本方案可从少量成人外周血中可靠地生成并鉴定血液来源的内皮细胞（BOECs）。BOECs 可作为血管疾病患者来源内皮细胞的替代物，并可用于诱导性多能干细胞的生成。
本文内容
摘要
摘要
传统上，由于血管疾病患者来源的原代内皮细胞数量有限，阻碍了对这些个体中内皮功能障碍潜在分子机制的研究。然而，近期发现的血液来源内皮细胞（BOECs）为解决这一限制提供了可能。这类细胞由成人外周血中的循环内皮祖细胞产生，可作为患者来源内皮细胞的类原代细胞替代物。除了在理解内皮生物学和疾病建模方面的价值外，BOECs 还具有用于内皮细胞移植治疗的潜力。此外，它们也是通过核重编程技术生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的理想细胞基质，在多个方面优于其他类型的细胞。本文介绍了一种可靠的方法，用于从成人外周血中分离、培养和鉴定 BOECs，以支持上述及其他应用。该方法（i）能够从相对少量的成人外周血中获得患者特异性的内皮细胞；（ii）所产生的细胞在形态、细胞信号传导和基因表达方面与原代内皮细胞高度相似。
引言
直到最近，人们认为出生后新血管的生成仅通过一种称为血管生成（angiogenesis）的过程发生，该过程定义为从已有血管的内皮细胞中萌发出新血管。1 这一过程不同于血管发生（vasculogenesis），即从内皮祖细胞从头形成血管的de novo过程，后者曾被认为仅在胚胎发育期间发生。2 然而，近年来的研究已在成人外周血中鉴定并分离出循环内皮祖细胞（EPCs）。这些细胞在体外培养中具有分化为成熟内皮细胞的能力，并被认为参与出生后的血管发生过程。3,4
分离和扩增这些内皮祖细胞（EPCs）的常规方案通常包括在含有内皮生长因子（如血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子-2）的培养基中培养外周血单个核细胞（PBMNCs）。5-8 EPC 培养物可产生多种截然不同的细胞类型。初始培养物（<7天）主要由一种单核细胞类型的细胞主导，该细胞在文献中被称为 "早期" EPCs。尽管其名称如此，这些细胞表达单核细胞标志物CD14，不表达祖细胞标志物CD34，且仅表达极低水平的经典内皮细胞标志物CD31和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）。5 持续培养会产生第二群细胞，称为晚期迁移细胞集落内皮祖细胞（late outgrowth EPCs）或血液来源内皮细胞（blood outgrowth endothelial cells, BOECs），其表现为界限清晰的内皮样细胞集落。与单核细胞样的早期EPCs不同，BOECs也被称为内皮集落形成细胞（endothelial colony forming cells, ECFCs）、迁移性内皮细胞或晚期迁移性内皮细胞，具有典型的内皮细胞单层铺路石样形态，并在表面标志物表达方面高度相似5 和基因表达9 成熟为内皮细胞。
从外周血生成内皮样细胞具有多项优势，尤其适用于研究与肺动脉高压（PAH）10 或血管性血友病等血管疾病相关的内皮细胞功能障碍。11 在BOECs出现之前，内皮细胞只能在个体死亡或器官移植时从移植器官中获取，或在出生时从脐静脉中分离。这种来源的局限性严重阻碍了对心血管疾病患者内皮细胞生物学特性，以及内皮细胞与血细胞或壁细胞之间相互作用的理解。此外，从这些来源分离并培养纯化的内皮细胞群体在技术上具有挑战性，且通过这些方法获得的细胞增殖能力有限。因此，BOECs为分离和培养患者来源的原代内皮细胞提供了一种有价值的替代方案。
除了它们的 体外 应用方面，BOECs 在自体细胞移植治疗中也具有潜在用途。这些应用包括内皮细胞移植以促进新生血管形成（参见 12 以及诱导性多能干细胞（iPSCs）的生成，并参见其中引用的文献。13 由BOEC衍生的iPSC可用于疾病建模，并作为自体细胞治疗起始材料具有巨大潜力。BOEC重编程速度更快，效率高于皮肤成纤维细胞。此外，BOEC还可生成无核型异常的iPSC，这是适用于转化应用的技术所必需的关键特性。从患者血液样本中生成iPSC的能力也避免了皮肤活检及皮肤成纤维细胞的培养，从而便于为存在伤口愈合障碍或年幼的患者获取细胞。
