使用多通道双电场微流控芯片研究肺癌细胞的电趋性

摘要

已开发出多种微流控装置用于趋电性研究。然而，这些芯片均无法有效研究化学因素与电场（EF）对细胞的联合作用。我们开发了一种基于聚甲基丙烯酸甲酯的装置，可在趋电性研究中实现对共存电场与化学刺激的更精确控制。

摘要

在直流电场（dcEF）作用下细胞的定向迁移行为被称为电趋性。大量研究已证实，生理性直流电场在胚胎发育、细胞分化和伤口愈合过程中对细胞运动的引导具有重要作用。将微流控芯片应用于电趋性检测，可缩短实验周期并最大限度减少实验误差。近年来，由聚合物材料制成的微流控装置例如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，又称丙烯酸）或聚二甲基硅氧烷（PDMS）已被广泛用于研究细胞对电刺激的响应。然而，与制备PDMS器件所需的多个步骤相比，丙烯酸微流控芯片具有构造简单、制作快速的优点，适用于器件的原型开发与批量生产。但迄今为止报道的器件均未能有效支持对细胞同时受到化学刺激和直流电场（dcEF）作用的高效研究。本报告中，我们介绍了一种基于丙烯酸材料的多通道双电场（MDF）芯片的设计与制备，用于研究化学与电刺激对肺癌细胞的协同作用。该MDF芯片可在单次实验中提供八种不同的电/化学刺激组合，不仅显著缩短了实验所需时间，还提高了电趋性研究的准确性。

引言

贴壁细胞在直流电场（dcEF）作用下向阳极或阴极移动的行为被称为电趋性。细胞的电趋性行为在胚胎发育、神经再生和伤口愈合过程中发挥着重要作用。¹ 已有研究表明，大鼠前列腺癌细胞²、乳腺癌细胞³以及肺腺癌细胞^4-8在施加的直流电场下均表现出电趋性运动。生理电场已在腺体组织中被检测到。^9,10 在与腺体相关的肿瘤细胞中也报道了电趋性现象。^2,3 综上所述，癌细胞的电趋性被认为是一种促进转移的因素。¹¹ 在直流电场下调控癌细胞的电导向行为，可能为未来癌症治疗提供一种潜在策略。然而，目前关于电趋性的分子机制仍存在争议。因此，研究电刺激对癌细胞迁移的影响，有助于推动癌症治疗策略的发展。

近年来，已制备出生物微流控装置，用于在体外研究细胞对流动剪切力¹²、化学梯度¹³和电刺激⁴的响应。采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，又称丙烯酸）制备生物微流控装置，已成功降低了此类实验的失败率。此外，与使用PDMS芯片相比，采用基于丙烯酸的微流控装置作为研究生物样本的原型更为简便。基于丙烯酸的装置已开发出多种功能，用于趋电性研究。然而，以往的设计均无法在趋电性研究中同时检测多种化学条件和电场对细胞的影响。因此，我们开发了一种微流控装置——多通道双电场（MDF）芯片，该芯片包含四个独立的培养通道，可在单个芯片上实现八种不同的实验条件。

基于丙烯酸的MDF芯片最初由Hou et al.⁸ 报道，集成了电刺激和多个化学隔离的通道。这些化学隔离的通道可用于在一次实验中培养不同类型的细胞。通道内的dcEF由电源产生。每个化学隔离通道内可同时施加两个独立的电场，其中一个施加电场强度（EFS），另一个则为0 EFS。通过这种方式，该芯片可实现对共存的电场与化学刺激更精确的控制。此外，MDF芯片内部化学物质扩散的数值模拟结果表明，在24小时实验周期后，各通道之间未发生交叉污染。⁸

与Li 等¹⁴报道的装置相比，MDF芯片提供了更大的培养区域，从而可对电刺激细胞进行进一步的生化分析。此外，由于MDF芯片具有更大的观察区域，实验中可观察到更多细胞，因此对电刺激细胞迁移速度或迁移方向性的分析更为准确。Huang 等⁴和Tsai 等¹⁵先前研究所报道的单通道芯片设计仅允许测试一种类型的细胞或化学物质。然而，MDF芯片可用于研究多种化学物质对电趋性的影响，以及电刺激对不同类型细胞的作用。换句话说，MDF芯片能够高效地研究化学剂量依赖性。

