方法文章

激光制导神经跟踪在脑外植体

DOI：

10.3791/53333

⸱

2015年11月25日

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado School of Medicine

本文内容

摘要

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我们描述了一种技术，通过顺行或逆行示踪剂注射标记的神经元和它们的过程变成使用体外制备脑核。我们修改的I N通过利用荧光标记的小鼠突变体和基本的光学设备，以便增加贴标精度体外示踪剂电穿孔的现有方法。

摘要

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我们提出结合的体外示踪剂注射方案，它使用了一系列的电气和压力脉冲的过程中，通过电穿孔，增加脑外植体与靶向激光照明和匹配滤波器护目镜染料吸收的技术。 在体外的电本身所描述的技术产生了比较良好的视觉控制目标定位大脑的某些区域。通过将其与荧光遗传标记的激光激发和它们的读出通过带传递滤波器护目镜，其中可以拿起遗传标记的细胞/细胞核和荧光示踪染料的排放量，研究者可以大幅提高注射剂的精度相结合通过找到感兴趣的区域，并更有效地控制了该染料扩散/吸收在注射区域。此外，激光照射技术允许研究给定neurocircuit通过省的功能iding约神经元投射到一特定区域的情况下的GFP表达被链接到发射机的由神经元的亚群表达的类型的类型的信息。

引言

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为了定义一个特定的神经元（微）电路，必须通过找出所述电路，和它们的连接图形的各个参与者启动。自从沃勒的出版约neurofiber通过损毁1种类繁多的神经解剖跟踪技术跟踪已经建立。这些技术的一些可以在固定的组织验尸2-4被应用，更为依赖于染料的活的神经元的活性的运输，如发现于1971年5-6。后者可进一步细分为两组利用活性逆行方法区分（从注入区域到给定突起的来源 ， 即所突出的所述区的神经元的胞 ​​体）和活性顺行（从注入面积给定突起的目标 ， 即轴突突起和标记的神经元）传输的轴突终端。此外，在一些情况下，TRA减量材料注入活的动物，然后注入由数天或数周（体内示踪剂注射）存活，而在其他情况下取出的大脑注射和注入人工脑脊液后孵育几个小时（体外示踪剂注射） 。

在这个协议中，我们修改了现有的体外电击技术7-8在使用霍乱毒素亚基B和四甲右旋糖酐作为跟踪物质顺行和逆行追踪实验标记神经元胞体和进程。此协议的总体目标是提供神经科学家与一个有效的工具来跟踪不同的大脑核团神经元之间的连接方式，同时采取可转基因小鼠线和基本的光学设备的优势，以便在示踪剂注射，以增加定位精度。虽然顺行和逆行追踪的方法，用霍乱毒素和葡聚糖胺和它们各自的荧光标记的偶联物是不是新的9-13，（

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方案

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1.光学基因分型

乳鼠1.光学基因分型

  1. 检查使用适当的激发波长的激光指针的各荧光标记物的表达（在这里描述的实验中为405nm）和相应的过滤器护目镜阻断激发波长不过将发射波长（450 - 700在此处描述的实验纳米） 。点激光指示器在头部或鼠标小狗脊髓的背面（ 参见图1）。避免闪耀的激光进入眼睛和皮肤的激光的冗长曝光。

较早的动物2.光学基因分型

  1. 通过腹膜内注射（120毫克/公斤体重）深深麻醉小鼠（老化P14到在这里描述的实验P138）用戊巴比妥的过量。通过检查动​​物的反射确认适当的麻醉（简称捏个尖Ë耳朵或后腿之一，引起耳或腿）的回缩反射。
  2. 注意:尽管使用戊巴比妥（120毫克/千克体重）的过量，我们指的是注射过程为"深度麻醉"，而不是安乐死，因为动物是理想情况下还活着（ 即它的心脏还在跳动），当手术和灌注开始。这确保了内部器官包括脑的更有效的灌注。
  3. 一旦动物没有显示任何反射，小心地通过使在皮肤覆盖头部的背面的切口和切割到头骨的中部去除皮肤覆盖在头骨（图2A）。暴露揭露头骨激光光并如上所述通过过滤器护目镜观察荧光。如果一个积极的信号GFP观察，继续执行步骤2，如果不通过断头牺牲动物（秒/确保安乐死下列表格我们IACUC规定）。

