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方法文章

激光捕获显微切割人前列腺上皮组织用于RNA分析

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DOI：

10.3791/53405

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2015年11月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

本文内容

摘要

本实验方案的目的是利用激光捕获显微切割技术，从异质性前列腺组织中有效分离出特定细胞类型的纯群体，用于后续的RNA分析。

摘要

前列腺包含多种类型的间质、上皮、神经内分泌和免疫细胞。健康的前列腺由纤维肌性间质组成，其间分布着由上皮细胞衬覆的独立分泌性腺腔，以及极少量的免疫细胞和神经内分泌细胞。相比之下，前列腺癌区域表现为腔面上皮细胞异型性增加，而间质细胞群显著减少或完全缺失。鉴于间质细胞与上皮细胞类型之间存在显著差异，对任何下游分子分析而言，分离这些不同细胞类型至关重要。尽管已有上述认识，目前大多数基因表达研究在未进行显微切割的情况下直接比较良性前列腺与癌组织，导致良性样本中存在间质偏倚。激光捕获显微切割（LCM）是一种可从组织切片中物理分离不同细胞类型的高效方法。本实验方案的目的是证明，可以从LCM获取的人前列腺上皮组织中成功提取RNA，并用于后续基因表达研究，如RT-qPCR和RNA测序（RNAseq）。

引言

前列腺是一种异质性组织，由排列成腺泡状的分泌性上皮构成，腺泡周围包绕着主要由平滑肌组成的纤维肌性间质1。上皮成分包含五种不同但结构有序的细胞类型：基底细胞、分泌细胞、神经内分泌细胞、过渡扩增细胞和干细胞2。前列腺癌（PCa）起源于腔面上皮细胞，腺癌的生长会导致间质成分明显进行性减少3。因此，根据前列腺癌累及范围的不同，组织标本中间质与上皮细胞类型的比例存在显著差异。若在未对目标细胞类型进行显微切割的情况下，直接采用全组织进行基因表达分析，这些差异可能导致对基因表达数据的偏倚性判断。因此，为消除此类偏倚，在RNA提取和基因表达分析之前，对不同细胞类型进行分离至关重要。

大体解剖或显微解剖可用于将特征明确的上皮区域从周围间质中物理分离4-6。大体解剖通常在解剖显微镜下使用剃刀片进行，适用于将较大的前列腺癌结节从间质中分离，但无法从周围间质中去除良性上皮（参见图1中良性前列腺组织学示例）。激光显微切割（LCM）比大体解剖劳动强度显著更高，但可非常精确地分离良性上皮4。

本实验室近期发表的研究表明，可通过激光显微切割（LCM）从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的活检组织或冷冻组织中成功提取RNA4,7-9。LCM-RNA提取的主要挑战在于：1）精确分离组织中目标区域；2）在LCM及分离过程中保持RNA的完整性4,10。从纯化细胞群体中分离得到的RNA可用于多种基因表达分析方法，包括逆转录定量PCR（RT-qPCR）7,8、微阵列11以及深度测序12-14。

