现有方法进行了修改 体外 电穿孔技术^7-8 使用霍乱毒素亚基-b和四甲基罗丹明葡聚糖作为示踪物质，在顺行性和逆行性示踪实验中标记神经元胞体及突起。本方案的总体目标是为神经科学家提供一种高效工具，用于追踪不同脑核团之间的神经连接模式，同时利用现有的转基因小鼠品系和基本的光学设备，以提高示踪剂注射过程中的靶向准确性。尽管使用霍乱毒素、葡聚糖胺及其相应的荧光标记结合....

方案

1. 光学基因分型

1. 小鼠幼崽的光学基因分型

1. 使用适当激发波长的激光笔（本实验中为 405 nm）和相应的滤光眼镜（阻断激发波长，但透过发射波长，本实验中为 450 - 700 nm）检查相应荧光标记的表达情况。将激光笔照射于幼鼠头部后侧或脊髓部位（见图 1）。避免激光直射眼睛，以及皮肤长时间暴露于激光下。

2. 老年动物的光学基因分型

1. 通过腹腔注射过量戊巴比妥（120 mg/kg 体重）使小鼠深度麻醉（本实验中使用的小鼠年龄为 p14 至 p138）。通过检查动物的反射来确认麻醉效果（轻捏耳尖或一条后肢以诱发耳朵或腿部的回缩反射）。 
2. 注意：尽管使用了过量戊巴比妥（120 mg/kg 体重），我们仍称该注射操作为"深度麻醉"而非安乐死，因为理想情况下在手术和灌注开始时动物仍存活（即心脏仍在跳动）。这可确保包括脑在内的内脏器官得到更有效的灌注。 
3. 一旦动物不再表现出任何反射，小心地去除覆盖颅骨的皮肤（图 2A），方法是在头部背面的皮肤上做一切口，并剪至颅骨中段。将暴露的颅骨置于激光照射下，并如上所述通过滤光护目镜观察荧光。若观察到阳性 GFP 信号，则进入步骤 2；若未观察到，则通过断....

结果

图1和图2 展示如何使用激光笔和激光护目镜快速且低成本地从一窝幼鼠中鉴定出GFP阳性个体。对于幼龄小鼠，该技术可非侵入性地透过颅骨和表层皮肤识别动物脑内的GFP标记。图 1A - D）。出生后第3天的小鼠幼崽，其皮肤和颅骨下发出的荧光仍可被观察到（图 1C）。该操作步骤如图所示 图1 对于表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠品系（GlyT2-GFP），其神经元中的甘氨酸能亚群被GFP标记。在年龄较大的动物中，由于颅骨较厚且皮肤有色素沉着，GFP标记透过皮肤和骨骼的可见度较低，因此在进行光学基因分型前，需要去除头部和/或颈部的皮肤。图 2A).

灌注动物后，取出脑组织并再次观察荧光标记的特定细胞核。在图2B中，脑干腹侧表面附近发亮的明亮结构为两个斜方体腹侧核，我们将其作为示踪剂注射的定位参考和靶点。图4和图5展示了向斜方体腹侧核（VNTB）进行顺行.......

讨论

一种普遍的优势 体外 示踪电穿孔，与之相对的是 在 体内 示踪研究的优势在于，它使研究人员能够更便捷地接触目标脑区，因此无需使用昂贵的立体定位（以及通常所需的电生理）设备。此外，脑组织离体样本所需的存活时间仅为数小时（1–4小时），而相比之下，活体动物示踪实验通常需要数天甚至数周的存活期。 体内 示踪剂注射（参见关于葡聚糖胺及其他示踪剂使用的详细综述） 体内 Lanciego 和 Wouterlood，2011 年的注射方法²²，但也包括Rodriguez-Contreras， 等, 2008²³），以便在注射过程中或最迟在次日即可发现注射失败的情况，从而相应地调整注射参数。脑组织外植体的存活时间较短，也意味着通常在不同组别之间的差异较小 有效 （染料被神经元摄取的区域，在顺行注射中标记轴突末梢，或在逆行注射中标记轴突终末）以及 表观的 （染料溢出但未被吸收的区域）注射部位，尽管这种差异永远无法完全排除，且只能在事后进行量化或控制，在某些情况下甚至完全无法实现.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	所有化学品均来自 Sigma-Aldrich，另有说明者除外。
氯化钾		P9333
磷酸二氢钾		P5655
磷酸氢二钠		S907
氯化镁		M2670
氯化钙		C5080
葡萄糖		G7528
碳酸氢钠		S6297
抗坏血酸		A4544
肌醇		I5125
丙酮酸钠		P2256
牛血清白蛋白		A2153	可选，用于额外的（免疫）组织化学染色
吐温-100		X100	可选，用于脑组织透明化
聚乙二醇，分子量 8000		P2139	可选，用于脑组织透明化
甲酰胺	Fisher Scientific	F84	可选，用于脑组织透明化
霍乱毒素亚基-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
四甲基罗丹明葡聚糖	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
荧光尼氏染色剂	Invitrogen	N-21479 (蓝色)	可选
多聚甲醛	Fisher Scientific	SF93
琼脂糖	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
戊巴比妥	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
硼硅酸盐玻璃丝	Harvard Apparatus	G150F-10
拉管仪	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
灌流装置	定制
激光笔	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
滤光片/防护眼镜	Dragon Lasers, China	LSG09 (带通 450-700 nm)
双目解剖显微镜	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	配备高强度照明器 (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
微量注射仪	Parker Instruments	Picospritzer III
安装有 MC Stimulus 软件的计算机	Multi Channel Sys-tems, Germany (软件)
双通道刺激器	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
刺激隔离单元	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
显微操作器	Narishige, Japan	YOU-1
振动切片机	Leica, Germany	VT1000S