植物表皮脂质聚酯单体的分离及成分分析

Summary

脂质聚酯构成了两种细胞壁修饰的结构成分，即植物角质层和含有软木素的扩散屏障。在本视频中，我们描述了一种从整个脱脂叶中解聚角质的方法。该方法可用于研究在角质或软木素生物合成中受损的突变体。

Abstract

陆生植物产生细胞外脂肪族生物聚酯，可修饰特定组织的细胞壁。表皮细胞合成角质，角质是一种由甘油和改性脂肪酸组成的聚酯，构成了覆盖植物气生表面的角质层框架。木脂蛋白是一种相关的脂质聚酯，沉积在某些组织的细胞壁上，包括根内胚层和块茎的周皮、树皮和根。这些脂质聚合物在植物物种之间的组成上存在很大差异，并且在单个物种内的组织之间通常不同。在这里，我们描述了一个详细的方案，通过甲醇钠 （NaOMe） 催化的解聚、衍生化和随后的气相色谱-质谱 （GC/MS） 分析来研究拟南芥叶中角质的单体组成。该方法可用于研究从带有角质或软木脂的整个脱脂植物组织中分离的不溶性聚酯的单体。该方法不仅可以用于表征以前未分析的物种中脂质聚合物的组成，还可以用作正向和反向遗传方法中的分析工具来评估候选基因功能。

Introduction

维管束植物依靠充当植物组织和外部环境之间的防水屏障外层。这些亲脂性的细胞壁相关结构限制病原体感染和调节的气体，水和溶解的物质的被动转运进出植物组织^1。这种障碍是植物表皮，一个synapomorphic结构独特的植物^2，以及不同的含软木脂扩散壁垒。角质层是由表皮细胞经由果胶层上的细胞壁^3-5的外侧合成并结合到它们的亲油性层。它包住高等植物的主天线器官，用作植物组织和环境之间的一个重要的接口。

角质，角质层的结构基体，和软木脂与溶剂萃取的蜡^2,4相关联的两个不溶甘油脂聚酯。这些聚合物升ipids是由饱和和不饱和脂肪酸衍生物的且都是结构上和功能上类似。然而，它们是可区分由在化学组成和沉积点特性的差异。

软木脂是一种脂族聚酯位于形成次生壁一定的外部和内部组织的细胞壁内。 Suberized组织包括根periderms，块茎和树皮，根内皮层，种皮层和愈合伤口^2。不像角质，所述木栓质聚酯通常含有醇，饱和的和单不饱和二羧酸，和相当大的比例非常长链的单体的（C≥20）。

角质是在维管植物⁶中最丰富的脂类聚酯，和由甘油和C 16 -C 18交换的脂肪酸衍生物，如羟基和羟基取代的环氧脂肪酸^4。而角质聚合物的组合物跨越维管种类而异，最主要主单体为10，16二羟基16:0，18羟基-9,10-环氧18:0，和9,10,18三羟基18:0脂肪酸。有趣的是，拟南芥属叶和茎角质主要由18:2的二羧酸^7,8。

植物表皮也厚度呈现出相当大的变化，从几纳米到几微米^9。由于角质层隔离是费力和耗时的步骤，特别是对于非常薄的叶子表皮诸如拟南芥 ^8，绕过角质层分离方法已经开发和验证^7,8。在这里，我们描述了一个详细的协议来研究角质的拟南芥叶片由甲醇钠（甲醇钠）催化的解聚和随后的气相色谱/质谱（GC / MS）分析该单体组合物。该协议提供了一个强大的方法测定共mposition在全脱脂组织的植物脂肪聚酯，并已被改编自先前报告协议^7,10,11。整个组织样品是第一匀浆，彻底去脂，除去溶剂萃取的脂质包括表皮和epicuticular蜡，膜脂，和三酰基甘油。细胞壁富集残基，然后由甲醇钠催化的甲醇分解解聚成其组成甲酯单体。脂肪酸甲基酯被提取在酸化时，并衍生以得到其相应的三甲基甲硅烷基或乙酰基的衍生物。衍生的残基是高度挥发性的，并且可以从在适当温度下用气相色谱柱洗脱而不会在GC / MS分析改变其结构构象。

