一种无需操作即可研究攻击行为及“失败者效应”的新方法 Drosophila melanogaster

摘要

在果蝇争斗过程中，所观察到的行为模式、争斗动态以及相关的学习与记忆均受到实验条件的影响。本文介绍了一种全新的实验方案，该方案完全消除了实验过程中对果蝇的人工操作。这不仅改善了争斗的动态过程，还有助于形成显著的"失败者"效应。

摘要

Drosophila melanogaster的攻击行为由一系列顺序表达的刻板行为模式组成（分析方法见¹）。这种复杂行为受到遗传、激素和环境因素的影响。与许多生物体相似，果蝇先前的打斗经历会影响其后续打斗策略及胜负结果：输掉一次打斗会增加其在后续竞争中再次失败的概率，显示出可能涉及学习与记忆的"失败者"效应^2-4。伴随攻击等复杂社会行为表达而产生的学习与记忆过程，对实验前动物的操作处理较为敏感^5,6。目前不同实验室采用多种实验方法研究攻击行为^7-9，但尚无常规使用的、可避免操作处理果蝇的标准化方案。本文报道了一种新型行为实验装置，该装置利用果蝇固有的负向趋地性反应，使其自主进入或离开打斗室，从而完全避免了对果蝇的人工操作。在本方案中，小型圆形打斗区域中央放置一个食物杯，并在引入果蝇前通过可移动的塑料隔板将区域均分为两半。果蝇通过滑动门和趋地性从其原处的隔离培养管进入打斗室。移除塑料隔板后，果蝇可自由互动。在设定的时间段后，再次使用隔板将果蝇分隔开以进行后续实验。整个过程无需对单个果蝇进行人工操作，操作简便。该装置为研究果蝇攻击行为及其相关学习与记忆（包括打斗中"失败者"效应的形成）提供了新方法。此外，这一新型通用行为装置也可用于研究果蝇的其他社会行为，总体上对于探究经验相关的基本行为过程变化具有重要意义。

引言

在动物系统中，攻击行为与获取和占有资源（如食物、领地和配偶）密切相关。鉴于攻击行为对个体适应性的重要作用，其在动物界中的广泛演化并不令人意外。作为一种直接使个体受益的适应性性状，攻击行为与较强的学习和记忆成分相关。 在争夺社会等级的过程中，先前的打斗经历会影响后续竞争的结果。通常情况下，此前失败的经历会增加而胜利的经历会降低在后续竞争中失败的概率（分别称为"失败者"效应和"胜利者"效应）。"失败者"效应已在多种物种中被观察到，一些研究表明，这种效应可持续数天，而"胜利者"效应通常持续时间较短^2,10,11。

关于果蝇（D. ampelophila）攻击行为的首次报道由Sturtevant于1915年发表，该研究主要关注性别识别与性别选择¹²。半个世纪后，研究人员对雄性果蝇的攻击行为进行了更为全面的观察，描述了果蝇打斗过程中大多数可观察到的行为模式。这些实验主要在由少量雄性和雌性果蝇组成的小群体中进行，持续观察数小时^13-15。近年来，随着强大遗传工具的应用，以及成对同性别打斗实验设计和较短观察时间的引入，D. melanogaster 已成为研究攻击行为生物学机制的重要模型系统^1,16。对同性别雄性和雌性果蝇之间打斗的分析表明，攻击行为包含一系列刻板的行为模式，这些模式以统....

方案

注意：以下是用于在雄性果蝇（D. melanogaster）之间可靠诱发攻击行为的实验方案的逐步说明。该程序可诱导产生“失败者”效应。最近也有研究报道，使用此方案可观察到短期的“胜利者”效应^5,6。图1展示了行为实验的时间线。

图1. 攻击行为实验时间线。第1天，将晚期雄性蛹（翅膀变黑时）分离至新制备的隔离小瓶中。成虫羽化后的第5天，用CO₂麻醉4日龄的雄性果蝇，并用不同颜色标记以用于个体识别。第7天，准备食物杯和争斗室以开展行为学实验。将两只6-7日龄的成年雄性果蝇放入争斗室中，使其能够相互接触。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

