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方法文章

一种无需操作即可研究攻击行为及“失败者效应”的新方法 Drosophila melanogaster

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DOI：

10.3791/53395

⸱

2015年12月30日

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

在果蝇争斗过程中，所观察到的行为模式、争斗动态以及相关的学习与记忆均受到实验条件的影响。本文介绍了一种全新的实验方案，该方案完全消除了实验过程中对果蝇的人工操作。这不仅改善了争斗的动态过程，还有助于形成显著的"失败者"效应。

摘要

Drosophila melanogaster的攻击行为由一系列顺序表达的刻板行为模式组成（分析方法见1）。这种复杂行为受到遗传、激素和环境因素的影响。与许多生物体相似，果蝇先前的打斗经历会影响其后续打斗策略及胜负结果：输掉一次打斗会增加其在后续竞争中再次失败的概率，显示出可能涉及学习与记忆的"失败者"效应2-4。伴随攻击等复杂社会行为表达而产生的学习与记忆过程，对实验前动物的操作处理较为敏感5,6。目前不同实验室采用多种实验方法研究攻击行为7-9，但尚无常规使用的、可避免操作处理果蝇的标准化方案。本文报道了一种新型行为实验装置，该装置利用果蝇固有的负向趋地性反应，使其自主进入或离开打斗室，从而完全避免了对果蝇的人工操作。在本方案中，小型圆形打斗区域中央放置一个食物杯，并在引入果蝇前通过可移动的塑料隔板将区域均分为两半。果蝇通过滑动门和趋地性从其原处的隔离培养管进入打斗室。移除塑料隔板后，果蝇可自由互动。在设定的时间段后，再次使用隔板将果蝇分隔开以进行后续实验。整个过程无需对单个果蝇进行人工操作，操作简便。该装置为研究果蝇攻击行为及其相关学习与记忆（包括打斗中"失败者"效应的形成）提供了新方法。此外，这一新型通用行为装置也可用于研究果蝇的其他社会行为，总体上对于探究经验相关的基本行为过程变化具有重要意义。

引言

在动物系统中，攻击行为与获取和占有资源（如食物、领地和配偶）密切相关。鉴于攻击行为对个体适应性的重要作用，其在动物界中的广泛演化并不令人意外。作为一种直接使个体受益的适应性性状，攻击行为与较强的学习和记忆成分相关。 在争夺社会等级的过程中，先前的打斗经历会影响后续竞争的结果。通常情况下，此前失败的经历会增加而胜利的经历会降低在后续竞争中失败的概率（分别称为"失败者"效应和"胜利者"效应）。"失败者"效应已在多种物种中被观察到，一些研究表明，这种效应可持续数天，而"胜利者"效应通常持续时间较短2,10,11。

关于果蝇（D. ampelophila）攻击行为的首次报道由Sturtevant于1915年发表，该研究主要关注性别识别与性别选择12。半个世纪后，研究人员对雄性果蝇的攻击行为进行了更为全面的观察，描述了果蝇打斗过程中大多数可观察到的行为模式。这些实验主要在由少量雄性和雌性果蝇组成的小群体中进行，持续观察数小时13-15。近年来，随着强大遗传工具的应用，以及成对同性别打斗实验设计和较短观察时间的引入，D. melanogaster 已成为研究攻击行为生物学机制的重要模型系统1,16。对同性别雄性和雌性果蝇之间打斗的分析表明，攻击行为包含一系列刻板的行为模式，这些模式以统计学上可靠的方式依次转换1,17。其中一些行为模式具有性别特异性，而另一些则在两种性别的打斗中均可观察到。雄性果蝇的打斗强度高于雌性，且会形成明确的支配关系，产生清晰的"胜者"和"败者"。目前，许多实验室已开始探索攻击行为的生化18、神经7,19-21和遗传基础22。然而，由于不同实验室采用多种多样的实验方法，要通过元分析来深入理解打斗动态以及支配关系的形成与维持仍存在困难。文献中描述的技术几乎都涉及对果蝇的操作，例如将其引入实验区域19,23,24，或在行为实验过程中将其移出实验区域3,4。轻柔抽吸是最常用的果蝇操作方式3,4,23-25，但也有使用低温或CO2麻醉的情况9,26，尽管已有研究表明这些处理会对果蝇行为产生不利影响27,28。建议在使用任何麻醉剂后至少恢复24小时，以尽量减少其对行为的影响29,30。