方案

1. MDF芯片的设计与制备

1. 使用商业软件（如 AutoCAD）绘制单个丙烯酸层的图案，并保存该图案。
   1. 查看 图1A 中四层丙烯酸板图案的设计，并确认层间连接结构。
2. 使用 CO₂ 激光刻蚀机通过激光烧蚀法加工所有丙烯酸板和双面胶带（图1B、图2A 和 图2B）¹⁶。
   1. 打开激光刻蚀机，并将设备连接至控制用笔记本电脑。
   2. 运行商业软件，点击 "设计好的图案文件"，打开步骤 1.1 中设计的图案。
   3. 将一块空白丙烯酸板或双面胶带放置在激光刻蚀机的 X-Y-Z 工作台上。
   4. 使用激光刻蚀机制造商提供的自动对准棒，将激光束焦点对准丙烯酸板或双面胶带的表面。
   5. 将设计好的图案发送至激光刻蚀机，直接加工丙烯酸板或双面胶带。
3. 使用镊子去除丙烯酸板上的保护纸，并用氮气吹扫表面以清洁。
4. 将丙烯酸板堆叠后，在热压机中于 110 °C 下以 2 kg/cm² 的压力键合 45 分钟，形成流体/电刺激通道组件。
5. 准备显微镜盖玻片，作为芯片中的细胞培养基底。
   1. 将盖玻片放入染色缸中，并用材料清单中所列洗涤剂的十倍稀释液充满染色缸。
   2. 将盖玻片和染色缸放入超声波清洗器中，清洗盖玻片 15 分钟。
   3. 倒出稀释后的洗涤剂，重新注入蒸馏水，重复步骤 1.5.2 三次。
   4. 在将盖玻片粘附至双面胶带前，用氮气吹干已清洗的盖玻片。
6. 将清洁后的盖玻片通过步骤 1.2 中图案化的双面胶带粘附到流体/电刺激通道组件上。
7. 使用瞬干胶将 13 个丙烯酸接头分别粘接到 MDF 芯片组件第一层的各个开口处。此时 MDF 芯片组件即已完成（图2D）。
8. 使用紫外光照射 30 分钟对完整的 MDF 芯片组件进行灭菌，然后投入使用。

2. MDF芯片盐桥网络的设置

1. 使用前，将 图3B 中所示的所有塑料管、手拧螺母和微量离心管置于高压灭菌锅中，在 121 °C 下保持 15 分钟进行灭菌。
2. 通过 图1A 所示的培养基入口和出口接头，将氟塑料管（图3B-i）连接至 MDF 芯片组件。
3. 将 图3B-i 中培养基入口和出口塑料管的鲁尔锥形接头连接至三通旋塞阀。
4. 使用 3 ml 注射器吸取 2.5 ml 已平衡 CO₂ 的磷酸盐缓冲液（PBS），并将该注射器连接至入口塑料管的三通旋塞阀。将一个空的 3 ml 注射器连接至出口塑料管的三通旋塞阀。这样，两个注射器便通过 MDF 芯片相互连通。
   注：将 PBS 置于 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中过夜孵育，以获得 CO₂-平衡的 PBS。
5. 使用白色实心手拧螺母（图3B-iii）密封第一层 PMMA 板上蓝色和绿色接头（图1A）的开口。
6. 使用步骤 2.4 中所述注射器内的 CO₂-平衡 PBS 填充盐桥通道和培养室，避免产生气泡。
7. 随后，将含有 CO₂-平衡 PBS 的 MDF 芯片放入 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中过夜孵育。此步骤可使双面胶中溶解的空气在腔室内形成气泡。
8. 利用两个注射器在通道内快速推动 PBS 流动，以冲走通道中的气泡。如有必要，可反复抽吸 PBS。
9. 通过连接至培养基出口管的三通旋塞阀排出通道中的 PBS。
10. 使用一支新的 3 ml 注射器吸取 2.5 ml CO₂-平衡的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（见步骤 3.5），替换连接在入口处的注射器，并重新用培养基填充通道。
11. 盐桥网络的制备。
    1. 暂时移除绿色接头（图1A）上的实心螺母（图3B-iii），通过绿色接头（图1A）的开口向盐桥通道中注入 3% 的热琼脂糖溶液（>70 °C）。
       注：热琼脂糖的配制方法：将 1.5 g 琼脂糖粉末溶解于 50 ml PBS 中，在高压灭菌锅中于 121 °C 保持 20 分钟进行灭菌。
    2. 当液体填充至盐桥通道长度的四分之三时，停止注入琼脂糖。
    3. 琼脂糖注入后，通过拧紧实心螺母（图3B-iii）密封绿色接头（图1A）上的孔。
    4. 将蓝色接头（图1A）上的实心螺母更换为半透明管状手拧螺母（图3B）。
    5. 将 3% 预热的琼脂糖装入管状螺母（图3B-iv）中。
    6. 在琼脂糖凝固前，将 Ag/AgCl 电极（图3B-v）嵌入管状螺母（图3B-iv）中。
12. 完成盐桥网络的组装后，将 CL1-5 肺癌细胞逐个注入各个培养室中。

