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方法文章

通过比率荧光显微镜测量吞噬体pH值

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DOI：

10.3791/53402

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2015年12月7日

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

本文内容

摘要

吞噬体的pH值影响吞噬体成熟、活性氧产生、吞噬体杀菌作用以及抗原提呈。本文介绍一种利用荧光显微镜检测活体吞噬细胞中单个吞噬体内pH值随时间变化及终点pH值的比率法。

摘要

吞噬作用是一种基本过程，先天免疫细胞通过该过程吞噬细菌、凋亡细胞或其他外来颗粒，以杀灭或中和摄入的物质，或将其作为抗原呈递并启动适应性免疫应答。吞噬体的pH值是调控其与内膜系统发生分裂或融合以及蛋白水解酶激活的关键参数，这些事件使吞噬空泡得以成熟为具有降解功能的细胞器。此外，H⁺的易位+ 对于产生活性氧（ROS）的高水平至关重要，而活性氧是有效杀灭病原体并向其他宿主组织传递信号所必需的。许多胞内病原体通过抑制吞噬体的酸化来逃避吞噬杀伤，凸显了pH在吞噬体生物学中的重要性。本文介绍一种利用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的酵母聚糖作为吞噬靶标并结合活细胞成像技术，对中性粒细胞中吞噬体pH进行比率测定的方法。该检测方法基于FITC的荧光特性：在490 nm激发时，其荧光信号在酸性pH条件下被淬灭，而在440 nm激发时则不受影响，从而可通过单一染料的pH依赖性比率而非绝对荧光强度进行定量分析。本文提供了详细的实验操作流程 原位 还提供了染料校准以及比值转换为实际pH值的方法。单染料比率法通常被认为优于单波长或双染料伪比率法，因为前者对漂白、焦距变化、激光波动和标记不均等干扰因素的敏感性较低，这些因素会扭曲测量信号。该方法可轻松修改以用于测量其他吞噬细胞类型的pH值，且可用任何含胺颗粒（从惰性微珠到活的微生物）替代酵母聚糖。最后，该方法还可调整以利用对不同pH范围或其他吞噬体活性敏感的其他荧光探针，使其成为吞噬体功能成像的通用方案。

引言

吞噬作用是先天免疫细胞吞噬大颗粒的过程，起源于单细胞生物的摄食机制，包括与靶标结合、以膜包裹靶标，并通过膜掐断形成位于细胞质内的液泡，称为吞噬体。尽管吞噬体膜来源于质膜，但在吞噬体形成过程中，通过活跃的蛋白质和脂质分选以及与内膜系统的融合，使吞噬体转变为细胞内具有降解特性的独特细胞器，能够杀灭、中和并分解所摄入的物质1-3。这一过程被称为吞噬体成熟，依赖于多种蛋白水解酶和杀菌酶的递送，其中包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，该酶可将电子转入吞噬体，产生强氧化剂超氧阴离子（O2-）及其衍生的活性氧（ROS）2,4。

吞噬体腔内pH值对其功能所需多个事件具有深远影响。首先，pH值普遍影响内膜系统的膜 trafficking 过程，因为跨膜 trafficking 调控因子会发生依赖于pH的构象改变，从而影响 Arfs、Rabs 和囊泡包被蛋白等 trafficking 决定因子的募集，进而决定哪些囊泡可与吞噬体融合。 5-8其次，随着吞噬体的成熟，其腔内的离子组成也会发生变化，一些离子转运蛋白（如 Na+/+ 交换体或 ClC 家族 Cl-/+ 反向转运蛋白，可促进吞噬功能，依赖于 H+ 易位 9,10同样，活性氧（ROS）的产生与吞噬体的pH值密切相关。长期以来，ROS及其有毒的氧化副产物被认为在中性粒细胞吞噬体杀伤过程中起着关键作用。 4,11,12，并已被证明在其他吞噬细胞中发挥关键作用，包括巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和变形虫 13-16NADPH 氧化酶是一种产电酶，可释放 H+ 在胞质溶胶中，随着NADPH被消耗，需要同时转移H+ 通过伴随的HVCN1通道与转运的电子一同进入吞噬体腔，以缓解大量去极化，否则会导致该酶的自我抑制 17-21最后，多种蛋白水解酶在不同pH条件下具有最佳活性，因此吞噬体pH值的时相性变化可影响哪些酶处于活性状态及其作用时机。吞噬体pH的重要性体现在某些生物体中，例如 结核分枝杆菌，土拉弗朗西斯菌 和 沙门氏菌 typhimurium 通过改变吞噬体pH值至少部分地破坏吞噬杀伤作用 22-24.