果蝇能够从先前的打斗经验中学习，并在新情境中调整其行为模式的使用，表明学习与记忆伴随且源于争斗性遭遇。从这一意义上说，果蝇的打斗类似于操作性条件反射学习情境，果蝇在此过程中学会某种策略的有效性，并在后续遭遇中越来越频繁地采用该策略。在打斗过程中确立支配关系后，果蝇会改变其打斗策略：胜利者冲锋攻击的频率逐渐增加，而失败者则逐渐减少。经过一段隔离期后，先前的失败者表现出更显著的顺从行为，极有可能再次失败。nd 与幼稚型果蝇或先前的获胜者配对时发生争斗 3,4然而，由于缺乏一种无需接触果蝇的实验方法，使得对 "失败者" 影响难以评估。在最近的一项研究中，我们比较了实验室中常用的两种实验操作方法（吸移法和冷麻醉法）与一种无需直接操作的新方法，用于将果蝇引入行为观察室。结果表明，冷麻醉对攻击行为的负面影响远大于吸移法，但即使采用吸移法也会降低果蝇的攻击水平。然而，吸移法对伴随攻击行为的学习与记忆能力产生了高度显著的影响。在采用相同实验流程的情况下，分别使用吸移法和无操作处理两种方法，观察到显著的 "失败者" 只有在实验操作中排除果蝇的机械处理时，该效应才被观察到 5,6.

理想情况下，对 果蝇 实验室中的攻击行为研究应包含果蝇在自然环境中通常会遇到的环境因素（如资源竞争、需要保卫的领地以及可供逃避的空间）。此外，实验条件应优化，以可靠地诱发、观察和解读所研究的行为（尽量减少动物操作，限制使用CO₂）2 作为麻醉剂，并标准化实验流程）。为了尽可能解决上述大部分或全部问题，我们设计了一种新的行为实验装置，该装置在将果蝇引入行为实验区域之前、期间和之后均无需人工接触操作。利用该装置，果蝇可通过其固有的负向趋地性被自动转移至飞行室中或从中移出。通过避免对果蝇进行人工操作，本实验方案旨在：（a）降低个体间的行为变异性；（b）缩短果蝇相互作用并建立明确支配关系所需的时间（雄性）；（c）稳定诱导出足够显著的行为变化，以促进 "失败者" 效应。

本方案描述了一种新型实验装置以及逐步操作流程，用于分析攻击行为并促进强烈社会关系的形成 "失败者" 效应在 D. melanogaster 我们预计，这种行为实验装置可轻松改造，用于研究果蝇表现出的其他社会行为。

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方案

注意：以下是用于在雄性果蝇（D. melanogaster）之间可靠诱发攻击行为的实验方案的逐步说明。该程序可诱导产生“失败者”效应。最近也有研究报道，使用此方案可观察到短期的“胜利者”效应5,6。图1展示了行为实验的时间线。

社会隔离实验流程图；阶段包括蛹期隔离和果蝇行为分析。

图1. 攻击行为实验时间线。第1天，将晚期雄性蛹（翅膀变黑时）分离至新制备的隔离小瓶中。成虫羽化后的第5天，用CO2麻醉4日龄的雄性果蝇，并用不同颜色标记以用于个体识别。第7天，准备食物杯和争斗室以开展行为学实验。将两只6-7日龄的成年雄性果蝇放入争斗室中，使其能够相互接触。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 第1天：蛹的社交隔离