以下方案已获国家研究伦理服务委员会（英格兰东部）批准，并遵循其指南进行，提供了一种简单且可靠的方法，仅需相对少量（60 ml）外周血即可高效（效率超过90%）生成BOECs。这些细胞具有高度增殖能力，可反复传代，从而能够从单份血液样本中获得数亿个细胞。
方案
BOEC 生成方案的示意图如图1所示。
1. 血液采集与密度梯度离心
- 每位供体分别向两个50 ml锥形离心管中各加入3 ml柠檬酸钠。通过静脉穿刺采集60 ml血液，将30 ml血液分别加入每根管中。轻轻倒置混匀2-3次。本方案中可使用最少40 ml血液，此时需相应调整柠檬酸钠的体积。
注意：血液样本必须在采集后2小时内完成处理。若处理延迟，会导致细胞克隆集落的产量显著降低。 - 在无菌操作台中，通过反复倒置瓶身数次以混匀密度梯度离心介质，然后向每个50 ml锥形管中加入15 ml该介质（每10 ml血液使用1根管，每位供体共需6根管）。
- 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将血液按1:1体积比稀释。将装有密度梯度离心介质的离心管倾斜至与工作台面呈20°角。使用移液器辅助装置和25 ml血清移液管，沿倾斜管壁缓慢将21 ml稀释后的血液分层加至介质上方。
注意：此操作可最大限度减少血液与密度梯度层之间的混合，从而获得更紧密的白膜层，并提高分离得率。 - 将样本在室温下以400 × g离心35分钟，离心过程中关闭加速器和制动器。
- 在上述离心过程中，开始进行步骤2.1至2.4所述的胶原蛋白包被操作。确保在进入步骤3.1之前已完成这些步骤。
2. T-75 培养瓶的胶原蛋白包被及培养基的制备
注意：以下步骤需在细胞培养罩内进行。
- 通过将I型胶原原液稀释于10 ml 0.02 M乙酸中，制备50 μg/ml的胶原溶液。示例：对于浓度为4.05 mg/ml的胶原原液，取123.5 μL胶原加入10 ml 0.02 M乙酸中。使用前需将胶原悬液经无菌过滤。
- 使用刻度移液管将7.5 ml胶原溶液加入T-75细胞培养瓶中。此体积可提供5 μg胶原/cm2（或每瓶375 μg）。在室温下孵育1小时以完成包被。
- 通过向内皮细胞基础培养基中添加生产商提供的生长因子补充物，制备用于BOEC生成的内皮细胞生长培养基。添加所有补充物，但不添加血清。为配制15 ml BOEC生成培养基，将2.5 ml限定胎牛血清（FBS）加入含生长因子补充物的12.5 ml内皮细胞生长培养基中。
- 继续执行第3节中所述步骤。在1小时包被结束后，吸除胶原溶液，并通过加入10 ml DPBS清洗以去除残留乙酸。吸除DPBS后，重复清洗一次。若在3.3步骤中获得的细胞悬液暂未准备好进行接种，可向培养瓶中加入5 ml BOEC生成培养基，以防止胶原包被层干燥。
3. 外周血单个核细胞的收集与接种
- 按照步骤1.4所述的密度梯度离心法，使用无菌塑料移液管小心收集白膜层。每管收集的白膜层应获得约20 ml的细胞悬液和血浆。避免转移密度梯度介质。
- 用DPBS将单个核细胞悬液按1:1比例稀释，并颠倒混匀。在室温下以300 × g离心20分钟，刹车和加速均设为最大。
- 离心后，吸除上清液，并通过向每个沉淀中加入1 ml BOEC生成培养基并反复吹打重悬细胞。合并细胞悬液，并用剩余培养基补至总体积10 ml。
- 为估算总细胞数，取10 μl细胞悬液，加入490 μl Turk溶液稀释50倍，以裂解红细胞。使用血细胞计数板对稀释后的细胞悬液取10 μl进行计数。
注意：60 ml血液通常可获得约100–150 × 106个用于接种的白细胞。 - 将全部细胞悬液接种至一个胶原包被的T-75培养瓶中，补加培养基至总体积15 ml/瓶，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养。此时接种的细胞定义为第0代。
注意：可在BOEC分离前将分离得到的外周血单个核细胞（PBMNCs）冻存，以便后续时间进行BOEC诱导，或将其运输至其他实验室进行BOEC制备。但需注意，冻存PBMNCs可能降低BOEC分离效率。详见下文第8节操作方法。
