类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射

摘要

由干细胞衍生的培养物在模拟感染性疾病方面具有巨大潜力。本文介绍了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官的培养方法。通过显微注射将胃部病原体Helicobacter pylori注入类器官中。

摘要

近年来，感染生物学研究人员已采用干细胞来源的培养体系，以满足对新型且更优模型的需求，用于研究宿主与病原体之间的相互作用。目前使用了三种细胞来源：胚胎干细胞（ESC）、诱导性多能干细胞（iPSC）或成体干细胞。本文描述并应用了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官培养方法，并用于胃部病原体Helicobacter pylori的感染实验。人类胃腺体从手术切除组织中分离，接种于基底膜基质中，并包埋在含有表皮生长因子（EGF）、R-spondin、Noggin、Wnt、成纤维细胞生长因子（FGF）10、胃泌素以及转化生长因子（TGF）β抑制剂等生长因子的培养基中。在此条件下，胃腺体可发育为包含胃部四种细胞谱系的三维类器官。这些类器官可无限扩增，并可像细胞系一样进行冻存与复苏。在感染研究中，将细菌微量注射至类器官腔内，随后对感染后的类器官进行成像处理。所述方法可推广至其他类器官系统，并可用于其他细菌、病毒或寄生虫的感染研究，从而实现对原代细胞中感染诱导变化的深入分析。

引言

病原体的研究依赖于合适的模型系统来模拟 体内 感染。对于某些病原体，尚缺乏适当的模型系统，而一些现有模型系统也远未达到理想状态。一个例子是胃部细菌 幽门螺杆菌 (H. pylori），与胃癌的发生有因果关系。然而，由于缺乏更合适的细胞培养系统，许多旨在分析癌症发生分子机制的研究仍使用代表癌症终末阶段的癌细胞系。对于此类研究而言，原代非转化细胞将是更理想的模型。但原代细胞仅能从少数供体获得，且无法长期培养。近年来，干细胞研究取得了显著进展，为感染生物学研究提供了新的原代细胞培养来源。

已使用三种干细胞来源的培养物：胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）或成体干细胞。这些培养物已被用于模拟病毒感染（如巨细胞病毒^1,2或丙型肝炎病毒^3–7）、寄生虫感染（如Plasmodium falciparum⁸或Toxoplasma gondii⁹）以及细菌感染（如Bacteroides thetaiotaomicron¹⁰或Salmonella enterica¹¹）。最近，已有若干研究报道了利用来自ESC或iPS细胞的类器官¹²、小鼠成体干细胞的类器官....

方案

1. 胃类器官培养体系的建立

注意：本方案可用于从小鼠或人体组织中分离胃腺。建议使用约 1 cm² 的组织。人体组织可来源于胃部切除术或活检样本。

1. 材料准备
   注意：所使用的基底基质为 Matrigel。始终将基底基质置于冰上。基底基质应储存于 -20 °C，并在使用前于冰上解冻。基础培养基指添加了 HEPES 的 Advanced DMEM/F12，以及适当的谷氨酰胺来源（如 Glutamax）和适当的抗生素（如 1x Primocin）。所使用的培养箱为标准细胞培养箱（37 °C，湿润环境，5% CO₂）。
   1. 通过高压灭菌或使用 100% 异丙醇对准备用具进行灭菌：锐利镊子、剪刀、手术刀和玻璃显微镜载片。
   2. 分离前一天，将 24 孔细胞培养板放入培养箱中。
   3. 根据生产商的建议制备基底基质。将其分装为 1 ml 的小份，以避免反复冻融循环。
   4. 制备 500 ml 螯合缓冲液并置于冰上冷却。使用无菌去离子水配制 1x 缓冲液，其中包含 5.6 mM Na₂HPO₄、8.0 mM KH₂PO₄、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mM 蔗糖、54.9 mM D-山梨醇、0.5 mM DL-二硫苏糖醇（注意：CAUTION），pH 7....