Protocol

注:该协议是改编自博纳等人。 （2004），Molina等人。 （2006年），李等人。 （2013年^{）7,10,11。}步骤1-5 总结于图1。

1.组织脱脂

注意:一定要清洗所有的玻璃器皿和瓶盖用氯仿，让干在通风橱，使用前。

注意:执行组织均匀化，并在通风橱中的所有溶剂转移步骤;总是穿着白大褂，手套和防溅安全护目镜，避免与化学物质直接接触，并保护样品免受污染。

1. 预热水浴加热块到85℃。
2. 称取约0.5克每叶样品放入预称重的20个毫米×125mm玻璃管试管用聚四氟乙烯（PTFE）-faced螺丝帽。包括每个样品四次重复。
3. 放置在一个锥形瓶中（大约125毫升2-丙醇;每克SAMP 25ml的乐）。添加2,6-二 - 叔丁基-4-甲基苯酚（也被称为丁基羟基甲苯，BHT），以0.01％的终浓度（重量/体积）。
   注意:从5％添加BHT（重量/体积）储备溶液在甲醇（BHT有助于减少不饱和脂肪酸的氧化）。
4. 预热2-丙醇溶液至85℃在水浴中。
5. 加12个毫升热的2-丙醇溶剂向每个样品管中，并加热15分钟，在85℃下在加热块。此步骤失活可从破碎的细胞释放的脂肪酶。
6. 让管冷却至室温，直至获得均匀的悬浮液用均化器充分研磨组织。
7. 将样品中的定轨摇床并振摇在100rpm和室温下1-2小时。
8. 离心10分钟，以800×g离心并弃去上清液。
9. 添加2-丙醇等体积并摇动在室温下12小时。
10. 离心10分钟，以800×g离心并弃去上清液。
11. 添加12毫升CH氯_3:CH 3 OH（2:1，体积/体积）至残基（每克样品25毫升）中，在100rpm和室温下振摇过夜。
12. 离心10分钟，以800×g离心并弃去上清液。
13. 加12个ml的_氯仿:CH 3 OH（1:2，V / V）至残基和摇动过夜以100rpm和室温。
14. 离心在800×g离心10分钟并除去溶剂。
15. 让样品在通风橱干燥在室温下过夜。
16. 风干残余物，然后在真空干燥器放置在无水_氯化钙或的CaSO _4，直到达到恒重（3-5天）。

2.解聚:甲醇分解用甲醇钠（图2）

注意:执行步骤2.3 - 2.4，2.7 - 2.8，2.10 - 2.11 2.13 - 2.15和2.17 - 2.18下通风柜;总是穿着白大褂，手套和防溅护目镜。

1. 预热加热块到60℃。
2. 称量装有干渣（用于进一步的计算很重要）的试管。
3. 添加内部标准，以每管:25ωL甲基十七烷（1毫克/毫升的库存）和25微升ω十五内酯（1毫克/毫升的库存）。
4. 添加0.9 ml的乙酸甲酯，1.5 ml的甲醇钠和3.6毫升甲醇到每个管和盖它们。另外，准备一个反应混合物用这三种试剂，并添加6毫升分装到每个样品。
5. 热样品，在60℃涡流周期性地每间隔15分钟2小时。
6. 让样品冷却到室温。
7. 加入10毫升二氯甲烷_（CH 2 _Cl 2中）和1.5冰醋酸毫升提取脂肪酸甲基酯。
8. 加入盐水溶液（0.5M氯化钠），填补每个管和帽。
9. 涡旋样品1分钟，离心，在800×g下10分钟。
10. 转移有机相（低级）清洁介质尺寸试管（16×125mm玻璃管的试管与聚四氟乙烯（PTFE）-faced螺丝帽）。
11. 加入盐水溶液（0.5M氯化钠），填补每个管和帽。
12. 涡旋样品1分钟，离心，在800×g下10分钟。
13. 除去水（上）阶段，并重复步骤2.11-2.12。
14. 删除所有的水（上）阶段。
15. 添加无水硫酸钠（ _用 Na 2 SO _4）的溶剂中，盖上管，并涡旋1分钟;样品现在可能留到第二天。 此时样品可通风柜下放置过夜。
16. 离心2分钟，在800×g离心压缩在底部的_用 Na 2 SO ₄盐。
17. 将有机相转移到一个小玻璃一次性管（13×100毫米的玻璃试管用聚四氟乙烯（PTFE）-faced螺丝帽）。
18. 蒸发溶剂至干氮气下，然后继续衍生步骤。如果不立即处理，商店蒸发样品在-20℃（样品可以是一个LSO存储在蒸发步骤之前）。

