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一种在常温条件下控制金纳米颗粒稳定寡聚簇尺寸的简便合成方法

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DOI：

10.3791/53388

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2016年2月5日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Condensed Matter Physics Department, Laboratory of Biophysics, Jozef Stefan Institute

本文内容

摘要

我们介绍一种通过硫氰酸钠（NaSCN）还原氯金酸（HAuCl4）来制备高度稳定的金纳米颗粒寡聚簇的简单方法。这些寡聚簇具有较窄的尺寸分布，并可制备出多种不同尺寸和表面包覆的产物。

摘要

在碱性条件下，使用硫氰酸钠（NaSCN）还原稀水溶液中的HAuCl4，可生成直径为2至3 nm的纳米颗粒。这些黄色、粒径分布均一的纳米颗粒可在常温条件下通过两种方法合成出稳定的葡萄状寡聚簇。延迟时间法通过调节将HAuCl4加入碱性溶液与随后加入还原剂NaSCN之间的时间间隔，来控制寡聚簇中亚基的数量。所生成的黄色寡聚簇尺寸范围约为3至25 nm。通过附加方法，利用羟基氯化金（Na+[Au(OH4-x)Clx]-）对已合成的寡聚簇纳米颗粒进行自催化，进一步增加其亚基数量，可将尺寸范围扩展至3 nm至70 nm。粗制的寡聚簇产物具有较窄的粒径分布，大多数情况下无需进一步分级纯化。所形成的寡聚簇可浓缩>300倍而不发生聚集，且粗反应混合物在未经进一步处理的情况下可稳定保存数周。由于这些寡聚簇可在衍生化前进行浓缩，因此能够经济地使用昂贵的衍生化试剂。此外，我们提出了两种模型，可极为准确地预测颗粒尺寸。

引言

在过去的几十年中，金纳米颗粒作为生物医学应用和基础研究工具的使用已大幅增长。很少有现代纳米材料被应用于如此众多的不同领域，其用途涵盖从太阳能电池板到光热癌症治疗，从电子传感器到生物传感器，从化学催化到药物递送系统1-7。人们对金纳米颗粒在这些领域中作为工具的兴趣，源于金纳米颗粒所具备的独特性质，包括特殊的结构、光学和电子特性8。

金纳米颗粒在生物和化学检测中的应用日益广泛9,10。尽管市面上有多种渠道可购买金纳米颗粒，但其价格远高于实验室自制的成本。商业化纳米颗粒的高昂价格使得实验室自制成为更理想的选择。我们的方法涉及合成由2-3 nm球形金亚单元构成的寡聚纳米簇。寡聚纳米簇具备传统金纳米颗粒的全部优势，在进行通透性或过滤速率测定时尤为优选，因其模块化结构可模拟蛋白质的结构。

目前，实验室合成金纳米颗粒最常用的方法是在水相条件下还原氯金酸（HAuCl4）11,12。使用常见的还原剂（如硼氢化钠（NaBH4）或柠檬酸钠）还原HAuCl4，可制备出球形纳米颗粒13。这些方法合成的金纳米颗粒在可用尺寸范围上存在局限性，因为随着颗粒核直径的增大，它们对生物缓冲液中盐类的存在变得更为敏感。此前已有报道，在碱性条件下使用硫氰酸钠还原HAuCl4，可合成直径为2–3 nm的黄色纳米颗粒14,15。

本文介绍了一种对该方法的改进，可在无需额外封端剂的情况下，生成呈葡萄状的黄色纳米粒子寡聚簇。通过简单调节将 HAuCl4 加入碱性溶液与随后加入还原剂硫氰酸钠之间的时间间隔，即可将所得金颗粒的尺寸调控在约 3 nm 至约 25 nm 范围内。为制备更大颗粒，可采用一种简单的附加步骤：在硫氰酸钠存在下，向原位合成的寡聚簇中加入羟基化金（HG），实现寡聚簇的生长。利用这两种方法，我们能够可靠地制备出尺寸范围从约 3 nm 至约 70 nm 的寡聚簇。该方法可在常规台面条件下，使用标准设备和有限数量的试剂，实现高质量金寡聚簇的精确可控合成，从而有望使缺乏或不具备化学合成经验的研究人员也能将金纳米粒子作为研究工具加以利用。

