本实验方案的目的是利用激光捕获显微切割技术，从异质性前列腺组织中有效分离出特定细胞类型的纯群体，用于后续的RNA分析。
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摘要
摘要
前列腺包含多种类型的间质、上皮、神经内分泌和免疫细胞。健康的前列腺由纤维肌性间质组成，其间分布着由上皮细胞衬覆的独立分泌性腺腔，以及极少量的免疫细胞和神经内分泌细胞。相比之下，前列腺癌区域表现为腔面上皮细胞异型性增加，而间质细胞群显著减少或完全缺失。鉴于间质细胞与上皮细胞类型之间存在显著差异，对任何下游分子分析而言，分离这些不同细胞类型至关重要。尽管已有上述认识，目前大多数基因表达研究在未进行显微切割的情况下直接比较良性前列腺与癌组织，导致良性样本中存在间质偏倚。激光捕获显微切割（LCM）是一种可从组织切片中物理分离不同细胞类型的高效方法。本实验方案的目的是证明，可以从LCM获取的人前列腺上皮组织中成功提取RNA，并用于后续基因表达研究，如RT-qPCR和RNA测序（RNAseq）。
引言
前列腺是一种异质性组织，由排列成腺泡状的分泌性上皮构成，腺泡周围包绕着主要由平滑肌组成的纤维肌性间质1。上皮成分包含五种不同但结构有序的细胞类型：基底细胞、分泌细胞、神经内分泌细胞、过渡扩增细胞和干细胞2。前列腺癌（PCa）起源于腔面上皮细胞，腺癌的生长会导致间质成分明显进行性减少3。因此，根据前列腺癌累及范围的不同，组织标本中间质与上皮细胞类型的比例存在显著差异。若在未对目标细胞类型进行显微切割的情况下，直接采用全组织进行基因表达分析，这些差异可能导致对基因表达数据的偏倚性判断。因此，为消除此类偏倚，在RNA提取和基因表达分析之前，对不同细胞类型进行分离至关重要。
大体解剖或显微解剖可用于将特征明确的上皮区域从周围间质中物理分离4-6。大体解剖通常在解剖显微镜下使用剃刀片进行，适用于将较大的前列腺癌结节从间质中分离，但无法从周围间质中去除良性上皮（参见图1中良性前列腺组织学示例）。激光显微切割（LCM）比大体解剖劳动强度显著更高，但可非常精确地分离良性上皮4。
本实验室近期发表的研究表明，可通过激光显微切割（LCM）从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的活检组织或冷冻组织中成功提取RNA4,7-9。LCM-RNA提取的主要挑战在于：1）....
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方案
本研究所使用的所有人体组织均通过芝加哥大学机构审查委员会批准的方案和/或豁免获取。
1. 将新鲜冷冻前列腺组织切片至PEN膜载玻片和带电荷的玻璃载玻片上
- 在切片前一日或数小时前，使用喷雾瓶和实验室擦拭纸，以RNase去污染溶液清洁工具（即刷子、镊子、染色缸、刀片、PEN框架载玻片（若尚未为RNase-free）、乙醇安全标记笔和铅笔）以及室温冷冻切片机内部。
- 让RNase去污染溶液静置5分钟后再擦拭，用depcH20冲洗以去除残留的RNase去污染溶液，最后用70% EtOH（用depcH20配制）进行终末冲洗。
注意：必须维持无RNase的工作环境。所有染色缸、工具、冷冻包埋介质、刀片和载玻片均应仅用于无RNase实验，不得在常规非无RNase环境中使用。所有仪器在每次实验前必须用RNase去污染溶液处理。
- 让RNase去污染溶液静置5分钟后再擦拭，用depcH20冲洗以去除残留的RNase去污染溶液，最后用70% EtOH（用depcH20配制）进行终末冲洗。
- 将冷冻切片机冷却至-24 °C。
- 在切片前至少30分钟，将以下已清洁的无RNase器具放入冷冻切片机内预冷：装满100%乙醇的载玻片染色缸、工具、小型冷冻组织包埋盒和持样夹头。
- 从冷冻储存中取出冷冻的前列腺组织，放入装有干冰的泡沫桶中运输。将组织放入冷冻切片机中，使其至少平衡30分钟以达到冷冻切片机温度。
注意：用于激光捕获显微切割的人类前列腺组织可以是新鲜冷冻组织或福尔马林固定石蜡包埋....
