通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

摘要

我们描述了一种利用流式细胞术对小鼠精子细胞进行分选的策略。精子细胞被分为四个高纯度的群体，包括圆形精子细胞（精子形成阶段1-9）、早期伸长精子细胞（精子形成阶段10-12）、晚期伸长精子细胞（精子形成阶段13-14）以及伸长型精子细胞（精子形成阶段15-16）。分选依据包括DNA染色、细胞大小和颗粒度。

摘要

小鼠精子细胞的分化是产生具有完整基因组的功能性雄性配子并将其传递给下一代的关键过程之一。迄今为止，由于缺乏能够有效分离精子细胞分化各个重要阶段的方法，针对这一形态学转变的分子研究一直受到阻碍。此前尝试使用流式细胞术对这些细胞进行准确设门可能较为困难，原因在于正在经历染色质重塑的精子细胞中DNA荧光会出现特殊增强。基于这一现象，我们提供了一种简单的流式细胞术方案的详细步骤，可对经乙醇固定的四种小鼠精子细胞群体进行可重复的纯化分离，每一群体代表核重塑过程中的不同状态。通过阶段特异性标记物和形态学标准验证了各群体的富集效果。所获得的高纯度精子细胞可用于基因组学和蛋白质组学分析。

引言

单倍体的圆形精子细胞通过一个称为精子形成的过程分化为精子。该过程包含多个不同的步骤，包括鞭毛的获得、染色质和细胞骨架的重塑、细胞核的浓缩以及大部分细胞质的丢失。为了产生具有完整基因组、能够正常受精的成熟功能性配子，这些独特的细胞事件必须受到精细调控。精子形成极难被研究 体外 由于目前尚无可靠的细胞培养系统能够支持该过程各个阶段的顺利推进。此外，实际 体外 技术导致产率低下^1,2. 体内，精子形成过程中各阶段的正常过渡对于雄性配子的自然功能完整性至关重要。迄今为止，尚未实现按精子细胞分化阶段进行成功纯化，以达到足以支持精子形成过程分子特征分析的富集水平。例如，若能纯化精子细胞分化过程中的关键阶段，将特别有助于研究顶体的发育以及中段的形成³细胞连接动态⁴，RNA 动态学⁵染色质重塑过程^6,7 或基因组稳定性⁸精子细胞的纯化一直受到其持续进行的形态学转变、缺乏已知的阶段特异性外部生物标志物以及其特殊的形状和大小的限制。

尽管大多数雄性生殖细胞的DNA染色强度与倍性（DNA含量）之间存在直接的正相关关系，但我们注意到这种正相关性不再适用于精子细胞。这一发现源于我们早期的观察：生精小管切片在精子形成的不同阶段表现出不同的DNA染色强度。虽然从精子形成第1至第7阶段（圆形精子细胞）的DNA染色强度与其单倍体染色体组一致，但我们观察到在核重组和染色质重塑开始时（精子形成第8阶段），使用DAPI或SYTO 16染色的荧光强度显著增加，并在核浓缩开始时达到峰值（精子形成第11-12阶段）。在细胞核浓缩之后，DNA染色强度逐渐下降，直至精子释放（精子形成第16阶段）。我们推测，这种现象可能与精子细胞特有的染色质结构转变有关，即组蛋白被鱼精蛋白所取代。因此，我们开发了一种可靠的流式细胞术方法，利用精子细胞DNA染色强度的变化作为主要筛选参数，实现对精子细胞的有效分离。

本文介绍了一种简单的流式细胞术方法，可根据小鼠精子细胞的表观DNA含量（SYTO16染色）、细胞大小和颗粒度，以高纯度（95–100%）分离精子细胞。精子细胞被分为四个群体：精子形成阶段1–9、10–12、13–14和15–16。所获得的纯化精子细胞适用于遗传学/基因组学分析，以及蛋白质组学研究，正如我们课题组近期发表的一项研究所述⁹。