方案

1. 试剂的准备

警告：操作化学品和溶液时务必小心。应遵循适当的安全操作规范，并始终佩戴手套、护目镜和实验服。请注意，与相应的块体材料相比，纳米材料可能存在额外的危害。
注意：所有化学溶液均以质量摩尔浓度（每千克溶剂中的克摩尔数）配制，而非摩尔浓度（每升溶液中的克摩尔数）。

  1. 氯金酸的制备
    1. 将1 g三水合氯金酸溶解于100 g H2O中，得到25 mM HAuCl4。
  2. 硼砂（Na2B4O7·10H2O）的制备
    1. 将3.81 g硼砂溶解于100 g H2O中，得到0.1 molal硼砂溶液（必要时加热以确保完全溶解）。
  3. 硫氰酸钠的制备
    1. 将8.1 g硫氰酸钠溶解于100 g H2O中，得到1 molal NaSCN溶液。
  4. 碳酸钠的制备
    1. 将5.3 g无水碳酸钠溶解于100 g H2O中，得到0.5 molal Na2CO3溶液。
  5. 谷胱甘肽的制备
    1. 每1 ml 0.5 molal Na2CO3溶液中溶解154 mg还原型谷胱甘肽（GSH），得到0.5 molal GSH溶液。

2. 金寡聚簇的合成

  1. 金寡聚簇的延迟时间合成
    1. 向一个洁净的 125 ml 沃顿（Wheaton）玻璃瓶（内含搅拌子）中加入 59.5 ml H2O。可使用任何洁净的平底玻璃容器，但必须确保其非常洁净。
    2. 加入 7 ml 0.1 molal 硼砂溶液，并使溶液剧烈搅拌。
    3. 在剧烈搅拌下加入 2.8 ml 约 25 mM 的 HAuCl4，并等待所需的延迟时间（加入 HAuCl4 即开始计算延迟时间）。延迟时间将决定所合成寡聚簇的尺寸，如表 1所示。
    4. 在达到所需延迟时间后，加入 700 µl 1 molal 的 NaSCN，并短暂剧烈搅拌（1,200 rpm，持续 30 秒）。
    5. 取出搅拌子，让反应过夜完成（若在反应完成期间持续过夜搅拌混合物，可进一步改善寡聚簇的尺寸分布）。反应完成后，所合成的粗产物寡聚簇可在数周内保持稳定。
  2. 寡聚簇的加成生长
    1. 将 10 ml 所合成的寡聚簇与 60 ml HG 混合。所合成寡聚簇与 HG 的比例决定了最终寡聚簇的尺寸，增加 HG 的相对用量将生成更大的寡聚簇。
    2. 加入 900 µl 1 molal 的 NaSCN，并短暂剧烈搅拌（1,200 rpm，持续 30 秒）。
    3. 让反应过夜完成（若在反应完成期间持续过夜搅拌混合物，可进一步改善寡聚簇的尺寸分布）。

3. 谷胱甘肽衍生物化及寡聚簇的浓缩

  1. 将70 ml新合成的粗制寡聚簇（或附加法获得的寡聚簇）加入一个70 ml、截留分子量为30 kDa的离心过滤器中。
  2. 离心15分钟，3,000 x g。此步骤可将颗粒浓缩至约250 µl的体积。
  3. 将装置翻转，以500 × g离心3分钟，收集截留液。回收体积应约为250 µl。
  4. 使用微量移液器测量回收体积。
  5. 加入与体积比为1/9的0.5 molal谷胱甘肽（或其他巯基化合物）th 浓缩寡聚簇的回收体积（最终浓度为 50 mmolal GSH）。
  6. 室温下静置衍生化反应5-10分钟。衍生化反应进行迅速，反应时间过长可能导致颗粒溶解。
  7. 将衍生化的寡聚簇稀释至50 ml的Dulbecco磷酸盐缓冲液中。（其他缓冲液或H2在此步骤中，可选择 O 作为稀释液/洗涤缓冲液。具体选择通常取决于后续应用目的。
  8. 将所有稀释后的衍生化寡聚簇加入30 kDa截留分子量的离心过滤管中。
  9. 将离心过滤器在 3,000 x g 条件下离心 15 分钟。
  10. 将装置翻转，以500 × g离心3分钟，收集截留液，回收体积约为250 µl。所得浓缩颗粒可直接使用，在4 °C下可稳定保存数月。