4. 长期细胞培养
- 每2天更换一次培养基，每次加入15 ml新鲜的BOEC扩增培养基（内皮细胞生长培养基与定义明确的FBS按5:1比例混合）。周末时可将换液间隔延长至每3天一次。
注意：培养7至14天后应可见细胞向外生长的克隆集落。 - 在培养第7至14天期间，密切观察BOEC培养瓶中是否出现向外生长的克隆集落。克隆集落应为呈典型内皮细胞“鹅卵石”样形态的圆形细胞团。
- 一旦在培养瓶中识别出单个或多个克隆集落，继续按前述方式更换培养基，并让克隆持续生长至每个集落约含1000至2000个细胞后再进行传代。细胞数量可通过粗略的视觉估计判断。
注意：通常建议在首次观察到克隆集落后约一周进行初次克隆的传代。 - 传代时，先用10 ml DPBS冲洗培养瓶两次，随后加入5 ml 1×胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C培养箱中孵育5分钟。孵育结束后，加入10 ml含FBS的培养基中和胰酶活性，并通过反复吹打使细胞悬浮。
- 将细胞悬液在300 × g条件下离心5分钟，弃上清后重悬于15 ml新鲜BOEC扩增培养基中，将全部细胞悬液接种至一个新的T-75培养瓶中（记为第1代，P1）。此步骤无需进行胶原包被。
- 按上述方法继续更换培养基，直至细胞达到汇合状态（每瓶约3-5 × 106个细胞）。一旦汇合，按步骤4.3所述方法进行传代。
注意：从第2代开始，细胞不再需要BOEC扩增培养基，可改用内皮细胞生长培养基加10%常规热灭活FBS进行培养。后续传代中可选择性使用胶原包被，有证据表明胶原的存在可能促进BOEC的增殖速率。 - 后续传代时，每T-75培养瓶接种的细胞数不得少于750,000个，因密度过低可能导致BOEC停止增殖。
5. BOEC 培养物的冻存与复苏
- 按照第 4.3 节所述方法对细胞进行胰酶消化，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，用 10 ml 培养基重悬细胞。此步骤无需使用内皮细胞生长培养基；含 10% 标准胎牛血清（FBS）的 DMEM 即可满足要求。取 10 μl 细胞悬液样本，使用血细胞计数板进行手动细胞计数。
- 再次离心后，用冰浴预冷的冻存液（40% DMEM、50% FBS 和 10% DMSO）将细胞重悬至浓度为 2×106 个细胞/ml。每支冻存管中加入 0.5 ml（含 106 个细胞），将冻存管放入冰浴预冷的异丙醇冻存盒中，随后置于 -80 °C 冰箱中至少 2 小时，之后再转移至液氮中保存。细胞在 -80 °C 下存放不得超过 24 小时。
- 复苏细胞时，向一个 15 ml 圆锥形离心管中加入 10 ml 预热的培养基。
注意：复苏第 1 代细胞时，复苏后前 2 天应使用添加了 20% 定义型 FBS 的内皮细胞生长培养基，以利于后续获得更稳定的细胞分离效果。 - 从液氮中取出细胞，在 37 °C 水浴中轻轻摇动融化，直至冻存管中仅剩微小冰晶。将管内液体逐滴加入离心管中，于 300 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 ml EGM-2MV+10%FBS 培养基中，转移至 T-75 培养瓶，并补加培养基至总体积 15 ml。
6. 通过流式细胞术对BOECs进行表征
- 待第4节所述BOEC克隆扩增后，按第4.4节所述方法进行细胞消化，并将细胞重悬于染色缓冲液（含2% FBS和2 mM EDTA的DPBS）中，调整浓度至每毫升106个细胞。
- 取105个细胞，加入针对CD45、CD14、CD34、CD31（以上抗体均按1:20稀释）或VEGFR2（按1:10稀释）的荧光素偶联抗体（完整细节见表1），在4 °C避光条件下孵育30分钟。
- 用1 ml染色缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心5分钟。吸除上清液后，将细胞重悬于400 μl染色缓冲液中用于分析。分析前将细胞置于4 °C并避光保存。
- 使用具备检测本实验所用荧光偶联抗体能力的流式细胞仪进行细胞分析。