在哺乳动物中，主要的吞噬细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞，根据细胞类型的不同，吞噬体的pH值随时间发生的变化差异较大，并发挥不同的作用。在巨噬细胞中，由ATP依赖性质子泵——液泡型ATP酶（V-ATPase）介导的强烈而快速的酸化是介导杀伤作用的关键因素之一25-27，类似于阿米巴原虫利用吞噬作用作为摄食机制时所存在的过程28。在这些细胞中，酸性蛋白酶的激活被认为起着关键作用。相比之下，中性粒细胞的杀伤作用更依赖于活性氧（ROS）以及髓过氧化物酶（MPO）产生的次氯酸（HOCl）11，其pH在最初30分钟内保持中性或偏碱性，仅在后期才发生酸化29,30。有研究认为中性pH有利于某些组织蛋白酶等氧化性蛋白酶的活性。在树突状细胞（DCs）中，吞噬体pH值尚存争议，一些研究报道其发生酸化，而另一些则报告为中性或碱性pH31,32，但活性氧和pH值可能显著影响这些细胞向T细胞呈递抗原的能力，而抗原呈递正是其主要功能之一33。

重要的是，激素、趋化因子和细胞因子可能引发信号事件，诱导吞噬细胞成熟并改变其行为，进而影响吞噬体的 pH 值34,35。类似地，某些药物（例如抗疟药氯喹，该药也正在被考虑用于抗癌治疗36）可能影响吞噬体的 pH 值，从而影响免疫应答结果。因此，各类从事细胞生物学、免疫学、微生物学和药物研发的研究人员在探究特定基因扰动、生物活性化合物或微生物对先天性和适应性免疫应答作用机制时，可能均有兴趣测量吞噬体的 pH 值。

本文介绍了一种用于测量中性粒细胞吞噬体pH值的方法，该方法使我们能够揭示HVCN1通道在调控中性粒细胞吞噬体pH值中的重要作用19。该方法基于异硫氰酸荧光素（FITC）的比率荧光特性：当在490 nm波长激发时，其在535 nm处的荧光发射强度受pH影响，而在440 nm激发时则不受pH影响37。将该染料化学偶联至靶标（本实验中为酵母聚糖）后，可通过宽场荧光显微镜进行追踪，实时观察细胞吞噬过程以及吞噬体成熟过程中吞噬体pH值的动态变化。随后通过校准实验确定实际pH值：将已完成吞噬的细胞暴露于含离子载体尼日霉素（nigericin）和莫能菌素（monensin）的不同pH缓冲液中，使吞噬体内部pH与外部溶液迅速达到平衡。将测得的荧光比值与已知pH值进行比较，通过非线性回归拟合生成标准曲线，并利用所得方程由荧光比值计算出相应的pH值。

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方案

伦理声明： 所有动物操作均严格遵循日内瓦大学动物研究委员会的指南进行。

1. 吞噬靶标的制备

  1. 将20 mg干燥的酵母聚糖加入10 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。涡旋混匀，并在沸水浴中加热10分钟。冷却后，在2,000 × g条件下离心5分钟。
  2. 弃去上清液，用1 ml PBS重悬，并在水浴超声仪中超声处理10分钟。将500 µl转移至两个1.5 ml离心管中，在11,000 × g条件下离心5分钟。
  3. 用500 µl PBS重复洗涤一次。煮沸处理后的酵母聚糖可分装后于-20 °C冷冻保存。
  4. 用500 µl新配制的0.1 M Na2CO3（pH 9.3）按上述方法（步骤1.2）洗涤酵母聚糖两次。
  5. 最后一次洗涤后，用490 µl PBS重悬。加入10 µl溶于二甲基亚砜（DMSO）的10 mg/ml FITC溶液，涡旋混匀，用铝箔包裹，在室温下振荡孵育4小时。
  6. 为去除未结合的染料，按上述方法（步骤1.2）依次用以下溶液洗涤：0.5 ml DMSO + 150 µl PBS，然后0.5 ml DMSO + 300 µl PBS，接着0.5 ml DMSO + 450 µl PBS，最后仅用PBS洗涤。
  7. 使用血细胞计数板对酵母聚糖进行计数。取1 µl酵母聚糖加入500 µl PBS中，涡旋混匀，然后取10 µl加至血细胞计数板腔室边缘，使其在盖玻片与中央网格接触处渗入。将血细胞计数板置于配备20倍物镜的明场显微镜下观察。
  8. 聚焦于包含16个小方格的左上角区域，使用手动计数器统计该区域内的所有酵母聚糖颗粒。同样重复计数右下角区域。根据以下公式计算酵母聚糖浓度：酵母聚糖浓度 = 计数值/2 × 500 × 104 颗粒/ml。标记后的酵母聚糖可分装后于-20 °C冷冻保存。
  9. 用1:100稀释的兔抗酵母聚糖抗体对标记的酵母聚糖进行调理处理。涡旋混匀后，在37 °C水浴中孵育1小时。按上述方法（步骤1.2）用500 µl PBS洗涤。
    注意：强烈建议进行超声处理，尤其是在调理后，因为酵母聚糖容易形成团块，可能增加后续分析难度。也可选用65% v/v的大鼠或人血清进行调理作为替代方案。
  10. 按照步骤1.7–1.8所述方法使用血细胞计数板对酵母聚糖进行计数，并稀释至100 × 106 颗粒/ml。也可选择其他吞噬刺激物进行调理，如补体调理，或不进行调理处理。