4. 寡聚簇合成的分析与验证

  1. 寡聚簇的凝胶电泳
    1. 粗制寡聚簇样品的电泳
      1. 将合成后的寡聚簇样品与上样缓冲液按2:1体积比混合，上样缓冲液含60%甘油、约0.15%溴酚蓝和150 mmolal GSH（由0.5 molal GSH溶于0.5 molal Na2CO3中配制的储备液）。
      2. 取30 µl样品上样至预制聚丙烯酰胺梯度凝胶（任意kDa范围），使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM甘氨酸；不添加SDS），在恒定电压200 V下电泳26分钟。
    2. 谷胱甘肽（GSH）衍生化寡聚簇的电泳
      1. 将GSH衍生化的寡聚簇样品用H2O按1:3比例稀释（通常取2 µl GSH-寡聚簇加入6 µl H2O）。
      2. 将稀释后的GSH衍生化寡聚簇样品与上样缓冲液按2:1体积比混合，上样缓冲液含60%甘油、约0.15%溴酚蓝和150 mmolal碳酸氢钠。
      3. 取10 µl样品上样至预制聚丙烯酰胺梯度凝胶（任意kDa范围），使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM甘氨酸；不添加SDS），在恒定电压200 V下电泳26分钟。
  2.  透射电子显微镜（TEM）
    1. 寡聚簇的TEM样品制备
      1. 为洗涤寡聚簇，将20 µl浓缩的寡聚簇样品用0.5 ml H2O稀释后，转移至0.5 ml截留分子量为30 kDa的离心过滤装置中。
      2. 在14,000 × g条件下离心10分钟。
      3. 弃去滤液，将截留物用新鲜的0.5 ml H2O重悬。
      4. 重复洗涤两次，共完成三次洗涤。
      5. 将最终的截留物在H2O中稀释500倍（此时寡聚簇已准备好用于载网）。
    2. 寡聚簇的载网
      1. 对碳支持膜载网进行辉光放电处理。
      2. 将0.6 µl洗涤并稀释后的寡聚簇样品滴加到经辉光放电处理的碳支持膜载网上。
      3. 让载网在空气中干燥10分钟。
      4. 在100,000倍放大倍数下通过透射电子显微镜观察寡聚簇。本实验中成像操作电压为80 kV。

结果

金寡聚簇的合成通过凝胶电泳进行分析（图1）以及透射电子显微镜（TEM）（图2）。可通过电泳监测GSH包被寡聚簇的尺寸，较大的颗粒迁移较慢且条带颜色更深。此外，通过电泳后条带的宽窄程度可推断特定尺寸样品的均一性（即， 对于给定大小的样品，粒径分布较窄的样品制备物将比粒径分布较宽的相同大小样品制备物产生更紧密的条带。 图2 描述了时间延迟（延迟时间法）或 HG:seed（附加法）与寡聚簇尺寸之间的关系。分别利用透射电子显微镜（TEM）测定的平均直径，确定延迟时间法和附加法中寡聚簇生长对延迟时间和 HG:seed 的依赖性。流程图（图3）概述两种方法的步骤以及一张表格（表1) 提供了可生成所需大小寡聚簇的预测参数。

Electrophoresis diagram of hydroxylated gold growth; time-labeled bands show growth progression.
图1. 延迟时间法和添加法形成的寡聚簇的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 通过梯度凝胶电泳分析由延迟时间和追加方法产生的寡聚簇。泳道 2–4：在 HAuCl 制备后不同延迟时间（45、135 和 405 秒）形成的寡聚簇。4 碱性和添加 NaSCN. 泳道 5–8：通过加成法形成的寡聚簇。种子通过延迟时间法形成，延迟时间为 405 秒，以 ↓ 表示。加成过程中使用不同量的 HG。各样品制备时所用 HG 溶液（1 mM 金浓度）与种子溶液（1 mM 金浓度）的体积比分别表示为 4xHG、6xHG、12xHG 和 24xHG。 请点击此处下载此文件。