- 采用未染色的BOEC样本，在流式细胞仪上通过调节前向散射和侧向散射电压以及FITC和APC通道的电压，确定目标细胞群的位置。
- 利用各荧光素对应的同型对照染色细胞设定设门阈值。根据待分析荧光素的同型对照，判断各细胞表面标志物阳性信号的标准为荧光强度图中是否存在明显的峰位偏移。
7. 通过免疫荧光显微镜对BOECs进行表征
- 将BOECs以每孔500 μl内皮细胞生长培养基（含10%热灭活FBS）中5 × 104个细胞的密度接种于24孔平底组织培养板中（不加盖玻片），于37 °C、5% CO2条件下孵育，直至细胞覆盖每孔表面积的至少70–80%（在光学显微镜下通过肉眼观察估算汇合度）。
- 每孔加入1 ml DPBS，洗涤细胞5分钟。
- 每孔加入500 µl含4%多聚甲醛的DPBS溶液，于4 °C过夜固定细胞 。
- 每孔用1 ml DPBS洗涤3次，每次5分钟。使用移液器加液，吸液器吸除液体。
- 用含0.2%聚山梨酯20的DPBS溶液对细胞进行通透处理，每次10分钟，共3次。
- 在含10% FBS的DPBS封闭缓冲液中，室温孵育细胞1小时。
- 在4 °C条件下，用300 µl抗体稀释缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白的DPBS）过夜孵育细胞，该缓冲液中含有针对CD34（10 µg/ml）、CD144（1:300）或vWF（1:250）的一抗。详细信息见表1。
- 用DPBS洗涤未结合的一抗，每次10分钟，共5次。
- 室温下孵育细胞1小时 ，加入适当荧光标记的二抗（均按1:200稀释），具体见表1。
- 用DPBS洗涤未结合的二抗，每次10分钟，共5次。
- 在DPBS中加入1 µg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育10分钟。
- 再用DPBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
- 使用配备外部光源用于荧光激发的倒置显微镜，在100倍放大倍数下观察细胞，并通过连接的数字相机采集图像，用于后续离线分析。
8. PBMNC 的冻存与复苏
- 第3.2阶段结束时，离心后吸除上清液，使用P1000移液器枪头通过反复吹打手动重悬细胞沉淀。加入1 ml冻存液（含90%血清和10% DMSO），轻轻混匀以形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至冻存管中，并按照第5节所述进行冻存与复苏。
结果
从60 ml血液中分离出的血沉棕黄层单个核细胞通常可获得100–150×10⁶个细胞6 总白细胞。当接种至单个T-75培养瓶时，未裂解细胞悬液中的细胞数量较多，导致在明场显微镜下难以分辨单个贴壁细胞。通过多次更换培养基，可清除非贴壁细胞，从而便于观察贴壁的单核细胞样“早期”EPCs群体。第7天时，T-75培养瓶中将含有约7x106 这些细长的贴壁细胞。从第7天到第14天，BOEC集落应出现在培养瓶中（图2A）。菌落最初表现为3至5个相邻的细胞。每60 ml血液中，菌落出芽数量可为1至10个。通常，较年轻的供体（即，20-25岁）个体 tends to 产生更多的 outgrowth colonies，且这些集落出现时间更早。BOECs 从这些中央细胞群增殖，形成由数百个细胞组成的圆形集落。这些集落内的细胞呈现典型的内皮细胞鹅卵石样形态。
当每个菌落约含有1000个细胞时，对初始菌落进行传代较为理想。在培养中初次出现菌落后，通常约7天可达到此大小。一旦将原始菌落传代至新的T-75培养瓶中，应在5天或更短时间内增殖形成融合的单层细胞（每瓶3-5×106个细胞）（图2B）。在少数分离样本中（<10%），菌落可能无法出现，或在此初始传代步骤后增殖不足。首次传代后增殖能力较低的BOEC极少能建立稳定的BOEC分离株，通常在两到三次传代后停止增殖。BOEC培养物中含有的单核细胞样早期EPC不具有增殖能力，通常在1-2次传代过程中被清除。这些早期细胞的清除是由于细胞死亡、早期细胞在传代后无法重新贴壁，以及通过反复传代稀释了非增殖性的早期EPC所致。
