通过比率荧光显微镜测量吞噬体pH值

摘要

吞噬体的pH值影响吞噬体成熟、活性氧产生、吞噬体杀菌作用以及抗原提呈。本文介绍一种利用荧光显微镜检测活体吞噬细胞中单个吞噬体内pH值随时间变化及终点pH值的比率法。

摘要

吞噬作用是一种基本过程，先天免疫细胞通过该过程吞噬细菌、凋亡细胞或其他外来颗粒，以杀灭或中和摄入的物质，或将其作为抗原呈递并启动适应性免疫应答。吞噬体的pH值是调控其与内膜系统发生分裂或融合以及蛋白水解酶激活的关键参数，这些事件使吞噬空泡得以成熟为具有降解功能的细胞器。此外，H⁺的易位⁺ 对于产生活性氧（ROS）的高水平至关重要，而活性氧是有效杀灭病原体并向其他宿主组织传递信号所必需的。许多胞内病原体通过抑制吞噬体的酸化来逃避吞噬杀伤，凸显了pH在吞噬体生物学中的重要性。本文介绍一种利用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的酵母聚糖作为吞噬靶标并结合活细胞成像技术，对中性粒细胞中吞噬体pH进行比率测定的方法。该检测方法基于FITC的荧光特性：在490 nm激发时，其荧光信号在酸性pH条件下被淬灭，而在440 nm激发时则不受影响，从而可通过单一染料的pH依赖性比率而非绝对荧光强度进行定量分析。本文提供了详细的实验操作流程 原位 还提供了染料校准以及比值转换为实际pH值的方法。单染料比率法通常被认为优于单波长或双染料伪比率法，因为前者对漂白、焦距变化、激光波动和标记不均等干扰因素的敏感性较低，这些因素会扭曲测量信号。该方法可轻松修改以用于测量其他吞噬细胞类型的pH值，且可用任何含胺颗粒（从惰性微珠到活的微生物）替代酵母聚糖。最后，该方法还可调整以利用对不同pH范围或其他吞噬体活性敏感的其他荧光探针，使其成为吞噬体功能成像的通用方案。

引言

吞噬作用是先天免疫细胞吞噬大颗粒的过程，起源于单细胞生物的摄食机制，包括与靶标结合、以膜包裹靶标，并通过膜掐断形成位于细胞质内的液泡，称为吞噬体。尽管吞噬体膜来源于质膜，但在吞噬体形成过程中，通过活跃的蛋白质和脂质分选以及与内膜系统的融合，使吞噬体转变为细胞内具有降解特性的独特细胞器，能够杀灭、中和并分解所摄入的物质^1-3。这一过程被称为吞噬体成熟，依赖于多种蛋白水解酶和杀菌酶的递送，其中包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，该酶可将电子转入吞噬体，产生强氧化剂超氧阴离子（O₂^-）及其衍生的活性氧（ROS）^2,4。

吞噬体腔内pH值对其功能所需多个事件具有深远影响。首先，pH值普遍影响内膜系统的膜 trafficking 过程，因为跨膜 trafficking 调控因子会发生依赖于pH的构象改变，从而影响 Arfs、Rabs 和囊泡包被蛋白等 trafficking 决定因子的募集，进而决定哪些囊泡可与吞噬体融合。 ^5-8其次，随着吞噬体的成熟，其腔内的离子组成也会发生变化，一些离子转运蛋白（如 Na⁺/⁺ 交换体或 ClC 家族 Cl^-/⁺ 反向转运蛋白，可促进吞噬功能，依赖于 H⁺ 易位 ^9,10同样，活性氧（ROS）的产....

方案

伦理声明： 所有动物操作均严格遵循日内瓦大学动物研究委员会的指南进行。

1. 吞噬靶标的制备

1. 将20 mg干燥的酵母聚糖加入10 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。涡旋混匀，并在沸水浴中加热10分钟。冷却后，在2,000 × g条件下离心5分钟。
2. 弃去上清液，用1 ml PBS重悬，并在水浴超声仪中超声处理10分钟。将500 µl转移至两个1.5 ml离心管中，在11,000 × g条件下离心5分钟。
3. 用500 µl PBS重复洗涤一次。煮沸处理后的酵母聚糖可分装后于-20 °C冷冻保存。
4. 用500 µl新配制的0.1 M Na₂CO₃（pH 9.3）按上述方法（步骤1.2）洗涤酵母聚糖两次。
5. 最后一次洗涤后，用490 µl PBS重悬。加入10 µl溶于二甲基亚砜（DMSO）的10 mg/ml FITC溶液，涡旋混匀，用铝箔包裹，在室温下振荡孵育4小时。
6. 为去除未结合的染料，按上述方法（步骤1.2）依次用以下溶液洗涤：0.5 ml DMSO + 150 µl PBS，然后0.5 ml DMSO + 300 µl PBS，接着0.5 ml DMSO + 450 µl PBS，最后仅用PBS洗涤。
7. 使用血细胞计数板对酵母聚糖进行计数。取1 µl酵母聚糖加入50....