本实验方案的目的是从冷冻组织中分离激光捕获显微切割的前列腺上皮细胞的总RNA，用于后续基因表达分析。

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方案

本研究所使用的所有人体组织均通过芝加哥大学机构审查委员会批准的方案和/或豁免获取。

1. 将新鲜冷冻前列腺组织切片至PEN膜载玻片和带电荷的玻璃载玻片上

  1. 在切片前一日或数小时前，使用喷雾瓶和实验室擦拭纸，以RNase去污染溶液清洁工具（即刷子、镊子、染色缸、刀片、PEN框架载玻片（若尚未为RNase-free）、乙醇安全标记笔和铅笔）以及室温冷冻切片机内部。
    1. 让RNase去污染溶液静置5分钟后再擦拭，用depcH20冲洗以去除残留的RNase去污染溶液，最后用70% EtOH（用depcH20配制）进行终末冲洗。
      注意：必须维持无RNase的工作环境。所有染色缸、工具、冷冻包埋介质、刀片和载玻片均应仅用于无RNase实验，不得在常规非无RNase环境中使用。所有仪器在每次实验前必须用RNase去污染溶液处理。
  2. 将冷冻切片机冷却至-24 °C。
  3. 在切片前至少30分钟，将以下已清洁的无RNase器具放入冷冻切片机内预冷：装满100%乙醇的载玻片染色缸、工具、小型冷冻组织包埋盒和持样夹头。
  4. 从冷冻储存中取出冷冻的前列腺组织，放入装有干冰的泡沫桶中运输。将组织放入冷冻切片机中，使其至少平衡30分钟以达到冷冻切片机温度。
    注意：用于激光捕获显微切割的人类前列腺组织可以是新鲜冷冻组织或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。不同来源组织在时间要求和载玻片制备上略有差异。本文描述的是冷冻切片的操作步骤。
  5. 每次处理一个组织样本，将冷冻包埋介质挤入包埋盒底部，并迅速使用预冷镊子将冷冻的前列腺组织嵌入冷冻包埋介质中。
  6. 将带有组织的包埋盒置于冷冻切片机内的冷却台上5分钟，使冷冻包埋介质凝固。
  7. 在持样夹头上挤少量冷冻包埋介质，小心地将已固定的组织底面朝上压入冷冻包埋介质中。在冷冻切片机中静置5分钟，使冷冻包埋介质完全固化。
  8. 将夹头放入夹持器并拧紧。
  9. 将手柄锁定在锁定位置，并在冷冻切片机上安装新刀片。对于后续分子检测包含扩增步骤（即 qPCR）的实验，建议每位患者使用新刀片以防止交叉污染（或移动刀片位置，使用刀片的另一区域处理下一个样本）。
  10. 解锁手柄，用手或脚踏板小心推进组织，以50 µm厚度连续切片，直至暴露出目标组织区域。
  11. 将冷冻切片机调整至5 µm，切下一至两片组织，将其贴附于带电荷的玻璃载玻片上，用于苏木精-伊红（H&E）染色（见步骤2）。
  12. 立即将载玻片浸入冷的100%乙醇中2分钟。
  13. 从乙醇中取出带电荷的玻璃载玻片，在室温下晾干后进行H&E染色（步骤2）。
  14. 将室温PEN框架载玻片放置在支架上。
  15. 将冷冻切片机调整至10 µm，将切片贴附于室温PEN框架载玻片上。根据组织大小，每张载玻片可放置1至4片切片。
  16. 立即将载玻片浸入冷的100%乙醇中2分钟。
  17. 从乙醇中取出PEN框架载玻片，将其存放在-80 °C冰箱内的干燥器中的载玻片盒中，直至进行激光捕获显微切割（LCM）。为获得最佳RNA回收率，最长保存时间为三天。
  18. 仅对带电荷的玻璃载玻片执行步骤2。对PEN框架载玻片执行步骤3。

2. 组织学标记的苏木精和伊红（H&E）染色

注意：此步骤针对带电荷的玻璃载玻片上的组织，而非用于激光显微切割（LCM）的PEN膜框架载玻片。

  1. 在带电荷的玻片上进行切片水化，将玻片依次浸入梯度乙醇中：100% 乙醇中浸入2次，每次3分钟；95% 乙醇中浸入2次，每次3分钟；70% 乙醇中浸入1次，3分钟；蒸馏水中浸入2次2O持续3分钟。
    1. 配制酸性酒精溶液：99 ml 70% 乙醇 + 1 ml 1% 盐酸，以及 0.1% 碳酸氢钠溶液：将 0.1 g 碳酸氢钠溶于 100 ml 蒸馏水2O
  2. 将载玻片浸入苏木精Gill II（0.4%）中染色5分钟。
  3. 用稳定流动的自来水冲洗掉多余的染料2O 3 分钟。
  4. 将载玻片在酸性酒精中浸入10次
  5. 用流动的自来水冲洗载玻片2O 培养 3 分钟。
  6. 将载玻片浸入0.1%碳酸氢钠溶液中30-60秒，使紫红色变为蓝色。
  7. 用流动的自来水冲洗载玻片2O持续3分钟。
  8. 用95%乙醇冲洗载玻片，浸洗10次。
  9. 将载玻片浸入伊红-Y 染液中 2 至 3 次，总计 15 秒。
  10. 通过梯度乙醇脱水，步骤如下：将切片在95%乙醇中浸入两次，再在100%乙醇中浸入两次，最后在二甲苯中浸入两次（确保组织变透明，表明已充分脱水）。
  11. 使用非水性永久性硬封片剂封片，并加盖盖玻片。
  12. 让载玻片干燥30分钟。
  13. 使用任意全切片扫描仪扫描玻片，并将大尺寸、高分辨率图像打印在8” x 11”纸上。
  14. 用记号笔标出感兴趣的区域（通常由经委员会认证的病理学家完成）。该标记将作为激光显微切割（LCM）操作的指引。