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结果

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图1和2示出了如何将激光指针和激光护目镜可用于快速，低成本从垫料基因型GFP阳性的动物。在年轻小鼠幼仔情况下，该技术可以用于通过头骨和覆盖皮肤（图1A - D）的非侵入性地确定在动物的大脑的GFP标签。发射的荧光可以通过皮肤和小鼠幼仔头骨至少高达3日龄（图1C）可以看出。该过程示于图1，为绿色荧光蛋白（GFP）标记的在其甘氨酸神经元的亚群（GlyT2-GFP）的表达GFP小鼠系。在老年动物具有较厚头骨和色素沉着皮肤，将GFP标签显示较差通过皮肤和骨，并因此在头部和/或颈部的皮肤所需要的光学基因分型（图2A）之前要除去。

灌流后，动物大脑取出，并再次照射找到感兴趣的荧光标记的核。亮起的靠近图 2B脑干的腹侧表面上的明亮的结构是斜方体，这是我们同时用作导向和一个目标为示踪剂注射两腹侧核。 图4和图5示.......

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讨论

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体外示踪剂电穿孔的一般强度，相对于在体内跟踪研究中，是可以让研究人员的利益，因此大脑区域更好的访问，不涉及昂贵立体定向（通常电）设备。此外，所需的脑外植体存活期跨越只有几个小时（1 - 4）中的体内示踪注射的情况下，而不是数天或甚至数周（见关于使用葡聚糖胺和在其他示踪剂的详细审查体内注射由Lanciego和Wouterlood，2011 22，但也罗德里格斯-Contreras的， 等人，2008年23），以便不成功注射可以早在注射程序过程中检测到或最迟，第二天，所以该注入参数可以相应地调整。短生存期脑外植体也意味着，通常有之间的<差异较小EM>有效（区，那里的染料，就由神经元在顺行或逆行注射轴突终端） 和表观（区域所在的染料洒，而不被拉紧）注射部位，但这种差异不能排除完全，并且只能进行量化/控制以事后，在某些情况下可以是完全不可能的（见Albrecht等人，2014年为更详细的讨论24）。

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披露

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我们什么都没有透露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由美国国立卫生研究院/ NCRR科罗​​拉多CTSI授权号UL1 RR025780和落基山脉Neurlogical障碍核心中心授予美国国立卫生研究院P30NS048154部分支持NIH / NIDCD R01 DC 011582.成像实验在美国科罗拉多州安舒茨医学校区先进的光学显微镜核心的大学进行支撑。萨沙迪拉克博士索尔克研究所为我们提供了GlyT2-GFP小鼠。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠Sigma-AldrichS7653除非另有说明，否则所有化学品均来自 Sigma-Aldrich。
氯化钾 P9333
磷酸二氢P5655
磷酸S907
氯化M2670
氯化C5080
葡萄糖G7528
碳酸S6297
抗坏血酸A4544
肌醇I5125
丙酮酸P2256
牛血清白蛋白A2153可选，用于附加（免疫）组织化学
Triton-X-100X100可选，用于附加（免疫）组织化学
聚乙二醇，8000 MWP2139可选，用于大脑清理
甲酰胺Fisher ScientificF84可选，用于大脑清理
霍乱毒素亚基-b分子探针C-34776 （Alexa 555） 
葡聚糖四甲基-罗丹明分子探针D-7162 （Alexa 555）
荧光尼氏InvitrogenN-21479（蓝色）可选
多聚甲醛Fisher ScientificSF93
琼脂糖Invitrogen16520
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
戊醛Vortech PharmaceuticalsFatal-Plus 
硼硅酸盐玻璃丝Harvard ApparatusG150F-10
移液器拉拔器Zeitz Instruments，德国DMZ 通用拉拔器
灌注设置定制
激光指示器 laserpointerpro.com，香港HK-88007294 （405 nm）
滤光片/护目镜Dragon Lasers，中国LSG09 （带通 450-700 nm）
生物目镜 瑞士 Wild HeerbruggWild M3配备高强度照明器（MI-150;Dolan-Jenner Inc.） 
PicospritzerParker InstrumentsPicospritzer III
PC 安装了 MC 刺激软件多通道系统 德国（软件）
2 通道刺激器多通道系统德国 STG-1002
刺激隔离装置A.M.P.I.，以色列Iso-Flex
显微作器Narishige，日本YOU-1
振动切片机Leica， 德国VT1000S
钾 氢二钠 镁 钙 氢钠 钠 菌

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L.

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