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结果
在之前的一项研究中，我们展示了利用激光显微切割技术（LCM）采集上皮和间质组织，以通过RT-qPCR比较同一患者冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）前列腺组织中mRNA和microRNA的表达谱4。LCM耗时较长，特别是当需要收集大量RNA用于下一代测序分析时。因此，保持操作空间和工具无RNase污染至关重要。建议对所收集的RNA进行质量和细胞特异性对照检测（下一段将详细讨论）。图1显示了显微镜下PEN膜载玻片上前列腺组织切片在激光捕获良性上皮细胞前后的染色情况。
样本采集并小心提取RNA后，必须评估RNA的质量和数量，如表1所示。观察到较低的260/280 nm比值并不罕见。浓缩RNA可改善260/280 nm比值，但可能导致小RNA种类的丢失。除质量控制外，还必须检测细胞类型特异性标志物，以确认激光显微切割组织区域的特异性（图1B-C）。例如，在图1B中，通过检测AMACR基因的表达.......
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讨论
从人体样本中进行基因表达谱分析可能具有挑战性，不仅因为可获得的组织在质量和数量上的限制，还因为给定组织样本中存在多种不同的组织学结构。这种情况在前列腺中尤为突出，其中良性组织主要由间质构成，而癌变区域则缺乏间质成分。激光显微切割（LCM）技术可实现前列腺间质与上皮细胞RNA的物理分离，从而更准确地获得两种不同细胞类型的表达特征（图1A）。与宏观解剖或整体组织处理相比，LCM能够分离良性组织中的不同细胞区室，但其成本显著更高，且劳动强度更大。
与任何技术一样，该方法也可能存在一些潜在问题。例如，RNA 质量可能在初始样本采集过程中或激光显微切割（LCM）及提取过程中发生部分降解。在第一种情况下，可通过定量 PCR（qPCR）检测不同较短扩增子来实现基因表达分析。在第二种情况下，应严格对所有工具和材料进行无 RNase 处理，以防止 RNA 降解，同时需谨慎操作和处理组织切片。此外，在单张载玻片上的操作时间应限制在 90 分钟以内，以在收集过程中维持 RNA 质量。LCM 技术最主要的局限性在于需要具备 LCM 仪器以及进行 LCM 所需的大量人力劳动.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Vicky Macias 博士、Angeline Giangreco 和 Avani Vaishnav 多年来在优化本方法学方面提供的帮助，感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的 Yang Zhang 和 Jian Ma 博士进行 RNA 测序分析。本研究由以下机构资助：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 R01 CA166588-01（Nonn）、美国癌症协会研究学者奖 124264-RSG-13-012-01-CNE（Nonn）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 R03 CA172827-01（Nonn）、美国国防部前列腺癌研究计划健康差异创意奖 PC121923（Nonn），以及预防癌症基金会资助（Zhou）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| 4.0 mm PEN膜切片 | Leica | 11600289 | |
| Superfrost Plus 玻片 | FisherBrand | 12-550-15 | |
| 200 证明乙醇 | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC（焦碳酸二乙酯） | Sigma | D-5758 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3050 | |
| 考普林瓶（染色缸） | IHCWORLD | M900-12 | |
| 考普林架（染色架） | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| 甲苯胺蓝 | Fluka | 89640-5G | |
| 激光显微切割系统 | Leica | LMD7000 | |
| LCM 用 0.5 ml 薄壁管 | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro 总 RNA 提取试剂盒 | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific 品牌 |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 荧光计 | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific 品牌 |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific 品牌 |
| 通用 cDNA 合成试剂盒 II，8-64 次反应 | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT 试剂盒 | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific 品牌 |
| 苏木精染色液 | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| 伊红-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
参考文献
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12
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