  1. 在环境可控的12小时光照/12小时黑暗循环培养箱中，于25 °C和50%相对湿度条件下饲养并维持果蝇品系。
  2. 准备隔离管：将新鲜果蝇培养基加热至融化，用巴氏吸管吸取约1.5 ml融化的培养基，注入单个空玻璃试管（1.6 x 10 cm）中，静置使培养基凝固。
  3. 分离蛹：用细毛刷轻轻从品系培养管中取出一只晚期雄性蛹（翅膀变黑时），将其放置于新制备的含培养基试管内壁上。用棉塞封口（图2）。
  4. 将含有蛹的隔离管置于25 °C、50%相对湿度的12小时光照/12小时黑暗循环培养箱中。

果蝇蛹发育；标有晚期蛹和果蝇食物的试管；生物学研究。

图2. 社会隔离。将一只晚期雄性蛹侧放于新制备的隔离小瓶中。含有蛹的隔离小瓶置于25 °C、50%相对湿度、12小时光照/12小时黑暗的培养箱中。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 第5天：对果蝇进行标记以实现个体识别

  1. 在第5天进行此步骤，使用4日龄的雄性果蝇，并在行为学实验前两天完成，以尽量减少CO2麻醉带来的不利影响。
  2. 用CO2麻醉果蝇。
  3. 使用细小的挑针，在果蝇胸部涂上一小点丙烯酸颜料。避免将颜料涂在头部、翅膀、腹部或腿部（图3）。
  4. 让颜料干燥约10秒，然后轻柔地将果蝇转移回原来的隔离小瓶中。
  5. 将隔离小瓶放回25 °C、50%相对湿度、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中。

果蝇遗传学研究，表型比较，实验结果，遗传标记果蝇。

图3. 个体识别。 用CO2麻醉果蝇后，在其胸部涂抹一小滴丙烯酸颜料。为了实现个体识别，使用不同颜色（此处为白色和蓝色）。有关此步骤中使用CO2的讨论，请参见下文。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 第7天：准备实验装置

  1. 准备食物杯：
    1. 加热新鲜果蝇食物直至融化。
    2. 使用巴斯德吸管，将约 0.8 ml 食物转移至螺旋盖小瓶的瓶盖中（直径 1.5 cm，高 1 cm），静置冷却。避免产生气泡。
    3. 将干酵母与几滴水混合，制备新鲜酵母糊。待其变稠后，用牙签取少量酵母糊滴加至食物杯表面中央（图 4）。

研究小瓶中果蝇培养基上的酵母；果蝇培养研究的实验装置。

图4. 准备食物杯。 使用新鲜的果蝇食物准备一个食物杯。待食物凝固后，在食物杯表面的中央放置一小滴酵母糊。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 准备单独的争斗室：
    1. 每次使用前，用清水彻底清洗装置和每个单独的争斗室，并用纸巾擦干后使用。
    2. 在每个争斗室中央放置一个食物杯，并用一滴橡皮泥固定。
    3. 用装置盖子盖住争斗室（图5）。
    4. 将装置置于高湿度环境（60%）中，温度保持在25 °C。
    5. 在装置上方放置光源以照亮争斗室，并从上方架设视频摄像机进行录制。

用于化学分析的微流控装置示意图，包含三个反应室。

图5. 准备单个打斗室。 将表面带有酵母糊小点的新鲜培养基杯固定到已清洗的单个打斗室中。使用两件式盖子封闭打斗室，盖子允许插入不透明塑料隔板进入各个打斗室。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 第7天：行为学实验

