步特定老鼠的精子细胞分选流式细胞仪

摘要

我们描述了使用流式细胞术对小鼠精子细胞的分选策略。精子细胞分为四个高纯度种群，包括圆形（精子发生步骤 1-9）、早期伸长（精子发生步骤 10-12）、晚期伸长（精子发生步骤 13-14）和细长精子细胞（精子发生步骤 15-16）。DNA 染色、大小和粒度用作选择参数。

摘要

小鼠精子细胞分化是用于生产的官能雄性配子具有完整基因组中的一个关键的工艺要发送给下一代。到目前为止，这种形态转变的分子研究受到阻碍，缺乏一种方法允许精子细胞分化为后续分析这些重要步骤，充分分离。因为在精子细胞进行染色质重塑一个奇特的增加，DNA荧光在这些细胞使用流式细胞仪的正常浇注较早尝试可能是困难的。基于这一观察，我们提供了一个简单的流式细胞术方案细节，让四个种群的小鼠精子细胞固定用乙醇可重放纯化，每个代表在核重塑过程不同的状态。富集的人口使用步骤的具体指标和形态准则确认。纯化的精子细胞，可用于基因组和蛋白质组IC分析。

引言

单倍体圆形精子细胞通过称为精子发生的过程分化成精子。这涉及许多不同的步骤，包括获得鞭毛、染色质和细胞骨架重塑、细胞核浓缩以及大部分细胞质的丢失。这些独特的细胞事件必须受到精细调节，才能产生具有适合受精的完整基因组的成熟功能性配子。精子发生几乎无法在体外研究，因为到目前为止，没有可靠的细胞培养系统能够支持该过程的不同步骤的进展。此外，实际的体外技术导致产量不佳^1,2。在体内，通过精子发生的不同步骤的正确过渡对于雄配子的自然功能完整性至关重要。根据精子细胞的分化步骤成功纯化精子细胞，其富集水平从未达到足以允许精子发生的分子表征。例如，纯化精原细胞分化的关键步骤对于研究发育中的顶体、中间体的形成³、细胞连接动力学⁴、RNA 动力学⁵、染色质重塑过程^6,7 或基因组稳定性⁸ 特别有用。精子细胞的纯化受到其进行性形态转变、缺乏已知的阶段特异性外部生物标志物以及它们奇特的形状和大小的阻碍。

尽管大多数雄性生殖细胞显示出 DNA 染色和倍性（DNA 含量）之间的直接关系，但我们注意到这种正相关不再适用于精子细胞。这源于我们的早期观察，即生精小管切片在不同的精子发生步骤中显示出不同强度的 DNA 染色。尽管 DNA 染色与精子发生步骤 1 至 7 （圆形精子细胞） 中的单倍体染色体组一致，但我们观察到 DAP....

方案

动物保健是按照舍布鲁克大学动物护理和使用委员会。

1.管子准备

1. 细胞分选前一天，加1-2热灭活的胎牛血清（FBS）中的溶液至5毫升聚丙烯圆底管中，15毫升和50毫升聚丙烯锥形管。
   关键的一步:确保在协议中使用的每个管涂层。
   注意:FBS涂层防止生殖细胞粘到管壁。
2. 慢慢地，管均匀使用旋转器以4°C到外套搭配O / N的反转。
3. 第二天，通过倾析从包被的管中删除FBS中。
   1. *关键的一步:确保中的5毫升聚丙烯圆底管及用于细胞制备的15和50毫升管（协议步骤2.1至2.11）被完全清空FBS，以防止煽动（侧流也就是不精确的偏差）。使用P200的吸管去除FBS。
      注:残余之前排序可能导致细胞或在细胞分选使用的其它管的污染的损失FBS的管，
   2. 离开的FBS（约100-200微升）在5 ​​ml的聚丙烯轮用于收集纯化的细胞底管小的残留量。

2.细胞的制备

1. 用_O 2 /异氟醚（归纳为5％，那么保持在2％），其次是_二氧化碳窒息牺牲一只公鼠在麻醉下。
2. 消费和解封装双侧睾丸和讳言与在500μl分类缓冲器到1.5毫升管的小剪刀。
3. 冲洗生殖细胞从输精管通过温和上下吹....