3.准备作为气相色谱

注意:执行步骤3.1.2和3.1.5 - 3.1.8在通风橱;总是穿着白大褂，手套和防溅护目镜。

1. 三甲基硅衍生物
   1. 预热加热块到100℃。
   2. 加入100微升吡啶和100微升BSTFA（N，O-双 - 三甲基硅烷基三氟乙酰胺），以每管和盖它们。
   3. 热样品在100℃下进行10分钟。
   4. 让样品冷却到室温。
   5. 蒸发氮气下样品在室温下。避免将热施加到样品中，单体是高挥发性的，在这个阶段。
   6. 加入500微升1:1（体积/体积）的庚烷:甲苯。
   7. 涡旋样品1分钟，离心，在800×g下2分钟。
   8. 添加样品GC小瓶，然后继续GC / MS分析。
2. 乙酰衍生工具
   注意:对于乙酰化，修改步骤3.1.1-3.1.3以上如下（以视频未示出）;步骤3.1.4-3.1.8是相同的:
   1. 预热加热块到60℃。
   2. 加入100微升吡啶和100微升乙酸酐（徒_{2 O）}到管中。
   3. 热样品在60℃下1小时。

4. GC / MS分析

1. 使用的HP-5毛细管柱（30米×0.25毫米×0.25微米膜厚度）或等效（即，5％二苯基，95％二甲基聚硅氧烷）。程序用氦载气流量设定为1.5毫升/分钟，烘箱温度为150编程，以300℃，3℃/分钟的气相色谱。
2. 使用分流进样（分流比1:10），并设置质谱仪扫描模式在40-600 AMU（电子碰撞电离）。
3. 创建序列表包括溶剂（空白），WT和突变体重复，每个使用指示的角质分析方法。
4. 负载溶剂并且在转盘样品瓶，如果有必要加己烷到注射器漂洗小瓶在自动进样器，和启动序列。的顺序结束后，总离子色谱的痕迹可用于所有样品。

5.数据分析

1. 通过比较每个峰的质谱公布的质谱或通过搜索商业库（如果可用）确定脂质聚酯单体。
2. 在总离子流色谱图每个识别出的峰中，使用各自的保留时间上找到从GC / MS软件（ 参考图1）的积分结果表中的区域。
3. 对于每种单体（列AB）中，添加在积分表（ 参考图1，列D）中发现的面积值，以对每个相应列复制样品中的单体的Excel表格（ 参考文件2中，列CF），它是电子表格量化拟南芥角质TMSI衍生物。 使用补充文件3，如果乙酰化衍生物的制备代替。
4. 加的内部标准（IS）于IS柱（HK）的区域。对于那些没有衍生，即脂肪酸甲酯单体（脂肪酸甲酯），和二羧酸二甲酯（DCA测距仪），使用17:0 FAME（IS1）作为用于量化（紫色阴影细胞中的单体表; 补充文件2/3）。为羟基化的单体，包括伯醇，阿魏酸，ω羟基酸，使用的15:0 15羟基FAME（IS2），为是选择用于化合物定量（绿色- shadded细胞中的单体表; 参考文件2/3） 。
5. 添加干叶量为每复制到列AX-BA（辅助文件2）或AQ-AT（ 参考文件3）;另外，扫描叶计算表面积和单体表添加面积值来表示每单位单体负荷表面积。

Results

在这个手稿中描述的协议设置为确定脂质聚酯单体，最小化的非角质脂质¹⁰的贡献图1表示的测定法，其中共花费之间8的概述（即角质或软木脂） - 10天（从初始组织收获到获得的GC数据），这取决于样品多久被允许干燥。