  1. 使用6至7日龄的雄性果蝇进行行为学实验。
  2. 将塑料隔板插入每个打斗室中。
  3. 从隔离管中取出棉塞，并将该管置于装置侧面一个打开的孔下方。
  4. 利用负向趋地性使果蝇进入打斗室，通常在数秒内完成。
  5. 当果蝇离开隔离管并进入打斗室后，关闭滑动壁。
  6. 重复上述步骤，将第二只果蝇引入装置另一侧的打斗室中。
  7. 将装置放回光照下的录像位置。
  8. 开始录像，并移除塑料隔板以允许果蝇相互接触。
    1. 进行攻击性实验时：
      1. 在这些实验中，至少记录20分钟的打斗过程，以确保形成稳定的支配关系。
      2. 达到所需时间后，停止录像。
      3. 通过逆转上述步骤将果蝇从打斗室中移出。
      4. 每次使用后，须用温和的洗涤剂和水彻底清洗行为学装置，并进行冲洗。
    2. 进行“失败者”效应实验时：
      注意：在这些实验中，首次打斗被视为条件建立阶段，第二次打斗为测试阶段。两次打斗之间的休息时间可以不同，但10分钟的间隔有助于形成显著的“失败者”效应。
      1. 按照上述步骤进行第一次打斗。
      2. 关键步骤：为诱导“失败者”心理状态的形成，应确保第一次打斗持续至少20分钟，以建立明确的支配关系。20分钟后，重新插入塑料隔板将果蝇分隔开。
      3. 经过10分钟的休息期后，轻轻移除塑料隔板，使果蝇开始第二次打斗。
      4. 第二次20分钟打斗结束后，停止录像。
      5. 按上述方法将果蝇从行为学装置中移出。
      6. 再次彻底清洁行为学装置。

5. 行为学分析

  1. 转移电影文件
    1. 将相机连接到计算机。
    2. 使用视频转换软件将果蝇的 .MTS 文件转换为 .mov 格式，并通过“合并选定剪辑”选项将视频片段拼接在一起。
    3. 使用视频读取软件观察并分析每部影片。
  2. 行为评分
    注意：此步骤可手动完成，也可在有条件时使用行为分析程序软件进行。下图描述了“失败者效应”的一种可能的手动分析方法。
    1. 记录果蝇在食物杯中首次相遇的时间（相遇指一对果蝇之间持续至少2秒的互动），以及首次出现扑击行为的时间（扑击是一种行为模式，其中一只果蝇以后肢高高竖起，迅速向下扑击并试图抓住对手）。随后，计算扑击潜伏期（即从首次相遇到首次扑击之间的时间间隔）。
    2. 统计打斗过程中相遇的总次数和冲撞的次数。
      注意：如有需要，也可对其他行为模式进行评分，例如展翅威胁、击打、格斗、退却，或首次扑击前的相遇次数等。
    3. 记录优势地位确立的时间（从首次相遇开始，到其中一只果蝇在受到冲击后连续三次从食物杯上退却为止的时间）。注明争斗中的获胜果蝇与失败果蝇。
  3. 计算“失败者效应”
    1. 将先前失败者再次落败的打斗次数除以2nd 将失败者输掉的战斗次数（LL）除以战斗总次数，再乘以100。所得百分比代表“失败者”效应：
      [(发生打斗的果蝇对数) / (打斗总次数)] × 100
    2. 使用卡方检验比较“失败者效应”与50%的期望值是否存在统计学差异。

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结果

本部分介绍了行为实验箱的设计，以及根据上述方案测量攻击行为和“失败者”效应形成的一组典型行为实验的分析方法。同时展示了利用该装置可测量的其他行为的示例。

图6展示了新装置的示意图。该装置由三个圆柱形孔洞（尺寸：直径22.86 mm，高17 mm）组成，作为打斗区域。两片式盖子封闭装置顶部的打斗区域，并允许插入一片薄的不透明塑料隔板，将每个孔洞均分为两个相等的部分。装置两侧设有带三个孔洞（直径15.88 mm）的滑动侧壁，可通过负向趋地性，直接从果蝇的隔离小瓶将其装入打斗区域。果蝇进入打斗区域后，滑动侧壁用于封闭所有孔洞的侧面。此时，两只果蝇虽处于同一打斗区域内，但因隔板的存在而无法相互接触。移除隔板后，果蝇即可自由互动，随后的行为模式便可被观察和记录。

攻击性实验：共进行了38次野生型CS雄性果蝇配对打斗实验。在果蝇处于食物杯期间记录不同的行为参数，并分析打斗行为的动态过程（表1）。在20分钟的时间段内，平均每只果蝇经历了24次相遇（果蝇之间的短暂会面）和54...