结果

使用流式细胞仪门控策略

图1表示了流式细胞用于四个高纯度精子细胞种群进行排序选通策略。简而言之，将细胞与阳性DNA染色（的Alexa Fluor 488-A）的第一个带门从精子1.精子细胞的步骤1-12被选择（栅极2）上选择一个点图表示granulosity（SSC-A）与大小（FSC -A）从门1。然后，从精子的精子细胞的步骤1-9和精子步骤10-12可以彼此根据DNA染色强度的变化来分离（盖茨5和6）。从精子的精子细胞的步骤13-14和15-16是直接从阳性染色细胞上选择一个点图表示大小（FSC-A）对DNA染色（的Alexa Fluor 488-A），（盖茨3和4）。所有分类的人群被重新定义的Alexa Fluor 488-W VS的Alexa Fluor 488-A斑点杂交增加 IR纯度。

.......

讨论

生精细胞始终是具有挑战性的研究给出的生精上皮的复杂性， 以及在体外培养的有限的成功。多年来，许多方法来净化来自不同物种生殖细胞被开发。利用重力纯化用的Percoll或牛血清白蛋白梯度沉降技术通常提供完整生发细胞的良好的产率，但缺乏某些类型的细胞之间的适当定义如减数分裂四倍体细胞和精子细胞^10。而且，这些技术需要特殊的装置（通常自制的）可能不容易获得许多实验室，这使得它们难以无需繁琐的试验和错误重现。这些方法也费时，对振动非常敏感且不方便作为装置通常保持在4℃，以保持细胞生存力。如果成功，沉淀法却提供了数百万纯净生活Ç每个人口ELLS。然而，细胞富集程度低，可以实现是这些技术的主要缺点，因为它很少达到超过80-90％纯度。在某些情况下，当由DNA，RNA或蛋白质含量，这是一个重大的障碍分子分析测定的10-20％的从其它细胞类型的污染是否存在。

当寻求改善细胞群的纯度，一些研究者已经联合重力沉降到其他的方法。其中最有效的方法是使用未成熟的小鼠，以限制不同细胞群体代表稍后阶段的数目。人们可以采取生精第一波的优势，获得包含生殖细胞达.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟醚	ABBOT	05260-05	用于安乐死前的小鼠麻醉
胎牛血清	Wisent	90150	用于试管包衣
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	用于分选缓冲液制备
HEPES	Sigma	H	用于分选缓冲液制备
100% 乙醇	Les alcools de commerce	092-09-11N	用于细胞固定
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA 染色
5 ml 聚丙烯圆底管	BD Falcon	352063	分选细胞采集
15 ml 聚丙烯锥形底管	PROgene	1500
50 ml 聚丙烯锥形底管	PROgene	5000
TEC4 麻醉蒸发器	Ohmeda	1160526	用于小鼠安乐死
CO2 气罐	Praxair	C799117902	用于小鼠安乐死
O2 气罐	Praxair	O254130501	用于小鼠安乐死
自制小鼠气室			用于小鼠安乐死
40 µm Falcon 细胞过滤器	Corning Incorporated	352340
50 μm 样品管线过滤器	BD Biosciences 649049
涡旋混合器	Labnet international， inc.	S0200	用于细胞固定
Dynac 离心机	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm 过滤器	Partec	04-004-2327
488 nm 激光免疫细胞分选仪	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop 荧光珠	BD Biosciences	345249
分选缓冲液：1x PBS，1 mM EDTA pH 8.0,25 mM HEPES pH 7.0,1% FBS			FBS 热灭活。制作新鲜溶液，0.22 &μ;m 过滤并保持在 4>C。