纳米颗粒生长分析；图A、B、C显示直径随时间/浓度变化；动力学模型。
图2. 通过延迟时间法和添加法形成的金寡聚簇的直径。采用透射电子显微镜（TEM）对通过延迟时间法和添加法制备的寡聚簇进行分析。图A和图B经许可改编自参考文献16，版权所有2014年美国化学会。(A) 延迟时间法制备样品的网格上50 nm × 50 nm区域的代表性TEM图像。图中显示了颗粒的直径（Y轴）及其制备过程中使用的延迟时间（X轴），两轴均为对数坐标。粗黑线（R2 = 0.973）为经验三参数方程 Ddelay-time = D0 + a(1 - e-bt) 的最佳拟合结果，其中 Ddelay-time 表示簇的平均直径（单位：nm），D0 为簇的最小直径（约3.5 nm）；a 为延长延迟时间导致的核心尺寸最大增加量（约20 nm），b = 0.0021 sec-1。(B) 在加入NaSCN前经历不同延迟时间后形成的寡聚簇直径（延迟时间法），以线性坐标表示。(C) 在采用延迟时间法（延迟时间为405秒）预先形成金种子后，通过添加不同量的HG（添加法）所形成的寡聚簇的直径。如粗黑线所示，添加法形成的寡聚簇直径可表示为 静态平衡分析公式；加性延迟计算方程；教育用途，其中 cHG 和 cSeeds 分别为添加法中用于制备HG溶液以及延迟时间法制备寡聚簇时所用氯金酸的浓度。类似地，VHG 和 VSeeds 为相应的体积。请点击此处下载该文件。

金纳米颗粒合成过程；显示使用 NaSCN 的延迟时间法和添加法示意图。
图 3. 制备不同尺寸金寡聚簇的延迟时间法与添加法墙图示意图。流程图概述了使用延迟时间法或添加法合成不同尺寸金寡聚簇的操作步骤。氯金酸的碱性溶液呈蓝色，HG 呈红色，金纳米颗粒种子和寡聚簇为黑色。请点击此处下载该文件。

延迟时间程序添加程序
预测直径 (nm)
延迟时间 (秒)延迟时间 (分钟)预测直径 (nm)实测直径 ± 标准差 (nm)4×HG6×HG12×HG24×HG100×HG1000×HG
10.023.5
20.033.63.1±1.36.16.98.410.516.736
30.053.6
40.073.7
50.083.72.6±1.16.37.18.710.817.337
60.103.8
70.123.8
80.133.8
90.153.9
100.173.96.77.59.211.41839
110.184.0
120.204.0
130.224.0
140.234.1
150.254.13.3±1.57.07.99.712.01941
200.334.3
250.424.5
300.504.7
350.584.9
400.675.1
450.755.36.4±29.110.112.515.52553
601.05.9
751.36.4
901.56.9
1051.87.5
1202.08.0
1352.38.411±314.416.120253984
1652.89.4
1953.310
2253.811
2554.312
2854.813
3155.313
3455.814
3756.314
4056.81514±52629354470150
4357.315
4657.816
4958.316
5258.817
5559.317
5859.818
6151018
9001520
1200202220±1137425164102219
15002523
18003023
21003523
24004023
27004523
30005023
33005523
3600602325±1140455569109235

表1. 寡聚簇尺寸预测表。 使用延迟时间法或加成法制备的金寡聚簇的预测直径。延迟时间法的预测直径通过平均寡聚簇直径的经验公式 D延迟时间 = D0 + a(1 - e-bt) 计算，其中 D 为金寡聚簇的平均直径（单位：nm），D0 为最小直径（3.5 nm），a 为核心尺寸的最大增加量（20 nm），b 为 0.0021 sec-1，如先前报道16。加成法的预测直径计算基于以下事实：新纳米颗粒不能从氢金酸（HG）中重新形成，而是均匀沉积在预先形成的球形种子周围，从而使种子增大。无需其他假设。可以看出，通过加成法形成的寡聚簇直径为 包含变量和平方根符号的延迟时间计算公式示意图。，其中 cHG 和 cSeeds 分别为在加成法中制备 HG 溶液以及在延迟时间法中制备寡聚簇时所用的氯金酸浓度。同理，VHG 和 VSeeds 为相应的体积。

讨论

本文提供了一种在实验台上合成单分散金寡聚簇的详细方案（图3该方法通过简单改变加入HAuCl后的间隔时间，即可制备出多种不同尺寸的产物。4 加入碱性溶液以及随后添加还原剂硫氰酸钠。加入 HAuCl4 向碱性缓冲水溶液中加入 HAuCl 会导致其随时间依赖性的羟基化反应4 至羟基化的金（Na+[Au(OH4-x)Clx]-）。这种羟基化导致 HAuCl 减少4 可被利用，尽管羟基化反应无法完全进行到底，因为这是一个可逆平衡反应。成核及形成过程 从头合成 金单体只能由HAuCl引发4羟基化金仅能添加到已有的金纳米颗粒上，从而形成金寡聚簇；我们的附加方法利用了这一特性 16采用延迟时间法制备的寡聚簇可作为种子，用于沉积羟基化金，从而增大接种寡聚簇的尺寸。通过调节羟基化金（HG）的比例，可控制接种生长过程。 与 合成的寡聚簇（图1）。在这两种方法中，通过选择合适的时间延迟，可轻松预测颗粒的大小。图2A、B）或通过选择合适的起始种子以及添加的羟基化金（HG）的合适比例（图2C）。给出了最有用的粒径范围的预测结果（表1). 可通过电泳监测经GSH衍生化的寡聚簇尺寸的增加，较大的颗粒迁移较慢且明显更暗，后者是由于金纳米颗粒的消光系数随粒径增大而成比例增加所致。