3. 癌细胞的准备及电趋性实验的建立

1. CL1-5肺癌细胞系的常规培养。
   1. 培养由潘潘哲教授提供的CL1-5肺癌细胞，¹⁷ 在37℃的75T细胞培养瓶中的完全培养基中 °C，5% CO₂条件下₂ 大气环境。完全培养基由DMEM和10%胎牛血清（FBS）组成。每3至4天传代一次细胞。用于电趋化实验的细胞代数不超过从原始来源传代25次。
2. 向指数生长期的 CL1-5 细胞中加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶缓冲液，在 37 ℃孵育 2 分钟 °C 5%-CO₂₂ 用于细胞解离的细胞培养箱
3. 用6 ml含10% FBS的DMEM终止消化过程，于室温下以300 g离心5 min。弃去上清液，用5 ml PBS重悬细胞沉淀。
4. 统计 PBS 中的细胞数量，然后取 1 x 10⁶ 细胞在室温下以300 g离心5分钟。
5. 弃去 PBS。用预热的 CO₂-平衡的DMEM，并将细胞密度调整为1 × 10⁶ 细胞/毫升
   注意：将完全培养基在37℃孵育 °C 5%-CO₂₂ 细胞培养箱中过夜培养以获得CO₂-平衡的DMEM。

4. 电趋性实验的设置

1. 从MDF芯片的出口处注入0.3 ml、1 × 10⁶/ml 的细胞加入芯片中。
2. 将接种细胞的MDF芯片置于细胞培养孵育箱中（设置为37 °C 和 5% CO₂₂2-4 小时
3. MDF微流控系统的搭建
   1. 将MDF微流控系统安装在透明的氧化铟锡玻璃（ITO）加热器上。使用K型热电偶夹在MDF芯片与ITO玻璃之间，测量MDF芯片的温度。通过比例-积分-微分（PID）控制器调节ITO加热器。将MDF微流控系统的孵育温度设置为37 °C，使用PID控制器。
      注意：ITO加热器的制备及细胞培养加热系统的搭建方法详见此前的报道。^18,19
   2. 将温控MDF芯片组件安装在倒置显微镜的计算机控制X-Y-Z电动平台上。电动平台的使用方法见步骤5.1。通过入口利用四通道注射泵将完全培养基泵入培养腔室。
4. 以 20 μl/hr 的流速将完全培养基泵入 MDF 芯片中。出口处的培养废液收集于微量离心管中（如图所示） "废弃物" 在 图3A).
5. 在MDF芯片中，将细胞于37 °C继续孵育16–18小时。
6. 分别将含有 50、25、5 和 0 µM 激酶抑制剂的培养基以 20 μl/min 的流速泵入各培养腔室，持续 10 分钟，以更换培养基。
   注意：通过将 3 ml 无菌水加入 10.6 mg 的 Rho 相关蛋白激酶抑制剂 Y27632 中，配制 10 mM 的母液。使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基将 10 mM 母液分别稀释至 50、25 和 5 µM。
7. 将细胞在激酶抑制剂中于37 °C继续孵育60分钟。将培养基流速设定为20 μl/hr。后续步骤中使用上述相同的培养温度和流速。
8. 使用导线将直流电源通过芯片上的 Ag/AgCl 电极连接到 MDF 芯片。
9. 在电路中串联连接一个电流表。使用电流表监测MDF芯片中的电流。
10. 打开直流电源，通过调节电源电压至15至19 V之间，将电流表电流调至86.94 μA。
    注意：根据欧姆定律，E = I/(σA_eff），其中 I 为流经块体材料的电流， 即，电趋性培养室中的培养基，σ（= 1.38 Ω⁻¹·m⁻¹）⁻¹m⁻¹) 为培养基的电导率，A_eff （= 0.21 mm）² 有效横截面积为3 mm宽×0.07 mm高，是电趋化室的有效横截面积，而在MDF芯片中产生300 mV/mm电场所需的电流（I）为86.94 μA。

5. 细胞图像的采集与分析

1. 使用 MATLAB 图形用户界面（GUI）程序控制电动载物台。将 MDF 微流控系统安装在显微镜上后，利用电动载物台将芯片移动至观察区域。
2. 使用安装在显微镜上的数码单反（SLR）相机记录细胞图像。
3. 使用 4X 物镜每隔 15 分钟拍摄一次显微图像，持续 2 小时。
4. 细胞迁移分析。
   1. 运行 NIH ImageJ 1.47 V 软件。
   2. 分析细胞质心从初始位置到最终位置的距离。
   3. 进入 "文件"→"导入"→"图像序列"，导入九幅图像用于细胞迁移分析。第一幅图像为 0 分钟时的结果，最后一幅图像为 120 分钟时的结果。
   4. 进入 "分析"→"设置测量值"，勾选 "质心" 旁边的复选框。
   5. 点击 "自由手选区" 图标。
   6. 在第一幅图像中标绘所选细胞的边缘。
   7. 进入 "编辑"→"选区"→"添加到管理器"。
   8. 转到第九幅图像，并标绘与第一幅图像中所选相同的细胞边缘。可利用第二至第八幅图像追踪细胞位置。
   9. 进入 "编辑"→"选区"→"添加到管理器"。
   10. 重复步骤 5.4.5 至 5.4.9，以收集 90 至 100 个细胞的数据。
   11. 进入 "分析"→"测量"，获取所选细胞初始和最终位置的结果。
       注：迁移速度定义为每小时细胞平均移动距离。迁移方向性定义为余弦值，其中为直流电场向量（从阳极指向阴极）与细胞起始点至最终位置向量之间的夹角。迁移方向性为 −1 表示细胞向阳极迁移，+1 表示细胞向阴极迁移。对于一组随机迁移的细胞，其迁移方向性为 0。²