传代1的细胞可继续在培养中传代，或冻存以备后续使用。一旦获得稳定的分离细胞，可在第8或第9代之前以1个汇合的培养瓶传至3–5个新的T-75培养瓶的比率进行传代，之后细胞将进入静止状态。培养过程中，细胞密度始终至关重要。根据我们的经验，T-75培养瓶中接种的细胞数量不应少于750,000个，密度过低可能导致细胞生长停滞。尽管BOECs具有较高的增殖潜能，但也应避免细胞过度汇合。即., >5×106 每瓶细胞数），因为这可能导致BOECs转化为非增殖表型。
我们建议，任何被标记为BOEC的细胞都应表现出适当的内皮细胞标志物的细胞表面和细胞内染色。BOEC的表征可通过流式细胞术（图3）或荧光显微镜（图4）进行，需在对典型内皮细胞标志物染色后完成。BOEC对内皮细胞表面标志物CD31和VEGFR2呈阳性，对单核细胞标志物CD14和泛白细胞标志物CD45呈阴性。BOEC还具有Weibel-Palade小体，因此可表现为冯·威勒布兰德因子（vWF）的离散、点状胞质染色。与其他成熟内皮细胞类型（如肺动脉或主动脉内皮细胞）不同，BOEC还在其表面表达祖细胞和活化标志物CD34。
图1. BOEC生成方案的示意图。 通过密度梯度离心法从静脉血中分离外周血单个核细胞，并在含特定胎牛血清的内皮细胞生长培养基中接种于胶原包被的培养板上进行培养。BOEC克隆通常在培养后7-14天内出现。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 典型 BOEC 培养物的明场图像。 (A) 在培养第 7 至 14 天之间出现向外生长的集落。这些集落由呈内皮样细胞组成的细胞群构成，排列成鹅卵石状单层，并从中心点向外呈放射状增殖。在向外生长的集落周围是贴壁的单核细胞，这些细胞在早期培养物中占绝大多数。这些细胞先前被称为“早期”内皮祖细胞，具有纺锤形形态，并表达单核细胞标志物 CD14。(B) 传代后，高增殖性的 BOEC 占据培养物主导地位，因为非增殖性的单核细胞在传代后会死亡或无法重新贴壁。比例尺：250μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 通过流式细胞术对BOECs进行表征。 BOECs经胰蛋白酶消化后，使用荧光标记的同型对照抗体（灰色填充峰）或针对特定表面标志物的抗体（红线）进行染色。用于流式细胞术表征的表面标志物包括造血细胞标志物CD45和CD14、内皮细胞标志物CD31和VEGFR2，以及祖细胞和内皮活化标志物CD34。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. BOECs内皮细胞标志物的免疫荧光染色。 对BOECs进行免疫荧光染色，分别针对内皮细胞表面标志物CD144（VE-钙黏蛋白，右上图）和血液糖蛋白冯·维勒布兰德因子（vWF，右下图）。对应的DAPI细胞核染色图像显示在左侧。CD144图像比例尺为50μm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们提供了一种详细的实验方案，能够从成人外周血单个核细胞（PBMNCs）中稳健且高效地分离出BOECs。本方案包含两项重要的优化，相较于以往的BOEC分离方法有所改进。14-16 这些优化包括：在初始PBMNC培养基中不添加肝素，以及使用经定义的、适用于胚胎干细胞的合格血清。后一项优化尤为重要。经胚胎干细胞（ESC）验证的合格血清具有更高的批次一致性，尽管目前尚不清楚该血清中具体是哪些组分富集并有利于BOEC的分离，但在我们的实验中，这种明确成分的血清对提高BOEC生成效率具有显著影响。此外，我们还成功使用人源血清分离出BOECs，从而实现了适用于临床转化的BOECs制备。在我们的操作条件下，该优化后的方案可使超过90%的供体成功获得稳定的BOEC培养物，使其成为迄今报道的最可靠的BOEC生成方法之一。尽管特定血清的使用对BOEC的生成至关重要，但这也构成了当前方案的主要局限性。未来技术的进一步改进可能包括在无血清、成分明确的培养条件下实现这些细胞的生成。