3. PEN框架载玻片的甲苯胺蓝染色

注意：此步骤需与激光显微切割（LCM）在同一天完成。所有溶液均使用DEPC处理的H2O水配制。所有操作均须在无RNase的环境中进行。所有玻片染色缸必须用去除RNase的去污溶液清洗。

  1. 激光显微切割当天，从 -80 °C 冰箱中取出 PEN 膜载玻片，并将其轻轻浸入 90% EtOH 中 2 分钟，再浸入 75% EtOH 中 2 分钟进行水化。
    1. 通过将亚甲蓝溶于分子生物学级水中配制 0.5% 亚甲蓝溶液，然后经 0.2 µm 滤器过滤除菌，并在室温下保存。该溶液可重复使用长达 6 个月。注意：建议提前配制此溶液，因为过滤过程可能需要数小时。
  2. 将载玻片轻轻浸入 0.5% 亚甲蓝溶液中 5–30 秒，对前列腺组织进行染色。随后将载玻片在 depcH2O 中洗涤两次，每次 15 秒，再在 75% EtOH 中洗涤 30 秒至 3 分钟以脱色。注意：可根据实际情况调整染色和脱色时间，以确保染色效果良好。前列腺组织容易染色过深。
  3. 将带 PEN 膜的载玻片转移至冰上的无 RNA 酶干燥容器中。

4. 激光捕获显微切割（LCM）  

  1. 在进行激光显微切割（LCM）前，立即在42 °C的载片加热板上将载玻片干燥15分钟。仅干燥即将处理的载玻片，其余载玻片应保存在冰上，待使用时再取出。
  2. 按以下顺序开启设备：先打开LCM仪器和计算机，然后依次打开显微镜电源、激光钥匙、激光开关，最后启动计算机。随后启动激光显微切割软件。
  3. 使用软件控制显微镜加载载玻片和收集管。点击“卸下载样架”，将带有组织切片的载玻片（组织面向下）放入显微镜的载玻片架中，并将其插入显微镜的相应插槽，然后点击“继续”。
    1. 点击“卸载收集管”，在管架上标记并装载0.5 ml收集管，并将其插入仪器的相应插槽。待管盖固定后，在收集管盖中加入35 μl裂解缓冲液，尽量避免产生气泡。然后点击“OK”。
      注意：若存在蒸发问题，可按如下方式稀释缓冲液：25 µl裂解缓冲液加10 µl DEPC处理水（depcH2O）。
  4. 在软件中选择载玻片在载片架中的位置，并选择用于收集LCM样本的收集管盖。
  5. 通过计算机以10倍物镜观察并聚焦载玻片。在软件中选择“Laser”（激光）菜单下的“Calibrate”（校准）功能，对激光进行校准。调整激光的功率、光圈和速度，选择“Laser”（激光）菜单下的“Control”（控制）功能，使激光束能够完整且高效地切割所选区域。重复调整，直至激光能够完全穿透组织。
  6. 以8英寸×11英寸的病理学家标记图作为参考，使用“绘制形状”工具在视野中圈定目标上皮区域，避免收集任何间质组织。
    注意：可在同一视野内选择多个区域，但在点击“切割形状”工具完成切割前，不得切换至其他视野。
    1. 若激光未能完全切割某一区域，可使用“移动并切割”工具手动重复切割。持续移动物镜至新的视野，并重复激光切割过程，直至完成整张载玻片的切割，或收集到所需量的组织（通常100个良性腺体可获得150–500 ng RNA）。（参见图1A示例）。
  7. 小心地从收集架上取下收集管并拧紧管盖，注意管盖中的裂解缓冲液和组织。短暂离心30秒，使液体和组织沉至管底。将样本在42 °C孵育30分钟，随后保存于-80 °C，待进行RNA提取时使用。