结果

以下是针对从野生型或骨髓中分离的原代小鼠中性粒细胞的吞噬体 pH 值实验的代表性结果 Hvcn1^-/- 将小鼠进行了比较。要获得成功的实验，关键是在整个延时成像过程中，在视野内获取足够数量的吞噬体，同时避免吞噬体过多，否则在后续图像分析中将难以进行分割。 图1 展示了良好与不良汇合度的示例。对于时间依赖性分析和快照分析，必须区分细胞外的酵母聚糖颗粒与吞噬体，并将前者排除在分析之外。 图2 说明明场图像如何有助于区分外部的酵母聚糖颗粒与吞噬体。 图3 显示了野生型与突变型典型吞噬体pH随时间变化的过程示例 Hvcn1^-/- 中性粒细胞、平均pH值以及吞噬体pH群体的直方图。这些结果揭示了一种情况：群体平均pH值保持不变，而pH分布却存在显著差异。良好的对照始终至关重要。 图4 展示了添加NADPH氧化酶抑制剂DPI的效果，其导致迅速的酸化，随后加入V-ATP酶抑制剂Conc.......

讨论

尽管与光谱法和流式细胞术等替代方法相比，显微镜技术耗时更长——后者采用类似的策略，即使用对pH敏感的染料标记靶标，并测量吞噬体群体的平均pH值——但显微镜技术仍具有多项优势。首先，无需添加其他化学物质（如台盼蓝或抗体）来淬灭或标记细胞外结合的颗粒，即可轻松区分已内化和仅在细胞外结合但未被内化的颗粒。其次，通过实时观察细胞，研究人员可同时监测吞噬过程的多个方面，因此迁移、感知及颗粒结合等方面的影响更容易被识别，而这些信息在基于群体的方法中可能被忽略。此外，无需通过将细胞置于4 °C来同步吞噬作用的起始（该操作可能因冷休克干扰其他囊泡运输事件^40,41），因为时间零点可直接确定。事实上，在进行活细胞显微成像时，若需捕捉吞噬起始阶段附近的动态过程，则不建议使用4 °C同步技术，因为在温度转换过程中，培养皿底部形成的冷凝水可能与物镜浸油混合，且培养皿升温与显微镜组件之间的温度差异可能导致焦距偏移。第三个优势在于，吞噬体在多个参数上本质上具有异质性，包括但不限于pH值⁴²，某些对吞噬体pH的影响可能较为细微，表现为改变吞噬体pH的分布模式而非群体平均值，正如图3所示。此.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Zymosan A 粉末	Sigma-Aldrich	Z4250	存在多种供应商
异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich	F7250	存在多种供应商
抗酵母聚糖抗体（酵母聚糖A生物颗粒调理试剂）	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 为等效产品。也可使用 25% 血清作为调理试剂。
4-氨基苯甲酰肼（4-ABH）	Santa Cruz	sc-204107	有毒，需戴手套，有多种供应商
二苯基碘鎓氯化物（DPI）	Sigma-Aldrich	D2926	有毒，需戴手套，有多种供应商
Concanamycin A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	有毒，需戴手套，有多种供应商
尼日尔菌素	Sigma-Aldrich	N7143	有毒，需戴手套，有多种供应商
莫能菌素	Enzo	ALX-380-026-G001	有毒，使用手套，有多种供应商
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	14200-075	有毒，需戴手套，有多种供应商
Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14025092	可使用林格氏平衡盐溶液或其他透明生理缓冲液替代。
碳酸钠（Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	存在多种供应商
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	M3671	存在多种供应商
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）	Sigma-Aldrich	H3375	存在多种供应商
N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）	Sigma-Aldrich	M2004	存在多种供应商
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）	Sigma-Aldrich	3777	存在多种供应商
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）	Sigma-Aldrich	T1503	存在多种供应商
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9333	存在多种供应商
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S7653	存在多种供应商
氯化镁（MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	存在多种供应商
无水乙醇（EtOH）	Sigma-Aldrich	2860	存在多种供应商
35 mm 玻璃底培养皿（Fluorodish）	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi µ可使用适当的成像培养皿或盖玻片替代清晰的培养皿或盖玻片
超声波水浴	O. Kleiner AG		可以使用超声波破碎仪，不同仪器供应商均有提供
血细胞计数板	Marienfeld GmbH		存在多种仪器供应商
宽场活细胞成像显微镜	卡尔·蔡司股份公司		存在多种仪器供应商，但显微镜必须能够分别对440/535和490/535的激发/发射波长进行成像。可选用具备明场成像功能的转盘共聚焦系统，但酵母聚糖颗粒更容易失焦。
蠕动泵（Dynamax RP-1）	Rainin		不同的仪器供应商
pH计	Schott Gerate GmbH		不同的仪器供应商
手动计数器	Milian SA		存在多种仪器供应商