方案

动物护理遵循舍布鲁克大学动物护理与使用委员会的规定。

1. 试管准备

1. 细胞分选前一天，向5 ml聚丙烯圆底管以及15 ml和50 ml聚丙烯锥形管中各加入1–2 ml热灭活的胎牛血清（FBS）。
   关键步骤：确保本方案中使用的所有管子均已被涂覆。
   注意：FBS包被可防止生殖细胞黏附于管壁。
2. 将管子置于4 °C缓慢旋转（如翻转混合）过夜，以使管壁均匀包被。
3. 次日，通过倾倒法去除已包被管中的FBS。
   1. *关键步骤：确保用于细胞制备（方案步骤2.1至2.11）的5 ml聚丙烯圆底管以及15 ml和50 ml管完全倒空FBS，以防止扇流（i.e. 侧流偏离精确路径）。使用P200移液器彻底移除残留FBS。
      注意：分选前若管内残留FBS，可能导致细胞丢失或在细胞分选过程中污染其他管子， 
   2. 在用于收集纯化细胞的5 ml聚丙烯圆底管中，保留少量残留FBS（约100–200 µl）。

2. 细胞制备

1. 使用 O₂/异氟烷（诱导浓度为 5%，维持浓度为 2%）对一只雄性小鼠进行麻醉后，再通过 CO₂ 窒息法处死。
2. 取出双侧睾丸并去包膜，用小剪刀在 1.5 ml 离心管中的 500 µl 分选缓冲液中剪碎。
3. 在 1.5 ml 离心管中，先用截短的 100–1,000 µl 吸头，再用完整的 100–1,000 µl 吸头，通过轻柔的上下吹打，将生精细胞从曲细精管中冲洗出来。
4. 使用 40 µm 细胞筛进行一次过滤，去除碎片和团块，并将滤液收集至步骤 1 中预先用 FBS 包被的 50 ml 尖底离心管中。
5. 用分选缓冲液清洗滤膜一次，总体积加至 3 ml，然后将滤液转移至步骤 1 中预先包被的 15 ml 尖底离心管中。
6. 每毫升细胞悬液中加入 16 µl 的 50 mM EDTA（pH 8）（对于 3 ml 悬液，加入 48 µl），使最终 EDTA 浓度为 0.8 mM。
7. 为固定生精细胞，使用 10 ml 吸头缓慢加入 3 倍体积的预冷 100% 乙醇，同时轻柔振荡（低速涡旋），形成乳白色悬液。
   关键步骤：缓慢加入乙醇对于保持细胞制备的完整性至关重要。我们发现，快速加入乙醇会导致细胞裂解，显著降低分选效率。对于 3 ml 细胞悬液，应约在 1 分钟内加入 9 ml 乙醇。
8. 将细胞置于冰上孵育 15 分钟，期间偶尔轻轻颠倒混匀。
9. 以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
10. 用 2 ml 分选缓冲液轻柔重悬固定的生精细胞。
11. 加入 4 µl SYTO16 DNA 染料（DMSO 中的 1 mM 溶液），避光孵育至少 30 分钟。
    注：由于 SYTO16 是一种可穿透细胞膜的 DNA 染料，能够轻松进入精子细胞高度压缩的细胞核，因此使用 SYTO16 可获得最佳分选效果。

3. 细胞分选仪设置

注意：此处使用配备四激光器（405 nm 紫色、488 nm 蓝色、561 nm 黄绿色、633 nm 红色）的 20 参数 BDFACSAria III 细胞分选仪。采用 BD FACSDiva 6.1.3 软件进行数据可视化与分析。具体设置可能因所用分选仪型号不同而有所差异。