本部分介绍了行为实验箱的设计，以及根据上述方案测量攻击行为和“失败者”效应形成的一组典型行为实验的分析方法。同时展示了利用该装置可测量的其他行为的示例。

图6展示了新装置的示意图。该装置由三个圆柱形孔洞（尺寸：直径22.86 mm，高17 mm）组成，作为打斗区域。两片式盖子封闭装置顶部的打斗区域，并允许插入一片薄的不透明塑料隔板，将每个孔洞均分为两个相等的部分。装置两侧设有带三个孔洞（直径15.88 mm）的滑动侧壁，可通过负向趋地性，直接从果蝇的隔离小瓶将其装入打斗区域。果蝇进入打斗区域后，滑动侧壁用于封闭所有孔洞的侧面。此时，两只果蝇虽处于同一打斗区域内，但因隔板的存在而无法相互接触。移除隔板后，果蝇即可自由互动，随后的行为模式便可被观察和记录。

攻击性实验：共进行了38次野生型CS雄性果蝇配对打斗实验。在果蝇处于食物杯期间记录不同的行为参数，并分析打斗行为的动态过程（表1）。在20分钟的时间段内，平均每只果蝇经历了24次相遇（果蝇之间的短暂会面）和54.......

讨论

利用具有强大遗传学方法的Drosophila作为攻击行为研究的模式生物的现代研究时代，大约始于十二年前，当时引入了新型实验装置，可在单对果蝇中稳定地诱导出打斗行为^1,7,8,17,19。这些装置包含果蝇所需资源（如食物杯、潜在配偶）以及供失败个体退避的空间。当这些装置所得结果与此前关于果蝇争斗行为的知识相结合后，Drosophila melanogaster被牢固确立为研究攻击等复杂行为的理想模型系统，并被众多实验室广泛采用。综合研究结果表明：（a）果蝇在争夺食物资源、交配权或领地防御时表现出攻击行为^14,15；（b）打斗行为由一系列顺序固定的刻板行为模式组成¹；（c）雄性和雌性果蝇均可在同性配对中发生争斗（某些行为模式为雄性特有，某些为雌性特有，另有部分为两性共有）¹⁷；（d）仅雄性间的打斗可达到高强度水平，并形成具有明确“胜者”与“败者”的等级关系¹⁷；（e）性别决定通路中的单个基因fruitless决定了果蝇以雄性或雌性方式发生争斗¹⁶；（f）多种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黑腹果蝇蛹	布卢明顿果蝇资源中心
标准果蝇培养基			实验室自制。
行为实验装置	Mike 机器公司		实验室自制。请直接 联系该公司获取更多信息。
硼硅酸盐玻璃小瓶	VWR International	47729-576	16 × 10 mm
棉絮	Fisherbrand	22-456-881	任何品牌均可使用
巴斯德吸管	VWR International	53300-567
画笔	Blick 美术材料公司	06157-7030	圆形，3/0 号
牙签	不适用	不适用	任何品牌均可使用
丙烯颜料（蓝色/白色）	Blick 美术材料公司	01637-5172/01637-1022	任何品牌均可使用
干型活性酵母	Sigma	YSC2-500G
螺口管	VWR International	10011-394	直径 15 mm，高 10 mm
微量离心管（Eppendorf）	VWR International	22363212
胶带	不适用	不适用	任何品牌均可使用
塑料切片	电子显微镜科学公司	70329-40	22 × 40 × 0.25 mm 厚度
光源（灯泡）	VWR International	500003-418	任何品牌均可使用
计时器	VWR International	62344-641	任何品牌均可使用
培养箱	Percival		请直接联系制造商获取更多信息。
干燥二氧化碳（CO2）	Medical-Technical Gases, Inc	14H31
双目解剖镜	尼康	SMZ-745	任何品牌均可使用
摄像机（SONY Handycam  HDR-CX330）	B&H	SOHDRCX330B	任何品牌均可使用
计算机			至少配备 1.4 GHz 处理器，运行 Microsoft Windows 或 Macintosh HD 操作系统
ClipWrap	在线下载		任何导入软件均可使用
QuickTime 播放器	在线下载		任何播放软件均可使用
GraphPad 软件	在线		任何统计分析软件均可使用