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方法文章

一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

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DOI：

10.3791/53407

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2015年12月19日

 ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

摘要

在脊椎动物细胞周期中，染色质经历广泛的结构与功能变化。进入有丝分裂期时，染色质高度凝缩为棒状染色体，并由有丝分裂纺锤体装置独立移动。有丝分裂期间的染色质凝缩使染色体的致密程度比间期增加约五十倍。在退出有丝分裂时，染色体必须重建其功能性的间期状态，该状态由核膜包被，并具备进行DNA复制和转录的能力。染色质去凝缩过程在形态学上已有较清晰的描述，但在分子层面仍知之甚少：我们目前缺乏对潜在分子事件的了解，以及在很大程度上仍不清楚参与该过程的因子及其调控机制。本文描述了一种无细胞体系，能够真实地重现染色质去凝缩过程 体外，基于从同步化的HeLa细胞中纯化的有丝分裂染色质簇 X. laevis 卵提取物。我们的无细胞体系为进一步在分子水平上表征染色质去凝集及其与有丝分裂退出过程中同步发生的其他事件（如核膜和核孔复合体的重新组装）之间的协调机制提供了重要工具。

引言

Xenopus laevis 卵提取物是一种强大且广泛应用的工具，可在无细胞体系的简化条件下研究复杂的细胞事件。自 Lohka & Masui1首次描述以来，该体系已被广泛用于研究有丝分裂过程，如染色质凝缩2、纺锤体组装3、核膜破裂4，以及核质运输5或DNA复制6。相比之下，有丝分裂末期发生的、对间期细胞核重建至关重要的事件，如核膜重建和核孔复合体的重新组装，其机制尚不清楚，但同样可利用Xenopus卵提取物进行研究7。我们近期建立了一种基于Xenopus卵提取物的实验方法，用于研究有丝分裂末期的染色质去凝缩过程8，这一过程尚未得到充分研究，有待深入表征。

在多细胞动物中，染色质在进入有丝分裂时高度凝缩，以确保遗传物质能够准确分离。为了保证在间期染色质可被基因表达和DNA复制所利用，必须在有丝分裂末期使其去凝缩。在脊椎动物中，有丝分裂期的染色质凝缩程度相比间期可高达五十倍 9与酵母中通常低得多的有丝分裂压缩程度相比， 例如， 仅两倍于 S. cerevisiae 10脊椎动物染色质去凝集的研究主要集中于卵子受精后精子DNA的重组过程。其分子机制涉及核质素（nucleoplasmin）——一种在卵母细胞中含量丰富的蛋白质——将精子特异性的鱼精蛋白置换为卵子中储存的组蛋白H2A和H2B。该过程亦通过以下方法得以阐明： 非洲爪蟾 卵提取物 11,12然而，核质素的表达仅限于卵母细胞 13 有丝分裂期的染色质不含这些精子特异性的鱼精蛋白。因此，有丝分裂末期的染色质去凝集过程不依赖于核质素 8.

对于 体外 解聚反应，我们采用由活化物制备的提取物 X.laevis 来自同步化HeLa细胞的卵母细胞和染色质簇。用钙离子载体处理卵母细胞可模拟受精过程中精子进入所引发的卵细胞内钙离子释放。钙波触发细胞周期的恢复，使停滞在减数第二次分裂中期的卵母细胞进入第一次间期。 14因此，由激活的卵细胞制备的卵提取物代表了有丝分裂退出/间期状态，能够诱导有丝分裂退出特异事件的发生，如染色质去凝集、核膜及核孔复合体的重新形成。为了分离有丝分裂染色质簇，我们采用了一种略作修改的Gasser发表的实验方案 & Laemmli 15，其中通过梯度离心法在含多胺缓冲液中分离经有丝分裂同步化的HeLa细胞，经裂解后释放染色体簇。