结果

本方案可用于分离胃腺（图2）。将胃腺接种至基底膜基质中，基质在孔内形成凝固的液滴，提供富含层粘连蛋白和胶原蛋白的三维结构，支持胃腺生长为类器官（图3）。类器官通常最初表现为小囊泡，12–16天内逐渐扩展为直径50–300 µm的球形结构（图4）。部分类器官保持囊状结构，部分则会形成小的出芽结构，后者通常是培养状态良好的标志。本方案中，每孔使用24孔板的一孔，接种100个胃腺，加入50 µl基底膜基质和500 µl培养基。但该体系可根据需要进行放大或缩小。

在体视显微镜下可轻易观察到显微注射是否成功，表现为浑浊的细菌溶液充满类器官（图5）。经过适当的孵育时间后，可对类器官进行任何所需的分析方法处理。例如，可将类器官包埋于石蜡中，切片后采用标准的免疫组织化学技术进行染色。对免疫染色后的类器官进行显微观察，可证明细菌已成功注入（图6）。

讨论

本方案描述了利用成体干细胞来源的不断扩增的未转化原代类器官进行感染生物学研究的方法。关键步骤包括：i）活性腺体的分离，ii）类器官的扩增，以及 iii）显微注射。以下是一些关于方案修改、问题排查和技术注意事项的建议。

与其他使用剧烈振荡或移液来释放腺体且同样有效的方法相比，本文所述技术的优势在于，可在显微镜下直接观察腺体从组织中的释放过程（步骤 1.2.14）。若腺体未被释放，可调整 EDTA 孵育条件（参见步骤 1.2.9）。如需要，也可尝试通过剧烈振荡来分离腺体，并参照小鼠肠隐窝的方法，在显微镜下检测上清液中是否存在腺体²⁶。在洗涤步骤中，即使分离的腺体发生解体也无关紧要。类器官仍可由腺体碎片甚至单个干细胞启动形成，这一点已有研究证实^{13,18, 27}。

当腺体已分离并接种，但类器官未按预期扩增时，应首先对Wnt和R-spondin的活性进行故障排查。这两种因子对类器官的扩增至关重要，建议通过以下方法检测这两个因子的功能活性： 体外 例如，使用荧光素酶的TOP .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基
HEPES	Invitrogen	15630-056
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
Matrigel, GFR, 无酚	BD	356231
GlutaMAX	Invitrogen	35050-079	储存液浓度 200 mM，终浓度 2 mM
B27	Invitrogen	17504-044	储存液浓度 50 倍，终浓度 1 倍
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-5G	储存液浓度 500 mM，终浓度 1 mM
小鼠重组 EGF	Invitrogen	PMG8043	储存液浓度 500 µg/ml，终浓度 50 ng/ml
人重组 FGF10	Peprotech	100-26	储存液浓度 100 µg/ml，终浓度 200 ng/ml
TGFβi A-83-01	Tocris	2939	储存液浓度 500 µM，终浓度 2 µM
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636	储存液浓度 1 M，终浓度 10 mM
[Leu15]-胃泌素	Sigma-Aldrich	G9145	储存液浓度 100 µM，终浓度 1 nM
RHOKi Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	储存液浓度 10 mM，终浓度 10 µM
Wnt3A 条件培养基			Clevers 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 50%。细胞可向 Hans Clevers 获取。
R-spondin1 条件培养基			Kuo 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 10%。细胞系可向 Calvin Kuo（斯坦福大学）获取。
Noggin 条件培养基			Clevers 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 10%。细胞可向 Hans Clevers 获取。
R-spondin3	R&D	3500-RS/CF	R-spondin 的替代来源。已在人肠道类器官中测试（1 µg/ml），但尚未在胃类器官中测试。
Noggin	Peprotech	120-10	Noggin 的替代来源。已在人肠道类器官中测试（100 ng/ml），但尚未在胃类器官中测试。
TrypLE express	Life Technologies	12605036	酶解解离溶液
CoolCell® 无酒精细胞冻存容器	biocision	BCS-405
Recovery 细胞培养冻存培养基	Invitrogen	12648-010
抗生素
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	一种针对细菌和真菌的抗生素混合物。在培养起始阶段使用有益。长期培养时可更换为其他抗生素或不使用。
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122	储存液浓度 10,000/10,000 U/ml，终浓度 100/100 U/ml。可在长期培养中替代 Primocin 使用。
其他
镊子	Neolabs	2-1033	尖端细小的镊子有助于从组织中去除肌层。
4 孔多孔板	Thermo Scientific	144444	可使用其他多孔板。此类多孔板特别适用于显微注射，因其外缘较低，便于操作器移动。
显微操作器	Narishige	M-152
显微注射仪	Narishige	IM-5B
体视显微镜	Leica	MZ75
工作台	Clean Air		定制，适用于在 ML2 条件下放置体视显微镜
毛细管	Harvard Apparatus	GC100T-10	外径 1 mm，内径 0.78 mm。
微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	Flaming Brown 微量移液器拉制仪
抗 Cag A 抗体	Santa Cruz	sc-25766