2. 活细胞视频显微镜观察

  1. 按照 elsewhere38 中详细描述的方法分离小鼠原代中性粒细胞。
    1. 或者，可使用任何类型的吞噬细胞。将中性粒细胞置于冰上保存于补充有5%胎牛血清（v/v）、200 U青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，细胞浓度为10 × 106 个细胞/ml，直至使用。其他细胞类型可在实验前1–4天接种。
  2. 将2 × 105（20 µl）中性粒细胞加至35 mm玻璃底培养皿中央，再加入50 µl培养基使液滴铺展，于37 °C孵育5分钟，使细胞贴附。
  3. 向培养皿中加入1 ml预热至37 °C的Hank’s平衡盐溶液（HBSS），其中含特异性髓过氧化物酶（MPO）抑制剂4-氨基苯甲酰肼（4-ABH，10 µM）。也可使用非特异性MPO抑制剂如叠氮化钠（5 mM），但最近有研究提示其可能对pH产生额外的非特异性影响39。
  4. 将培养皿置于配备37 °C加热系统和40倍油镜的宽场荧光显微镜上。在不进行成像的情况下孵育细胞10分钟，使细胞与设备达到平衡。
  5. 调整显微镜设置，以440 nm或490 nm激发光、535 nm发射光，每30秒获取一次明场透射图像［若有条件，可使用相差或微分干涉差（DIC）成像］。
  6. 根据显微镜系统和实验需求调整曝光时间和采集频率，以避免过度光漂白和光毒性。开始图像采集。
  7. 2分钟后，向培养皿中央加入10 × 106（50 µl）经调理的FITC-酵母聚糖颗粒。根据所用吞噬细胞和靶标的类型调整靶细胞比例。
  8. 继续成像30分钟。30分钟后停止时间序列采集，并启动计时器。移动载物台，在5分钟内于不同视野采集10个或更多静态图像，以观察其他吞噬体。

3. 校准与对照实验

  1. 在实验前一天配制pH校准溶液（配方见表1），分装为10 ml等份并冷冻保存。实验前将校准溶液解冻，并在水浴中加热至37 °C。使用pH计检测溶液pH值，并记录各溶液的实际pH值。
  2. 在图像采集前，将蠕动泵安装至玻璃底培养皿上，并按照上述方法（第2节）进行活细胞视频显微镜观察。
  3. 在30分钟采集期结束后，启动蠕动泵以去除培养皿中的溶液，加入1 ml第一种校准溶液，然后停止泵运行。
  4. 等待信号稳定，通常需要5分钟。依次对每种校准溶液重复该步骤。
    1. 每个实验日至少进行一次校准，校准顺序应先从最高pH值开始依次向最低pH值进行，再从最低pH值开始依次向最高pH值进行。
  5. 作为对照，在玻璃底培养皿中向900 µl HBSS中的细胞加入100 µl用HBSS稀释的100 µM NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘丙烯酸（DPI），孵育10分钟。
  6. 开始采集，并按上述方法（步骤2.7）加入酵母聚糖。吞噬作用进行15分钟后，加入10 µl用HBSS稀释的10 µM V-ATP酶抑制剂康博霉素A（ConcA），继续成像15分钟。