所选择的碱催化的甲醇分解（图2）的方法来解聚聚酯先前被验证为拟南芥的种子，其中同时包含角质和软木脂。组织被第一匀化和彻底去脂以除去溶剂萃取的脂质。萃取后的残留物的产量，作为初始鲜重的百分比，为A.通常为6％ 拟南芥 Col-0中的叶子。细胞壁富集残基被干燥在真空干燥器，然后通过解聚成其组成甲酯单体碱催化transmethylation。两小时培养被选择作为需要进行适当的解聚和脂质聚酯组分的回收的临界时间。较长的孵育时间导致增加2-羟基酸;这些潜在源于鞘脂膜^10。

如果拟南芥野生型叶角质如图3的典型色谱， 办理 O -TMSi醚衍生物（ 图3A）和O -乙酰基衍生物（ 图3B）。每个峰通过比较质谱从文献^7,8和公共数据库^12。我们的视频协议示出了如何准备TMSI衍生物确定，但样品可替代地乙酰化衍生化的羟基。硅烷化衍生物是很好的用于标识目的，因为他们给的诊断质谱。然而，乙酰化衍生物更稳定，一个很好的替代硅烷化一旦单体已经^确定了10个。为了帮助实现此协议中的实验室仅具有GC耦合 ​​到火焰离子化检测器（FID）的是，GC / FID迹线对应于WT叶角质单体和同源物一系列脂肪酸甲酯标准乙酰化衍生物也示（ 参考图4）。

此方法是定性的，并且检测样本的定量差异，突变分析，因此它的值。各单体的量是使用量化的内标法，使样品之间的单体丰度比较来确定。然而，应该明确的是，峰的大小（总离子计数）可能不反映在聚酯中单体的摩尔比。我们包括单体的可编辑的表来计算在拟南芥叶子角质单体量为脂肪酸甲基酯和TMSI衍生物（ 参考文件1），或王牌醇的TYL衍生物（ 参考文件2）。这些表可能需要的，如果样本是从不同的器官或植物物种中提取进行调整。

作为一个例子，我们已经分析拟南芥塔利亚娜哥伦比亚（Col-0中）野生型叶片和CYP86A2 / ATT1基因，att1-1（M-1）和att1-2的两个先前表征的空突变等位基因（M-2 ^）13,14。在CYP86A亚家族的细胞色素P450单加氧酶编码假定ω-oxydases并参与木栓质和角质单体合成。我们的研究结果（图4）证明显著减少三个主要脂质单体的载荷在突变叶片与WT相比叶子。一致的与酶的预测的功能，16:0，18:2和18:1的二羧酸酯在ATT1突变体特别受到影响。

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图中的脂质聚酯分析1.概述。 请点击此处查看该图的放大版本。

图中的NaOMe催化甲基转移反应的2.机制的亲核甲醇阴离子攻击脂质聚酯的cabonyl碳，以形成不稳定的四面体中间体（A），它容易离解成脂肪酸甲酯和醇盐阴离子（B）中 。这些醇盐是共轭碱，和用甲醇反应，再生催化活性甲醇阴离子，从而维持附加解聚反应（C）。如果水存在于系统，它会与甲醇钠反应以形成氢氧化钠，强碱不可逆地水解的酯，以产生不希望的游离脂肪酸。乙酸甲酯加入助溶剂^15，除去少量的氢氧化系统（D）中的钠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。野生型拟南芥叶角质单体的代表总离子色谱图。（A）O三甲基甲硅烷（TMSI）醚和（B）乙羟基衍生物。 请点击此处查看该图的放大版本。 一>

图4.角质单体的拟南芥野生型组合物和CYP86A2基因的两个无效突变体等位基因。（突变-1 = att1-1;突变-2 = att1-2）误差棒代表平均值的标准偏差 （n = 4） 。从¹³改编，以©Blackwell出版（2007）的权限。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1峰值积分结果表从GC / MS软件。对应于识别的单体和内部标准的峰由它们的retenti确定时间（列C）和面积值列于列D. 请点击此处下载该文件。

补充文件2。表拟南芥角质单体（羟基脂肪酸甲酯三甲基硅醚衍生物）的。 请点击此处下载该文件。

补充文件3.表拟南芥角质单体（羟基脂肪酸甲酯-O-乙酰衍生物）的。COM /文件/ ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx"目标="_空白">请点击此处下载该文件。