5. 基于滤膜试剂盒的总RNA提取及质量分析

  1. 将离心管置于冰上解冻，并将溶液体积调整至 100 µl。
  2. 向RNA提取试剂盒的微型滤膜中心加入 30 µl 裂解液，预先润湿滤膜，并在执行接下来两个步骤期间让其充分浸润（至少 5 分钟）。
  3. 向裂解液中加入 3 µl LCM添加剂溶液（试剂盒提供），涡旋振荡 5 秒以混匀。离心 30 秒，使液体聚集于管底。
  4. 将已预润湿的滤膜以最高速度离心约 30 秒，去除残留液体。
  5. 向裂解液混合物中加入 1.25 倍体积（本例中为 129 µl）的 100% 乙醇，轻轻涡旋或吹打混匀。**该方法可同时回收大分子和小分子RNA。
  6. 将样品加载至预润湿的微型滤膜上，于 10,000 × g 离心 1 分钟，使RNA结合到滤膜上。随后用 180 µl “洗涤液 1”冲洗滤膜，于 10,000 × g 离心 1 分钟。
    注意：自此步骤起，所有离心操作均应使用 13,000 × g 或最大速度进行。
  7. 按照试剂盒说明书要求，分别用 180 µl “洗涤液 2”和“洗涤液 3”各洗涤滤膜一次。每次离心 30 秒，弃去穿滤液，再将滤膜离心 1 分钟以去除残留液体并干燥滤膜。
  8. 将滤膜转移至新的收集管中。
  9. 将洗脱液（试剂盒提供）预热至 95 °C。
  10. 将 10 µl 预热的洗脱液加至滤膜中心，盖紧管盖，在室温下孵育 5 分钟。然后离心 1 分钟以洗脱RNA，重复此步骤一次，共获得约 20 µl RNA。
  11. 在 37 °C 下进行 DNase I 处理 15 分钟。
  12. 使用分光光度计在 260 nm 波长处测定RNA浓度。通过 260 nm 与 280 nm 波长下的吸光度比值评估RNA纯度（见表 1）15。

6. 基因表达分析

注意：长链 RNA 物种（如 mRNA 和 lncRNA）的基因表达在步骤 6.1 中展示，短链 RNA 物种（如 microRNA）的基因表达在步骤 6.2 中展示。RT-qPCR 可使用不同的试剂盒，所需 RNA 量因试剂盒而异（可低至 10 ng）。RNA 测序分析在 6.3 中描述。

  1. 将5 µl浓度为20 ng/µl的RNA样本与5 µl逆转录（RT）预混液（RT缓冲液、dNTP、随机引物、RT酶、RNase抑制剂）混合，进行逆转录反应生成cDNA。反应条件为：25 °C孵育25分钟，随后37 °C孵育120分钟，最后85 °C孵育5分钟。
  2. 用无RNase的水将逆转录产物按1:10比例稀释，每10 µl定量PCR（qPCR）反应中加入2.5 µl稀释后的cDNA，并使用目的基因的引物或引物-探针组合。
    注意：为便于分析部分降解的RNA，建议使用扩增片段较短（小于100 bp）的引物16。（表2B）
    1. 对于microRNA表达分析，将5 µl浓度为2–10 ng/µl的RNA样本与5 µl逆转录预混液混合进行逆转录反应。
      注意：每种 commercially-available 基于PCR的microRNA检测技术均需使用其专有的特异性逆转录引物。
  3. 除RT-PCR外，也可选用或同时采用下一代测序技术（RNA-seq或small-RNA-seq）对不同类型的RNA进行定量分析。通常该实验需使用500 ng RNA （表3），具体操作步骤请依照试剂盒制造商及检测仪器的说明进行。