4. 分析

  1. 时间序列影片与吞噬体快照的分析。
    注意：以下说明专用于 ImageJ 软件。具体操作步骤可能因所用软件不同而有较大差异，但本节所述功能在大多数专业图像分析软件中均可实现。
    1. 使用专业图像分析软件打开图像。在 490 通道中，使用矩形多边形选择工具在无细胞区域绘制一个小方块 ROI，然后点击 Plugins> BG Subtraction from ROI，进行背景扣除。随后，通过点击 Edit> Selection> Restore Selection，将同一 ROI 应用于 440 通道，并重复背景扣除操作。
    2. 通过点击 Process> Image Calculator…，创建一个 490 通道除以 440 通道的 32 位比值图像：在 Image1 和 Image2 下拉菜单中选择相应图像，于 Operation 下拉菜单中选择“Divide”，并勾选 32-bit (float) result 复选框。
    3. 通过点击 Image> Lookup Tables> Rainbow RGB，将颜色编码查找表更改为适用于比值的颜色编码。通过点击 Image> Adjust> Threshold…，对比值图像进行阈值设定，以消除 0 和无穷大的像素。调节滑块使酵母聚糖呈现红色，点击 Apply，并确保勾选“Set background pixels to NaN”复选框。
    4. 通过点击 Image> Color> Merge Channels，将该比值图像栈与明场通道合并为一个多通道复合图像：在灰度通道下拉菜单中选择明场图像，在绿色通道下拉菜单中选择比值图像，并勾选 Keep source images 复选框。浏览时间序列影片或快照，确定需分析的吞噬体。明场通道对此过程非常有用。
    5. 使用椭圆多边形选择工具在吞噬体周围绘制感兴趣区域（ROI），并通过点击 Analyze> Tools > ROI Manager> Add，将其添加至 ROI 管理器。通过点击 More> Multi-Measure 并取消勾选 One row per slice 复选框，测量其酵母聚糖强度比值。
    6. 对于时间序列影片，逐个追踪吞噬体：绘制 ROI，按 Ctrl+M 测量每个时间点，必要时移动 ROI 以追踪随时间变化的强度值。将“结果”窗口中的测量数据复制到电子表格软件中。
      注意：分析 15 个独立实验（每个实验 5 个时间过程 × 3 次重复）较为理想，但具体数量需根据观察到的变异性决定。始终建议保存 ROI。部分软件包支持图像配准及 ROI 的动态更新，有助于简化该部分分析。
  2. 荧光信号向 pH 值的转换
    1. 按照第 4.1 节所述方法，测量校准用时间序列影片中吞噬体的 490/440 比值。
    2. 在电子表格中绘制比值随时间变化的曲线，并从每个 pH 校准溶液对应时间段的中间部分选取 5 个时间点，计算视野内所有吞噬体（通常为 5–20 个）的平均比值。（参见图 5A中的红色框。）
    3. 将这些平均 490/440 比值对实际测得的 pH 值作图。将至少 3 次独立校准结果合并至同一图表中。使用统计或数值分析软件进行非线性回归（最佳拟合曲线），通常采用 S 形方程拟合。
      注意：例如，在图 5B中使用的方程为 Boltzmann S 形方程 [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/(1+EXP((V50-X)/Slope))]，其中 Y 值为 490/440 比值，X 值为 pH 值，Top、Bottom、V50 和斜率参数由软件计算得出。
    4. 利用所得方程将比值转换为 pH 值。
      注意：例如，在叠氮化钠存在条件下，图 5B中校准曲线所得方程为：490/440 比值 = 1.103 + [(2.89 - 1.103)/(1 + EXP((6.993 - pH)/0.9291))]。解出 pH 可得以下方程：pH = 6.993 - 0.9291 × [LN((1.178/(比值 - 1.103)) - 1)]。

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结果

以下是一项实验的代表性结果，该实验比较了从野生型或Hvcn1-/-小鼠骨髓中分离得到的原代小鼠中性粒细胞的吞噬体pH值。为确保实验成功，关键是在整个延时成像过程中，视野内需有足够数量的吞噬体，同时应避免吞噬体过多，否则在后续图像分析中难以进行准确分割。图1展示了吞噬体密度适宜与过密的示例。在进行时间依赖性分析和快照分析时，必须区分细胞外的酵母聚糖颗粒与吞噬体，并将前者排除在分析之外。图2说明了如何利用明场图像辅助区分细胞外酵母聚糖颗粒与吞噬体。图3展示了野生型与Hvcn1-/-中性粒细胞中典型的吞噬体pH随时间变化曲线、平均pH值以及吞噬体pH群体的直方图。这些结果揭示了一种情况：尽管平均群体pH值未发生变化，但pH分布存在显著差异。良好的对照实验始终至关重要。图4展示了添加NADPH氧化酶抑制剂DPI后的效应，表现为快速酸化，随后加入V-ATPase抑制剂ConcA，可逆转该酸化过程。此...