补充图4的GC / FID的痕迹（AB）的脂肪酸甲酯（FAME）的保留指数的标准（峰标记与每个饱和FAME链长）; 和 （C）乙酰A.拟南芥 WT叶角质单体。上峰编号对应:16:0的FAME（1），阿魏酸（2），18:3的FAME（3），18:1/18:2脂肪酸甲酯（4），18:0的FAME（5），芥子（6 ），16:0 DCA（7），16-OH 16:0的FAME（8），18:2 DCA（9），18:1 DCA（10）18:0 DCA（11），18-OH 18:2 FAME（12），18-OH 18:1的FAME（13），20:0的FAME（14），-10,16- diOH 16:0的FAME（15），24:0的FAME（16）。 DCA:二羧酸二甲酯; FAME:脂肪酸甲酯; IS1:内标1，17:0 FAME; IS2:内部ST昂达尔2，15-OH 15:0 FAME。 请点击此处下载该文件。

Discussion

不像其他的生物聚合物如DNA和蛋白质，植物脂质聚酯不是从模板制成。相反，他们的组合物依赖于存在于使这些细胞外聚合物组织中的酶的特异性。这样，化学组成的分析成分是关键的了解脂质聚酯组合物。

化学方法裂解的酯键包括皂化，氢解，酸催化transmethylation，和碱催化transmethylation ^2。他们每个人都有优点和缺点。皂化产生游离脂肪酸羟基酸，可以进行二次反应。氢解用氢化铝锂（的LiAlH _^4）16已被用于角质分析^7。氢解降低官能碳为醇和原始结构需要由deuteriolysis锂铝氘（LiAlD _4）推断。该这种方法的缺点是高清晰度的GC / MS的要求来比较获得使它们的结构分配的脂肪多元醇的deuteriation的程度。酸催化的酯交换用甲醇三氟化硼（BF _3）已被常用于角质和软木脂depolymerizations ^8,17,18，但该试剂具有有限的货架寿命并可能引入由于副反应¹⁵假象。硫酸甲醇也产生的单体，但具有较大的2-羟基脂肪酸的比例，这大概是不正确的脂质聚酯组分甲酯，相比其他方法^10。

在这个协议中所描述的的NaOMe催化酯交换法产生由羟基甲硅烷基化衍生的脂肪酸甲酯，用于识别提供特性质谱，或通过乙酰化，以提供羟基更稳定的衍生物FO- [R量化。这种技术的一个缺点是水解竞争与酯交换当水存在于反应。水发生反应的NaOMe（催化剂），并产生氢氧化钠，这反过来水解脂肪酸甲酯，得到游离酸（图2D）。这是一种不希望的副反应，因为两个峰值将存在对于每个脂肪酸:甲基酯和TMSI酯衍生物，因此复杂的分析。用无水试剂并加入乙酸甲酯作为助溶剂与皂化竞争因此关键步骤，以防止水解（图2D）。

1和26％甘油^4之间的角质和木栓质含有。但是，此单体不会被在这个协议中所描述的实验条件下进行检测。甘油是高度亲水性的并且，不同于脂肪酸甲酯单体，将在水性溶剂洗涤步骤被消除。这种限制也是一个pplies其他角质解聚方法，但甘油可以在使用酶方法酯交换后得到的水层来确定。可替代地，它可以使用较温和的条件（，0.05M的的NaOMe 当量）定量无需进一步水萃取，以检测所有的单体，包括甘油^19,20。虽然对于甘油量化的目的是有用的，在温和的条件通常给角质的不完全解聚和木栓质。

如果耦合到一个火焰离子化检测器（FID）的GC一个是可用的，所有的重复可在该仪器进行定量目的被分析，有代表性的样品的峰已确定的GC / MS后。或者，在GC / FID痕迹单体可以识别，如果他们的保留指数是已知的。火焰离子化检测器具有特别高的灵敏度和宽范围相称，这是主要和次要样品组分定量临界在单次运行。此外，它是坚固和易于维护和操作^15。