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方案

HeLa 细胞有丝分裂染色质聚集体的分离

1. 准备工作

  1. 细胞培养溶液
    1. 通过向DMEM中添加10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM谷氨酰胺，制备完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。用去离子水配制磷酸盐缓冲液（PBS），其中含2.7 mM KCl、137 mM NaCl、10 mM Na2HPO4·2H2O和2 mM KH2PO4，并用10 N NaOH将pH调节至7.4。
      注意：PBS可长期在室温下保存为10倍浓缩液。使用前用去离子水稀释至1倍浓度。若用于细胞培养，使用前需再次过滤1倍溶液。
    2. 用DMEM培养基配制40 mM胸苷溶液（适用于细胞培养）储备液。将0.97 g胸苷溶解于90 mL DMEM培养基中，定容至100 mL。将储备液储存在-20 °C。将诺考达唑溶解于DMSO中，配制成5 mg/mL的储备液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套和口部防护装备）。
  2. 有丝分裂簇分离溶液
    注意：1.2中所述所有溶液在配制或解冻后，整个实验过程中均需保持在冰上。
    1. 将去离子水在121 °C下高压灭菌105分钟。将四盐酸精胺溶于已灭菌的去离子水中，终浓度为200 mM（69.6 mg/mL）。将储备液储存于-20 °C。将三盐酸亚精胺溶于已灭菌的去离子水中，终浓度为200 mM（50.8 mg/mL）。将储备液储存于-20 °C。
    2. 用热的去离子水配制5%（w/v）的皂苷溶液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套和口部防护装备）。过滤后分装并储存在-20 °C。将苯甲基磺酰氟（PMSF）溶于100%乙醇中，配制成终浓度为200 mM（35 mg/mL）的溶液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套和口部防护装备）。将储备液储存于-20 °C。
    3. 用去离子水将二硫苏糖醇（DTT）溶解为终浓度1 M（154 mg/mL）的溶液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套）。过滤后将储备液储存在-20 °C。
    4. 通过将10 mg/mL AEBSF（4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟）、0.2 mg/mL亮抑蛋白酶肽、0.1 mg/mL胃蛋白酶抑制剂和0.2 mg/mL抑肽酶溶于去离子水中，配制100倍浓缩的蛋白酶抑制剂混合液（注意！在通风橱内操作，佩戴手套）。将储备液储存于-20 °C。
    5. 配制10倍浓缩的缓冲液A，其中含150 mM Tris-Cl（pH 7.4）、800 mM KCl、20 mM EDTA-KOH（pH 7.4）、2 mM四盐酸精胺和5 mM三盐酸亚精胺。缓冲液A中不含四盐酸精胺和三盐酸亚精胺时可储存于4 °C，这两种成分应在使用前新鲜加入。
      注意：EDTA仅在pH高于8时溶解，因此配制高浓度EDTA-KOH储备液（推荐0.5 M）时，需加入5 N KOH使pH略高于8以促溶，随后滴定至pH 7.4。
    6. 配制20倍浓缩的缓冲液As，其中含100 mM Tris-HCl（pH 7.4）、400 mM KCl、400 mM EDTA-KOH（pH 7.4）和5 mM三盐酸亚精胺。缓冲液As的储存条件与缓冲液A相同。
      注意：工作液I至IV（见后续步骤）、甘油梯度溶液以及胶体二氧化硅颗粒溶液（含直径15至30 nm、包被不可透析聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的二氧化硅颗粒）均需在分离操作前新鲜配制（PMSF和皂苷应在使用前直接加入，因PMSF在水溶液中不稳定，皂苷长期冰上储存易沉淀）。
    7. 通过将0.5倍缓冲液A、1 mM DTT、1:100蛋白酶抑制剂混合液和0.1 mM PMSF加入已灭菌的去离子水中，配制100 mL溶液I。通过将1倍缓冲液A、1 mM DTT、1:100蛋白酶抑制剂混合液、0.1 mM PMSF、0.1%皂苷和10%甘油加入已灭菌的去离子水中，配制50 mL溶液II（用于细胞裂解）。
    8. 通过将0.25倍缓冲液A、1 mM DTT、1:100蛋白酶抑制剂混合液、0.1 mM PMSF和0.05%皂苷加入已灭菌的去离子水中，配制200 mL溶液III。通过将1倍缓冲液As、1 mM DTT、1:100蛋白酶抑制剂混合液、0.1 mM PMSF和0.1%皂苷加入已灭菌的去离子水中，配制40 mL溶液IV。
    9. 通过向溶液I中加入25%甘油和0.1%皂苷，配制120 mL甘油梯度溶液。
    10. 通过将60% v/v（体积比）的二氧化硅颗粒悬浮液（颗粒直径15至30 nm，包被不可透析聚乙烯吡咯烷酮（PVP））、15%甘油、2 mM三盐酸亚精胺和0.8 mM四盐酸精胺加入溶液IV中，配制150 mL胶体二氧化硅颗粒溶液。
    11. 配制簇储存缓冲液，其中含250 mM蔗糖、15 mM Hepes（pH 7.4）、0.5 mM三盐酸亚精胺、0.2 mM四盐酸精胺、1:100蛋白酶抑制剂混合液、0.3% BSA和30%甘油。簇储存缓冲液可保存于-20 °C。
    12. 配制压片固定液，其中含10%甲醛（注意！在通风橱内操作，佩戴手套）、50%甘油、两倍浓度Mark’s改良林格液（MMR，见4.5节）和0.2 µg/mL DAPI（注意！佩戴手套）。将溶液避光保存于4 °C的反应管中。使用此压片固定配方并非实验关键，其他配方亦可适用。