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讨论

尽管与光谱法和流式细胞术等替代方法相比，显微镜技术耗时更长——后者采用类似的策略，即使用对pH敏感的染料标记靶标，并测量吞噬体群体的平均pH值——但显微镜技术仍具有多项优势。首先，无需添加其他化学物质（如台盼蓝或抗体）来淬灭或标记细胞外结合的颗粒，即可轻松区分已内化和仅在细胞外结合但未被内化的颗粒。其次，通过实时观察细胞，研究人员可同时监测吞噬过程的多个方面，因此迁移、感知及颗粒结合等方面的影响更容易被识别，而这些信息在基于群体的方法中可能被忽略。此外，无需通过将细胞置于4 °C来同步吞噬作用的起始（该操作可能因冷休克干扰其他囊泡运输事件40,41），因为时间零点可直接确定。事实上，在进行活细胞显微成像时，若需捕捉吞噬起始阶段附近的动态过程，则不建议使用4 °C同步技术，因为在温度转换过程中，培养皿底部形成的冷凝水可能与物镜浸油混合，且培养皿升温与显微镜组件之间的温度差异可能导致焦距偏移。第三个优势在于，吞噬体在多个参数上本质上具有异质性，包括但不限于pH值42，某些对吞噬体pH的影响可能较为细微，表现为改变吞噬体pH的分布模式而非群体平均值，正如图3所示。此...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者的研究工作得到了瑞士国家科学基金会运营资助项目 N° 31003A-149566（资助对象：N.D.）以及The Sir Jules Thorn慈善海外信托青年研究者补贴（资助对象：P.N.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Zymosan A 粉末Sigma-AldrichZ4250存在多种供应商
异硫氰酸荧光素Sigma-AldrichF7250存在多种供应商
抗酵母聚糖抗体（酵母聚糖A生物颗粒调理试剂）Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 为等效产品。也可使用 25% 血清作为调理试剂。
4-氨基苯甲酰肼（4-ABH）Santa Cruzsc-204107有毒，需戴手套，有多种供应商
二苯基碘鎓氯化物（DPI）Sigma-AldrichD2926有毒，需戴手套，有多种供应商
Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689有毒，需戴手套，有多种供应商
尼日尔菌素Sigma-AldrichN7143有毒，需戴手套，有多种供应商
莫能菌素EnzoALX-380-026-G001有毒，使用手套，有多种供应商
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies14200-075有毒，需戴手套，有多种供应商
Hank's 平衡盐溶液Life Technologies14025092可使用林格氏平衡盐溶液或其他透明生理缓冲液替代。
碳酸钠（Na2CO3)Sigma-AldrichS7795存在多种供应商
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）Sigma-AldrichM3671 存在多种供应商
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）Sigma-AldrichH3375存在多种供应商
N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）Sigma-AldrichM2004 存在多种供应商
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）Sigma-Aldrich3777存在多种供应商
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）Sigma-AldrichT1503 存在多种供应商
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9333存在多种供应商
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS7653存在多种供应商
氯化镁（MgCl2)Sigma-AldrichM8266存在多种供应商
无水乙醇（EtOH）Sigma-Aldrich2860存在多种供应商
35 mm 玻璃底培养皿（Fluorodish）World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ可使用适当的成像培养皿或盖玻片替代清晰的培养皿或盖玻片
超声波水浴O. Kleiner AG可以使用超声波破碎仪，不同仪器供应商均有提供
血细胞计数板Marienfeld GmbH存在多种仪器供应商
宽场活细胞成像显微镜卡尔·蔡司股份公司存在多种仪器供应商，但显微镜必须能够分别对440/535和490/535的激发/发射波长进行成像。可选用具备明场成像功能的转盘共聚焦系统，但酵母聚糖颗粒更容易失焦。  
蠕动泵（Dynamax RP-1）Rainin不同的仪器供应商
pH计Schott Gerate GmbH不同的仪器供应商
手动计数器Milian SA存在多种仪器供应商

参考文献

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FITC pH
通过比率荧光显微镜测量吞噬体pH值
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