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结果

在之前的一项研究中，我们展示了利用激光显微切割技术（LCM）采集上皮和间质组织，以通过RT-qPCR比较同一患者冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）前列腺组织中mRNA和microRNA的表达谱4。LCM耗时较长，特别是当需要收集大量RNA用于下一代测序分析时。因此，保持操作空间和工具无RNase污染至关重要。建议对所收集的RNA进行质量和细胞特异性对照检测（下一段将详细讨论）。图1显示了显微镜下PEN膜载玻片上前列腺组织切片在激光捕获良性上皮细胞前后的染色情况。

样本采集并小心提取RNA后，必须评估RNA的质量和数量，如表1所示。观察到较低的260/280 nm比值并不罕见。浓缩RNA可改善260/280 nm比值，但可能导致小RNA种类的丢失。除质量控制外，还必须检测细胞类型特异性标志物，以确认激光显微切割组织区域的特异性（图1B-C）。例如，在图1B中，通过检测AMACR基因的表达...

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讨论

从人体样本中进行基因表达谱分析可能具有挑战性，不仅因为可获得的组织在质量和数量上的限制，还因为给定组织样本中存在多种不同的组织学结构。这种情况在前列腺中尤为突出，其中良性组织主要由间质构成，而癌变区域则缺乏间质成分。激光显微切割（LCM）技术可实现前列腺间质与上皮细胞RNA的物理分离，从而更准确地获得两种不同细胞类型的表达特征（图1A）。与宏观解剖或整体组织处理相比，LCM能够分离良性组织中的不同细胞区室，但其成本显著更高，且劳动强度更大。

与任何技术一样，该方法也可能存在一些潜在问题。例如，RNA 质量可能在初始样本采集过程中或激光显微切割（LCM）及提取过程中发生部分降解。在第一种情况下，可通过定量 PCR（qPCR）检测不同较短扩增子来实现基因表达分析。在第二种情况下，应严格对所有工具和材料进行无 RNase 处理，以防止 RNA 降解，同时需谨慎操作和处理组织切片。此外，在单张载玻片上的操作时间应限制在 90 分钟以内，以在收集过程中维持 RNA 质量。LCM 技术最主要的局限性在于需要具备 LCM 仪器以及进行 LCM 所需的大量人力劳动...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Vicky Macias 博士、Angeline Giangreco 和 Avani Vaishnav 多年来在优化本方法学方面提供的帮助，感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的 Yang Zhang 和 Jian Ma 博士进行 RNA 测序分析。本研究由以下机构资助：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 R01 CA166588-01（Nonn）、美国癌症协会研究学者奖 124264-RSG-13-012-01-CNE（Nonn）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 R03 CA172827-01（Nonn）、美国国防部前列腺癌研究计划健康差异创意奖 PC121923（Nonn），以及预防癌症基金会资助（Zhou）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNase-AWAY MBP7005-11
4.0 mm PEN膜切片 Leica11600289
Superfrost Plus 玻片FisherBrand12-550-15
200 证明乙醇Decon labs.2701
DEPC（焦碳酸二乙酯）SigmaD-5758
冷冻切片机LeicaCM3050
考普林瓶（染色缸）IHCWORLDM900-12
考普林架（染色架）IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope® CS
甲苯胺蓝Fluka89640-5G
激光显微切割系统LeicaLMD7000
LCM 用 0.5 ml 薄壁管Thermo ScientificAB-0350
RNAqueous®-Micro 总 RNA 提取试剂盒AmbionAM1931Thermo Fisher Scientific 品牌
NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 荧光计Life TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific 品牌
高容量 cDNA 反转录试剂盒Applied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific 品牌
通用 cDNA 合成试剂盒 II，8-64 次反应Exiqon203301
TaqMan microRNA RT 试剂盒Applied Biosystems4366597Thermo Fisher Scientific 品牌
苏木精染色液 Ricca Chemical Company3536-16
伊红-YRichard Allan Scientific 7111

参考文献

  1. Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
  2. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
  3. McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
  4. Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
  5. Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
  6. Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
  7. Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
  8. Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
  9. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
  10. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95(2010).
  11. Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165(2010).
  12. Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
  13. Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
  14. Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
  15. Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
  16. Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246(2014).

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