所描述的协议允许的可靠和可重复的分离，鉴定和定量植物脂质聚酯单体，允许其在不同的一种或多种脂质聚酯单体的组合物的突变体的化学特性。该过程是可伸缩的，它可以很容易地适用于处理小型和大批量的各种植物材料，包括根，种子，叶，茎和花。来自许多物种的脂质聚酯单体的质谱数据已经公布^{，例如 ，21-26}和构成宝贵资源适应这个协议对其他组织和/或物种时识别未知单体。这种方法适用于生物合成，调节和高等植物分布脂质聚酯的调查。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化学品
2-丙醇	Fisher Scientific	BPA451-4	脂溶剂
无水硫酸钠	Fisher Scientific	S421500
乙酸酐	Sigma Aldrich	320102	衍生剂
BSTFA （N，O-双（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺）	Sigma-Aldrich	15222	衍生剂
丁基化羟基甲苯 （BHT）	Sigma-Aldrich	101162	抗氧化剂
无水氯化钙	Fisher Scientific	C614-3	干燥剂
无水琥珀酸钙（DRIERITE-8 MESH，带指示剂）	Acros Organics	219090020	干燥剂
氯仿（三氯甲烷）	Fisher Scientific	C6074	有机溶剂
冰醋酸	Fisher Scientific	BP2401212	酸化剂
氦载气，压缩空气	液化	ALPHAGAZ1-UN1046	载气，GC/MS
庚烷	Fisher Scientific	H3501	有机溶剂
己烷	Fisher Scientific	H3024	有机溶剂
甲醇	Fisher Scientific	A4124	有机溶剂，转甲基化反应
乙酸甲酯	Sigma-Aldrich	296996	有机溶剂
七烷酸甲酯	Sigma-Aldrich	H4515	内标（1 mg/mL 储备液）
二氯甲烷（二氯甲烷）	Fisher Scientific	D374	有机溶剂
压缩氮气	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1044	载气，GC-FID
十五酸内酯	Fluka	76530	内标（1 mg/ml 原液）
吡啶	Sigma-Aldrich	270970	衍生化助溶剂
氯化钠	Fisher Scientific	BP358212	盐溶液
甲醇钠 （25wt.%）	Sigma-Aldrich	156256	亲核
甲苯	FIsher Scientific	T2904	有机溶剂
植物生长用品
Pro-Mix PGX	Premier Tech Horticulture Ltd		Pro-Mix PGX 推荐用于种植拟南芥植物（Eddy， R. 和 Hahn， D.T.，2012 年，http：//docs.lib.purdue.edu/pmag/2） 普渡大学拟南芥生长的方法。
PermaNest 湿度圆顶	Grower's Solution， LLC， 田纳西州库克维尔	GD2211-24
永久巢式植物托盘（22x11英寸）	Grower's Solution， LLC，田纳西州库克维尔	N/A
方形温室花盆，3.5 英寸	Grower's Solution， LLC， 田纳西州库克维尔	P86
通用植物肥料，Plant-Prod 20-20-20	Premier Tech Home and Garden In.， Brantford， ON	N/A
玻璃器皿
13 x 100 毫米玻璃试管，带特氟龙面螺帽	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-13100
16 x 125 毫米玻璃试管，带特氟龙面螺帽	Kimble Chase 生命科学和研究产品有限责任公司	45066A-16125
20 x 125 毫米玻璃试管，带特氟龙面螺帽	Kimble Chase 生命科学和研究产品有限责任公司	45066A-20125
GC 样品瓶盖	国家科学	C400051A
GC 样品瓶微量插件	国家科学	C4011631
GC 样品瓶	国家科学	C40001
一次性巴斯德移液管	Fisher Scientific	1367820B
烧瓶	Fisher Scientific
设备
Allegra X15R 离心机	Beckman Coulter
分析天平	Fisher Scientific
肚皮舞者			如果 Belly Dancer 不可用，可以使用摇床
DB-5 毛细管 GC 色谱柱	J&W Scientific，美国加利福尼亚州;		30 米 x 0.25 毫米 x 0.25 亩m 膜厚
干燥器
Isotemp 202 水浴	Fisher Scientific
ISQ LT 单四极杆质谱仪	Thermo Scientific
加热块	Fisher Scientific
氮气蒸发器
Polytron 均质器	Birkmann
Trace 1300 气相色谱仪	Thermo Scientific
两级调节器	液化空气	Q1-318B-580
真空干燥器	Fisher Scientific
涡旋混合器	Fisher Scientific