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讨论

利用具有强大遗传学方法的Drosophila作为攻击行为研究的模式生物的现代研究时代，大约始于十二年前，当时引入了新型实验装置，可在单对果蝇中稳定地诱导出打斗行为1,7,8,17,19。这些装置包含果蝇所需资源（如食物杯、潜在配偶）以及供失败个体退避的空间。当这些装置所得结果与此前关于果蝇争斗行为的知识相结合后，Drosophila melanogaster被牢固确立为研究攻击等复杂行为的理想模型系统，并被众多实验室广泛采用。综合研究结果表明：（a）果蝇在争夺食物资源、交配权或领地防御时表现出攻击行为14,15；（b）打斗行为由一系列顺序固定的刻板行为模式组成1；（c）雄性和雌性果蝇均可在同性配对中发生争斗（某些行为模式为雄性特有，某些为雌性特有，另有部分为两性共有）17；（d）仅雄性间的打斗可达到高强度水平，并形成具有明确“胜者”与“败者”的等级关系17；（e）性别决定通路中的单个基因fruitless决定了果蝇以雄性或雌性方式发生争斗16；（f）多种...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国普通医学科学研究所（GM099883 和 GM074675）向 E.A.K. 提供的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。我们感谢哈佛医学院机械加工车间的工作人员对行为实验装置的设计所做出的贡献（联系方式：http://mikesmachine.com）。

作者贡献：S.T.、B.C. 设计了行为实验装置。S.T. 设计并优化了实验方案。S.T. 和 B.C. 实施并分析了实验。S.T.、E.A.K. 和 B.C. 撰写了论文。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黑腹果蝇蛹布卢明顿果蝇资源中心
标准果蝇培养基实验室自制。 
行为实验装置Mike 机器公司实验室自制。请直接 联系该公司获取更多信息。
硼硅酸盐玻璃小瓶VWR International 47729-57616 × 10 mm
棉絮Fisherbrand22-456-881任何品牌均可使用
巴斯德吸管VWR International 53300-567
画笔 Blick 美术材料公司06157-7030圆形，3/0 号
牙签不适用不适用任何品牌均可使用
丙烯颜料（蓝色/白色）Blick 美术材料公司01637-5172/01637-1022任何品牌均可使用
干型活性酵母SigmaYSC2-500G
螺口管VWR International 10011-394 直径 15 mm，高 10 mm
微量离心管（Eppendorf）VWR International 22363212
胶带不适用不适用任何品牌均可使用
塑料切片电子显微镜科学公司70329-4022 × 40 × 0.25 mm 厚度
光源（灯泡）VWR International 500003-418任何品牌均可使用
计时器VWR International 62344-641任何品牌均可使用
培养箱Percival请直接联系制造商获取更多信息。
干燥二氧化碳（CO2）Medical-Technical Gases, Inc14H31
双目解剖镜尼康SMZ-745任何品牌均可使用
摄像机（SONY Handycam  HDR-CX330）B&HSOHDRCX330B任何品牌均可使用
计算机至少配备 1.4 GHz 处理器，运行 Microsoft Windows 或 Macintosh HD 操作系统
ClipWrap在线下载任何导入软件均可使用
QuickTime 播放器在线下载任何播放软件均可使用
GraphPad 软件在线任何统计分析软件均可使用

参考文献

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