1. 在流路关闭程序中，使用70%乙醇作为鞘液对FACS分选仪进行灭菌"流式细胞仪" 软件菜单中）排序前选择 "流式细胞仪" 在软件的工具栏中选择 "流体关闭"按照流程中提到的步骤进行操作。
2. 使用0.22 µm滤膜过滤1×PBS溶液，以去除任何晶体和污染物。将鞘液罐注液至罐内壁上方的焊缝线处。
3. 启动软件并登录。启动流式细胞分选仪，使激光器预热至少30分钟，以备分选。运行两次流路启动程序，以冲洗流路系统中的乙醇。选择 "流式细胞仪" 在软件的工具栏中选择 "流体启动"按照流程中提到的步骤进行操作。
   注意：此步骤使用正常鞘液（1× PBS）恢复流路系统。
4. 用蒸馏水清洗分选块和偏转板，并彻底干燥。将置于蒸馏水试管中的100 µm喷嘴放入超声波浴中，超声处理2分钟。彻底擦拭喷嘴。
5. 将100 µm喷嘴插入流动池，顺时针旋转喷嘴锁定杆至12点钟位置。将鞘液压力设定为20 psi。
6. 打开液流，调节振幅以达到目标值：频率（约30）、第一滴（约150）和间隔（约12），并建立稳定的液滴断裂模式（较少卫星液滴）。关闭衰减。
7. 通过调整分选块的角度，确保液流呈直线并击中废液抽吸装置的中心。注意：曾测试在10 psi压力下使用130 µm喷嘴，未发现明显差异。
8. 将蓝色激光的延迟设为 0，红色激光设为 -77.39，紫色激光设为 37.33，黄绿色激光设为 -39.85。
9. 将蓝色、红色、紫色和黄绿色激光的区域缩放值分别设置为 1.14、1.0、0.75 和 0.96。
10. 使用测试排序（在 "侧流" 软件窗口中，确保侧流未扩散。在 "侧流" 窗口，调节每侧流的电压滑块，使液流击中测试收集管的中央。如果中心流束不集中，调节2^nd, 3^rd，以及 4^th 降低液滴设置以限制中心流。
11. 启动细胞仪设置与追踪（CS&T) 应用在软件中（"流式细胞仪" 菜单）。
12. 使用细胞仪设置和追踪微珠，按照制造商说明，每350 µl加入1滴，以自动表征和追踪细胞仪性能。
13. 退出 CS&T 应用。应用 CS&T 设置下，确保流参数仍能维持稳定的液滴断裂模式，并按照制造商说明打开 Sweet Spot 按钮（位于 "断裂窗").
14. 使用荧光微珠优化滴延迟值（参见表格） 材料).
    1. 将收集管安装到支架中。打开分选块门。在 "侧流" 窗口，打开电压，然后选择 "测试排序" 单击“吸液抽屉”按钮以打开抽屉，从而接触收集管。
    2. 优化侧流，使其进入管的中心。根据需要调整数值和滑块。
    3. 关闭分选块门，并调节千分尺旋钮，使中心位置的微球光点最亮。取消选择废液抽屉、测试分选和电压。取出收集管。
    4. 根据制造商的说明优化液滴延迟时间。
       1. 简而言之，剧烈振荡珠子小瓶，取1滴珠子悬液加入0.5 ml PBS中稀释。
       2. 根据制造商的说明，使用软件中提供的“滴延迟实验模板”来设置滴延迟。或者，使用自动滴延迟功能来设定滴延迟。
       3. 加载荧光微球管，并调节流速直至阈值速率达到约 3,000 至 4,000 个事件/秒。将分选精度设置为 "初始" 最后到 "精细调节" 在 "排序布局" 窗口。选择光学滤镜并分选微珠。调节液滴延迟，直至约100%的微珠被分选至左侧。
          注意：此步骤对于确保目标细胞进入侧向液流至关重要。使用磁珠和光学滤光片可实现接近100%的液滴偏转。 
15. 在FSC探测器模块的左端放置一个FSC 1.5 ND（中性密度）滤光片。将窗口扩展设置为2.00 µs，FSC面积缩放设置为1.00（在 "激光" 标签页中的 "流式细胞仪" 窗口
16. 上样前，在样品管末端安装一个50 µm的样品过滤线，以防止团聚。操作方法如下：选择 "更换样本滤光片" 在 "流式细胞仪" 菜单
17. 检测样品流体的成分，以实现良好的分离效果，避免侧流之间出现扇形扩散，并防止细胞粘附于聚丙烯管上。
    1. 加载样品管，打开偏转板并选择 "测试排序" 抽屉关闭时观察侧流，若分离发生且无明显扩散，则进行观察。
       注意：扇形扩散现象可能是由于样品缓冲液中蛋白质浓度过高所致。
18. 将样品管加载至流式细胞仪中。选择300 rpm的样品振荡速度和4 °C的样品温度。选择 "获取数据" 在 "采集仪表板".
19. 如有必要，将样品稀释至合适的事件数率，最高为5,000事件/秒（最大流速为3.0）。必须严格遵守此限值，以保证分选细胞的纯度。
20. 为了分析和分选细胞，需优化前向散射光（FSC）阈值，以去除碎片干扰，同时不影響目标细胞群。在对数尺度下，调节配备530/30滤光片的光电倍增管（PMT）检测器的电压，确保总细胞群的荧光信号位于该尺度范围内，并对阳性细胞群设门图1，门控1）。
21. 生成SYTO16阳性群体的前向散射面积（FSC-A）/侧向散射面积（SSC-A）图，将FSC-A调整至线性刻度下约110 V，SSC-A调整至对数刻度下约150 V，以显示所有事件，同时排除过大细胞和细胞聚集体。
22. 在 "排序布局" 窗口，设置 "排序精确模式" 至 "4通道纯度" （产率掩模：0，纯度掩模：32，相位掩模：0）。选择 "连续的" 来自 "目标事件" 连续分选菜单
23. 在对应试管的字段中添加要分选的细胞群 "排序布局" 窗口）。将频率较高的群体置于中间，频率较低的群体置于两端。将电压板设置为 2,500 V。分选过程中，将样品收集管置于冰上。    