2. 细胞同步化

  1. 第1天：将HeLa细胞接种于五个75 cm2（250 ml）培养瓶中，加入培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。
    注意：此操作将在染色质簇分离当天获得约18 × 106个细胞。
  2. 第2天：当细胞融合度至少达到50%（即培养表面约一半被细胞覆盖，仍有生长空间）时，加入胸腺嘧啶至终浓度为2 mM（胸腺嘧啶阻断），并在37 °C、5% CO2条件下继续培养24小时。
    注意：此操作将使细胞停滞于G1/S期交界处。
  3. 第3天：吸除含胸腺嘧啶的培养基，加入无菌PBS。用无菌PBS轻轻冲洗细胞一次，随后吸除PBS，再轻柔加入15–20 ml新鲜预热的完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养3至4小时，以解除G1/S期阻滞。
  4. 第3天（续）：解除G1/S期阻滞后，加入诺考达唑至终浓度为100 ng/ml。将诺考达唑原液（5 mg/ml）取2 µl加入98 µl新鲜DMEM培养基中稀释，然后每毫升细胞培养液中加入1 µl稀释后的诺考达唑溶液。在37 °C、5% CO2条件下继续培养约12小时，使细胞阻滞于有丝分裂期。

3. 有丝分裂细胞簇的分离

  1. 第4天：分离有丝分裂细胞簇。在明场显微镜下观察，检查大部分细胞是否处于有丝分裂期。若处于有丝分裂的细胞少于50%，则需等待更多细胞进入有丝分裂期。通过用力轻敲培养瓶侧面（或用移液器轻轻吹打），使剩余的有丝分裂细胞脱落。将细胞悬液转移至50 ml锥形离心管中。
    注意：有丝分裂期的细胞会变圆，容易从培养瓶底部脱落（类似于胰蛋白酶消化后的细胞），而细胞周期其他阶段的细胞则呈扁平状并牢固贴附于培养瓶上。
  2. 通过在1,500 × g下离心10分钟（4 °C或室温）收集有丝分裂细胞，随后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于8 ml PBS中，合并至一个50 ml锥形离心管内，用PBS充满离心管，再次于1,500 × g离心10分钟。总共重复此洗涤步骤三次。
  3. 从现在开始，所有步骤均需在冰上使用预冷溶液进行。将沉淀物用37 ml预冷的溶液II剧烈重悬。用25 ml移液管将悬液转移至预冷的40 ml玻璃-玻璃匀浆器中，在冰上用紧密贴合的研杵上下抽打裂解细胞，直至有丝分裂簇完全脱离胞质物质。抽打次数高度依赖于皂苷素（digitonin）储备液的浓度，通常在3至20次之间变化。
    注意：匀浆过程可以较为剧烈，但应以几乎所有有丝分裂细胞均已裂解且细胞簇中观察不到胞质成分时视为完成（参见3.4）。
  4. 轻吹混匀几次后，取5–10 µl细胞悬液，与台盼蓝按1:2比例混合，用显微镜在血细胞计数板中进行观察。当细胞发生裂解时，染色质被染成蓝色，并无细胞膜包裹（注意：可能存在的少量胞质残余会聚集在蓝色染色质周围，易于区分）。
    注意：有丝分裂期细胞会先于间期细胞裂解，但需注意不要过度匀浆，以避免间期细胞核和破碎染色质的污染。
  5. 立即用10 ml移液器将全细胞裂解液小心铺加到5根预冷的聚碳酸酯离心管（28.8 × 107.0 mm，建议提前将离心管置于冰上冷却）中的冷阶梯梯度液上层（每根离心管底部加入5 ml 60%胶体二氧化硅颗粒溶液，再在其上覆盖19.5 ml甘油梯度溶液）。细胞在溶液II中不宜长时间停留，因此建议提前准备好离心管和梯度液。例如， 在洗涤步骤期间）。
  6. 在4 °C条件下，使用固定角转子以1,000 x g离心30分钟。
    注意：细胞核、未裂解的细胞和细胞团簇共同聚集在甘油与胶体二氧化硅颗粒层的界面处。
  7. 使用移液器吸除间相上方的液体，并将剩余部分转移至预冷的匀浆器中。使用紧密研杵进行3-15次匀浆（具体次数仍取决于皂苷素原液浓度），以消除聚集体并去除细胞骨架纤维。每进行数次研磨后，检查匀浆效果。取1 µl样品与1 µl含DAPI的压片固定液混合，于荧光显微镜下观察。
    注意：研磨次数至关重要，出现团聚的聚集物表明研磨次数不足，而染色质破碎和细胞核碎片则表明匀浆过度。
  8. 将溶液分装至四个新的聚碳酸酯离心管（28.8 × 107.0 mm）中（每管约10 ml），然后用60%胶体二氧化硅颗粒溶液完全充满各管（每管约30 ml胶体二氧化硅颗粒溶液）。
    注意：避免胶体二氧化硅颗粒梯度过载，因为如果梯度中存在过多细胞质碎片，容易导致颗粒聚集体被截留。
  9. 在4 °C下，先以3,000 × g离心5分钟，随后在固定角转子中以45,440 × g离心30分钟。
    注意：与之前相同，间期细胞核将不会进入梯度液（前提是匀浆操作不过于剧烈，以免细胞核从细胞质碎片中释放），但细胞核团块会聚集在离管底约1.5 cm处，通常呈松散球状。
  10. 使用移液器吸除团块上方的液体，将剩余部分收集至一个离心管中，充分重悬后分装至两个聚碳酸酯离心管（28.8 x 107.0 mm）。在每个离心管中用溶液III将团块悬液按1:4比例稀释，并充分混匀。标记沉淀将要形成的位置，于4 °C下以1,000 x g离心15分钟，使用固定角转子。
  11. 将沉淀重悬于溶液III中，合并至一个50 ml锥形离心管内，并用溶液III定容。在300 × g条件下离心约10分钟。切勿使用更高转速离心，以免导致簇状物发生不可逆聚集。
  12. 用溶液III在1.5或2 ml离心管中再次洗涤（重悬沉淀并完全充满离心管），在300 × g条件下离心。用移液器小心移除上清液。将沉淀小心重悬于250 µl簇储存缓冲液中（若存在多个沉淀，则将所有沉淀合并，共用250 µl）。取5–10 µl样品与台盼蓝按1:2稀释，在血细胞计数板（Neubauer chamber）中进行计数。如需要，可进一步稀释，以获得约500个簇/µl的浓度。
  13. 将悬液通过100 µm细胞滤筛，以确保去除因重悬不当形成的细胞团块。这些细胞团块可在-80 °C下保存数月。为避免反复冻融，请分装成适当体积的 aliquot，并在液氮中速冻。