该实验方案的关键步骤包括：采集血液样本后应尽快处理，密度梯度离心后需完全收集白膜层细胞，以及及时将初始克隆从P0代传代至P1代。此传代步骤对于建立稳定的细胞分离至关重要。与其他内皮细胞类似，BOECs似乎对铺板密度极为敏感。若传代后的铺板密度过低，BOECs将无法增殖；反之，若在传代前克隆过度融合，细胞也会停止增殖，并倾向于转化为细长的间充质样细胞表型。若在第7至14天仅出现少量克隆，或克隆尺寸较小，可考虑通过将P0代克隆传代至T-25培养瓶而非T-75培养瓶来提高细胞密度，以进行问题排查与优化。
一旦掌握该技术，所获得的BOECs可用于多种应用，包括 体外 内皮细胞生物学研究、疾病建模与药物筛选，以及 体内 细胞移植疗法。在开发任何细胞治疗工艺时，一个重要考虑因素是使用无致病性突变的细胞。我们先前已证明，采用本方案分离获得的BOECs其基因组无拷贝数变异，因而能够代表供体个体。此外，我们还证实，大多数由BOECs衍生的iPSC细胞系均无拷贝数变异。13 这与先前关于成纤维细胞来源的iPSCs存在拷贝数变异的报道形成对比。迄今为止，这些细胞仍是唯一被报道具有如此高度基因组保真度的iPSCs。这一特性对于iPSC生物学领域以及iPSCs在疾病建模、药物筛选和未来细胞移植治疗中的应用具有重要意义。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了英国心脏基金会（BHF）、恐龙信托基金（Dinosaur Trust）、麦克阿尔派恩基金会（McAlpine Foundation）、勒杜克基金会（Fondation Leducq）、视力斗争基金会（Fight for Sight）、剑桥 biomedical 研究中心、英国国家健康研究所（NIHR）的资助，包括（i）BHF 牛剑再生医学中心 [RM/13/3/30159]，（ii）BHF 剑桥卓越研究中心，（iii）剑桥大学医院 NHS 基金会信托下属的阿登布鲁克医院，以及（iv）帕沃思医院 NHS 基金会信托。上述资助亦支持了剑桥 NIHR BRC 细胞表型分析中心。MLO 由英国心脏基金会中级研究员项目资助。FNK 由英国心脏基金会博士研究生奖学金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于血液采集 | |||
| 60 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器 | BD | 309653 | |
| 19G Surflo 翼型输液套管 | Terumo | SV-19BL | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | StarLab | E1450 | 每位供体使用2个 |
| 枸橼酸钠 | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 用于富集白膜层分离 | |||
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Dulbecco’s PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 无菌包装塑料移液管 | Appleton Woods | KC231 | |
| Turk’s 溶液 | Millipore | 1.093E+09 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 用于细胞培养、传代及细胞冻存 | |||
| Ⅰ型胶原蛋白（来源于大鼠尾） | BD Biosciences | 35-4236 | |
| Dulbecco’s PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.02M 乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | 使用试剂级水配制 |
| 内皮细胞生长培养基-2MV （含Bullet Kit，但不含血清） | Lonza | CC-3202 | 注意：培养基中不得含有肝素。 请勿使用 EGM-2。 |