4. 细胞分选

1. 分选前立即使用50 µm滤器，在预先包被的5 ml聚丙烯圆底管中过滤细胞。
2. 用1–2 ml分选缓冲液充分冲洗滤器。
3. 使用配备488 nm激光器的细胞分选仪，按照图1中详述的设门方案对固定后的生殖细胞进行分选。将纯化的组分收集至预先在第1节中包被并置于冰上的5 ml聚丙烯圆底管中。
   1. 确保收集管中保留100–200 µl胎牛血清（FBS），以防止分选后的细胞粘附于管壁。
   2. 确保SYTO16浓度达到饱和，以避免分选期间荧光波动。当分选图中Alexa Fluor 488参数（DNA染色）的细胞染色强度不再进一步变化时，表明SYTO16已饱和。必要时，向分选管中加入1 µl SYTO16以达到饱和。
   3. 在显示以下参数的图形中展示总事件数：事件数 vs Alexa Fluor 488-A。
   4. 如图1所示，使用“门1”（Gate 1）选中DNA染色阳性的细胞。
      1. 将“门1”中的细胞显示在以SSC-A vs FSC-A为参数的图形上
         1. 如图1所示，使用“门2”（Gate 2）选中细胞。
         2. 将“门2”中的细胞显示在以FSC-A vs Alexa Fluor 488-A为参数的图形上。
         3. 在“门2”图形上，使用“门5”和“门6”（Gate 5 和 Gate 6）选中细胞，如图1所示。
         4. 分别在以Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A为参数的图形上单独显示“门5”和“门6”。
         5. 如图1所示，在“门5”图形上选中精子形成阶段1–9的精子细胞，在“门6”图形上选中精子形成阶段10–12的精子细胞。
      2. 将“门1”中的细胞显示在以FSC-A vs Alexa Fluor 488-A为参数的图形上
         1. 如图1所示，使用“门3”和“门4”（Gate 3 和 Gate 4）选中细胞。
         2. 分别在以Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A为参数的图形上单独显示“门3”和“门4”。
         3. 如图1所示，在“门3”图形上选中精子形成阶段13–14的精子细胞，在“门4”图形上选中精子形成阶段15–16的精子细胞。