附加法存在两个局限性，其一是当高比例的HG与种子反应时需要较大的反应体积。附加法的第二个局限性源于前述事实，即HAuCl4的羟基化是一个可逆平衡反应，无法完全进行到底。当寡聚簇种子浓度较高时，HAuCl4未完全羟基化对附加反应的影响极小。然而，当寡聚簇种子浓度较低时（例如使用长延迟时间种子或高HG:种子比例的情况），未羟基化的HAuCl4的影响可能变得显著。在此类条件下，HAuCl4能够引发新的寡聚簇成核，导致生成不均一的寡聚簇群体。

通过延迟时间法或附加法制备的合成寡聚簇可稳定数周，仅产生微量金沉淀物。即使浓缩300倍后，寡聚簇仍保持稳定且不发生聚集。本文所述的金寡聚簇还具有无需预先衍生化即可浓缩的优点，从而可减少昂贵衍生化试剂的使用量。经谷胱甘肽（GSH）衍生化后，寡聚簇的稳定性可维持长达一年。GSH衍生化还可赋予寡聚簇强负电荷 13 这使得它们在接触生理缓冲液或动物血浆时能够抵抗聚集，从而使其适用于 体内 实验。衍生化可通过多种含巯基的试剂实现。

寡聚簇易于与含其他巯基的分子进行衍生化反应17,18，从而可方便、简便地修饰其表面单分子层，进而调控寡聚簇的表面化学性质与反应活性。本实验方案中使用的其他化学试剂也可用类似试剂替代，而不会影响合成效果。这包括使用其他碱性缓冲液（例如，碳酸盐）替代硼砂，以及使用其他硫氰酸盐（例如，KSCN）替代硫氰酸钠。

本方案的主要特点是其简便性，这一点必须强调。仅需使用毫克级天平和磁力搅拌器，即可制备出具有商业质量的金寡聚簇，可用于先进的生物和材料应用。由于可制备的粒径范围广泛且产物具有单一分散性，因而适用性广泛。此外，实验室自行制备还具有低成本的优势。

寡聚簇对于研究基底膜和血屏障的通透性特别有价值。它们可通过不同途径用生理盐水轻松给药，并可在体内进行追踪in vivo 19-21。获得的组织样本可随后在电子显微镜下进行检查16,22。除了通透性研究外，生物分布也提供了重要的药理学信息，而给予不同尺寸的寡聚簇混合物则可提供有关颗粒在体内尺寸依赖性分布的宝贵数据23-25。最后，由于其独特的结构，寡聚簇无法表现出局域表面等离子体共振（LSPR），这可能使其成为荧光标记的理想候选材料；而在金纳米颗粒中，由于LSPR与荧光团之间的相互作用几乎完全淬灭了荧光，因此荧光标记难以实现26。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

T.K. 感谢 斯洛文尼亚研究署（ARRS，项目编号 BI-US/13-14-040 和 J3-6803）的资助。  O.S. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）项目 RO1HL49277 的资助。  

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
125 ml 沃辛顿玻璃瓶Fisher ScientificSC-06-404F
硼砂（Na2B4O7·10H2O）Fisher ScientificS25537
三水合氯化金(III)Sigma AldrichG4022
硫氰酸钠Sigma Aldrich251410
碳酸钠Sigma AldrichS7795
谷胱甘肽Sigma AldrichG4251
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Corning21-031-CV
Centricon Plus - 70MilliporeUCF703008
碳酸氢钠Sigma AldrichS6014
200目铜网上CF200-Cu碳支持膜 Electron Microscopy Sciences71150
10倍浓度Tris/甘氨酸缓冲液Bio-Rad161-0734
任意分子量Mini-PROTEAN TGX凝胶Bio-Rad456-9033

参考文献

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一种在常温条件下控制金纳米颗粒稳定寡聚簇尺寸的简便合成方法
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