结果

MDF 装置的制备与组装

基于丙烯酸的MDF芯片的示意图如图所示 图1A. 组装完整的MDF芯片时使用了四块丙烯酸板、一块盖玻片、13个丙烯酸适配器以及一段双面胶带（图 2D）。MDF 装置中仅有四个独立的培养通道。然而，芯片上的盐桥网络在芯片的八个区段中创建了八种不同的实验条件。三个盐桥（第二层中的蓝色通道） 图1A），长度分别为79、90和80 mm，连接至MDF芯片的第二层，且不影响图像观察。微小孔道（第3层和第4层中的蓝色长方体通道） 图1A) 盐桥网络与培养室之间，培养室具有 0.25 mm² 横截面积，最大限度减少了实验过程中液体向盐桥的流动。MDF芯片的培养区域约为74 mm² 每个区段中。在此演示中，MDF 装置的细胞培养室由...

讨论

我们发现将丙烯酸适配器粘附到MDF芯片的第一层上是一个较为棘手的过程。仅使用1至2 μl的瞬干胶即可牢固地将适配器粘附在MDF芯片上。使用较多的胶量反而会导致瞬干胶聚合不完全，从而粘附失败。一旦丙烯酸适配器牢固地粘附在MDF芯片上后，微流控系统中的液体泄漏现象极少发生。此外，在真空室中过夜 孵育有助于去除双面胶带/盖玻片或双面胶带/丙烯酸板界面之间夹带的空气。因此，该过程增强了MDF芯片中培养腔室的稳定性。

在制备盐桥网络时，对3%琼脂糖的温度控制非常重要。如果注射时琼脂糖温度不够高，琼脂糖会迅速在注射器内凝固，无法注入盐桥网络中。此外，在琼脂糖注射过程中，应避免盐桥网络中产生任何气泡。气泡的出现会显著增加网络的电阻，导致实验失败。同时，若琼脂糖在注射过程中过早凝固，则可能无法完全阻断盐桥通道中的液体流动，从而使化学物质容易泄漏到其他通道中。最佳方法是将加热后的琼脂糖注入网络，随后让其在盐桥通道内完全凝固。

细胞注射是趋电性实验中的关键步骤。为了确保培养室中细胞接种时有足够数量的细胞，我们注入了过量的细胞。在此方法中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
DMEM 培养基	Gibco,Invitrogen, USA	12800-017
胎牛血清	Gibco,Invitrogen, USA	16000-044
胰蛋白酶	Gibco,Invitrogen, USA	25200-072
PBS	Basic Life	BL2651
Y-27632（盐酸盐）	Cayman Chemical Co	10005583
琼脂糖	LONZO, USA	SeaKem LE AGAROSE
注射器	Terumo	3 ml 带鲁尔锥形接口
三通阀	Nipro	带鲁尔锥形接口
PMMA（丙烯酸）	HiShiRon Industries CO., Ltd, 中国台湾		厚度 1 mm, 2 mm
丙烯酸适配器	KuanMin Technology Co., Ltd, 台中, 中国台湾	1/4-28 接口, 10x10x6 mm	定制
螺母	Thermo Fisher Scientific Inc.	UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
显微镜盖玻片	Deckgläser, Germany	24x60 mm
双面胶带	3M	PET 8018
强力胶	3M	Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 洗涤剂	Franklab, France	TFD4
超声波灭菌清洗机	LEO ULTRASONIC CO., LTD., 中国台湾
热封仪	KuanMin Technology Co., Ltd, 台中, 中国台湾	定制
CO2 激光刻划仪	LTT group, 中国台湾	ISL-II
比例-积分-微分（PID）控制器	JETEC Electronics Co., Japen	TTM-J40-R-AB,
K 型热电偶	TECPEL	TPK-02A
四通道注射泵	KdScientific, USA	250P
直流电源	GWInstek, 中国台湾
X-Y-Z 电机载物台	TanLian, E-O Co. Ltd., 中国台湾	定制
倒置显微镜	Olympus, Japan	CKX41
数码单反相机	Canon, Japan	60D