结果

流式细胞术中使用的设门策略

图1展示了在流式细胞术中用于分选四种高纯度精子细胞群的设门策略。简而言之，首先通过门控1（Gate 1）选择DNA染色阳性（Alexa Fluor 488-A）的细胞。在显示颗粒度（SSC-A）与细胞大小（FSC-A）的散点图上，从门控1中选取处于精子形成阶段1-12的精子细胞（门控2）。随后，根据DNA染色强度的变化，可将处于精子形成阶段1-9和阶段10-12的精子细胞彼此分离（门控5和门控6）。处于精子形成阶段13-14和阶段15-16的精子细胞则直接在显示细胞大小（FSC-A）与DNA染色（Alexa Fluor 488-A）的散点图上从染色阳性的细胞中进行选择（门控3和门控4）。所有分选出的细胞群均通过Alexa Fluor 488-W与Alexa Fluor 488-A的散点图重新界定，以提高其纯度。

讨论

生精细胞一直难以研究，原因在于生精上皮结构的复杂性以及现有研究方法的成功率有限 体外 培养。多年来，已开发出多种从不同物种中纯化生殖细胞的方法。利用 Percoll 或牛血清白蛋白梯度进行重力沉降的沉降技术通常可获得较高产量的完整生殖细胞，但在某些细胞类型之间缺乏明确区分，例如减数分裂的四倍体细胞与精子细胞。¹⁰此外，这些技术需要特殊的设备（通常是自制的），而许多实验室可能无法 readily 获得这些设备，导致在缺乏繁琐的试错过程的情况下难以重复实验。这些方法还耗时较长，对振动极为敏感，且操作不便，因为装置通常需维持在 4 °C 以保持细胞活性。然而，当实验成功时，沉降法可获得每群集数百万个纯化的活细胞。但这些技术的主要缺点是细胞富集程度较低，纯度通常难以超过 80–90%。在某些情况下，通过 DNA、RNA 或蛋白质含量测定发现，其他细胞类型的污染可达 10–20%，这对分子分析构成了主要障碍。

在试图提高细胞群体纯度时，一些研究者将重力沉降法与其他方法结合使用。其中最有效的方法之一是利用未成熟小鼠，以限制代表后期阶段的不同细胞群体的数量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	ABBOT	05260-05	用于安乐死前小鼠麻醉
胎牛血清	Wisent	90150	用于管材包被
1× PBS
EDTA	BioShop	EDT	用于分选缓冲液配制
HEPES	Sigma	H	用于分选缓冲液配制
100% 乙醇	Les alcools de commerce	092-09-11N	用于细胞固定
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA 染色
5 ml 聚丙烯圆底管	BD Falcon	352063	用于收集分选后的细胞
15 ml 聚丙烯锥底管	PROgene	1500
50 ml 聚丙烯锥底管	PROgene	5000
TEC4 麻醉蒸发器	Ohmeda	1160526	用于小鼠安乐死
CO2 气体钢瓶	Praxair	C799117902	用于小鼠安乐死
O2 气体钢瓶	Praxair	O254130501	用于小鼠安乐死
自制小鼠气体安乐死舱			用于小鼠安乐死
40 µm Falcon 细胞筛	Corning Incorporated	352340
50 μm 样品管滤器	BD Biosciences	649049
涡旋混合器	Labnet international, inc.	S0200	用于细胞固定
Dynac 离心机	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm 滤器	Partec	04-004-2327
配备 488 nm 激光的细胞分选仪	BD Biosciences	FACSAria III
Accudrop 荧光微球	BD Biosciences	345249
分选缓冲液：1× PBS，1 mM EDTA（pH 8.0），25 mM HEPES（pH 7.0），1% FBS			FBS 需经热灭活。现配现用，经 0.22 μm 滤膜过滤后，4°C 保存。