| 胎牛血清（美国来源），经定义 | Hyclone | SH30070 | |
| 10x 胰蛋白酶 EDTA | Gibco | T4174 | 使用前用PBS稀释至1x |
| 热灭活FBS | Gibco | 10500-064 | |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Nalgene Mr. Frosty 冻存容器 | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 用于流式细胞术表征 | |||
| FITC标记的小鼠抗人CD14抗体 | BD Biosciences | 555397 | 小鼠IgG1k，克隆号：WM59 稀释比例：1:20 |
| FITC标记的小鼠抗人CD31抗体 | BD Biosciences | 555445 | 小鼠IgG1k，克隆号：WM59 稀释比例：1:20 |
| APC标记的小鼠抗人CD34抗体 | BD Biosciences | 555824 | 小鼠IgG1k，克隆号：581/CD34 稀释比例：1:20 |
| FITC标记的小鼠抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 560976 | 小鼠IgG1k，克隆号：HI30 稀释比例：1:20 |
| APC标记的小鼠抗人VEGFR2抗体 | R&D Systems | FAB357A | 小鼠IgG1，克隆号：89106 稀释比例：1:10 |
| FITC标记的小鼠IgG1k 同型对照 | BD Biosciences | 555748 | 克隆号：MOPC-21 稀释比例：1:20 |
| APC标记的小鼠IgG1k 同型对照 | BD Biosciences | 555751 | 克隆号：MOPC-21 稀释比例：1:20 |
| APC标记的小鼠IgG1k 同型对照 | R&D Systems | IC002A 稀释比例：1:10 | 克隆号：11711 |
| EDTA，0.5M 溶液 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 用于免疫荧光显微镜检测 | |||
| Corning Costar 24孔组织培养板 | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 聚山梨酯20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 单克隆小鼠抗人CD34抗体 | R&D Systems | MAB72271 | 克隆号756510，IgG1，使用浓度为10 μg/ml |
| 多克隆山羊抗人VE-钙黏蛋白（CD144）抗体 | R&D Systems | AF938 | 抗原亲和纯化IgG，使用比例1:300 |
| 单克隆兔抗人血管性血友病因子（vWF）抗体 | Abcam | ab154193 | 克隆号EPSISR15，使用比例1:250 |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A-21202 | 多克隆，2 mg/ml，使用比例1:200 |
| 驴抗山羊IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记 | Life Technologies | A-11055 | 多克隆，2 mg/ml，使用比例1:200 |
| 驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 568标记 | Life Technologies | A-10042 | 多克隆， 2 mg/ml，使用比例1:200 |
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma-Aldrich | D9542 | 使用浓度为1 μg/ml |
参考文献
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