4. 制备间期Xenopus laevis卵提取物的缓冲液

注意：Xenopus laevis 青蛙的饲养和处理严格遵循欧洲理事会《实验和其他用途脊椎动物保护公约》（欧盟于1998年批准）以及德国关于科研中使用脊椎动物的相关法律所规定的要求和规范。

  1. 根据1.2.3和1.2.4配制DTT和100倍蛋白酶抑制剂混合液。将细胞松弛素B溶于DMSO中，使其终浓度为10 mg/ml，分装（建议每份10或20 µl），并于-20 °C保存。
  2. 将环己酰亚胺溶于乙醇中，使其终浓度为20 mg/ml，分装（建议每份500 µl），并于-20 °C保存。将钙离子载体A23187溶于乙醇中，使其终浓度为2 mg/ml，分装后于-20 °C保存。
    注意：PI、DTT、细胞松弛素B、环己酰亚胺和A23187可反复冻融。
  3. 配制20倍浓度的Mark's Modified Ringers缓冲液（20x MMR），其中含2 M NaCl、40 mM KCl、20 mM MgCl2、40 mM CaCl2、2 mM EDTA和100 mM Hepes，用5 N KOH调节pH至8.0。
    注意：20x MMR可在室温下长期保存。根据卵子数量，每只注射的青蛙制备间期卵提取物需1 L的1x MMR，另需5–10 L用于洗涤步骤。使用5 N KOH将1x MMR的pH重新调节至8.0。用于过夜饲养青蛙的1x MMR（O/N x 1）应置于室温。用于提取物制备的1x MMR应保持低温直至使用，但实验中1x MMR是否真正低温并非关键。
  4. 使用无菌水在实验前一天配制1 L蔗糖缓冲液，其中含250 mM蔗糖、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2和10 mM Hepes（pH 7.5）。蔗糖缓冲液应于4 °C保存。
  5. 实验当天早晨新鲜配制去胶溶液：将2% L-半胱氨酸溶于0.25x MMR中，用5 N KOH调节pH至7.8。配制后置于4 °C保存直至使用。

5. 间期Xenopus laevis卵提取物的实验方案

  1. 实验前3-10天，向每只青蛙的背侧淋巴囊注射120国际单位（I.E.）的孕马血清促性腺激素（PMSG）（使用5 ml注射器，27 G ¾‘‘针头）。
    注意：该注射可诱导排卵。每只青蛙产卵数量差异较大。产卵良好的青蛙在去胶后可能产生体积达7 ml的卵，相当于最多3.5 ml的粗提物。但需注意，部分青蛙可能不产卵或产卵质量差。
  2. 实验前一晚，每只青蛙注射500国际单位（I.E.）人绒毛膜促性腺激素（hCG）（使用5 ml注射器，27G ¾‘‘针头），以诱导排卵。将青蛙置于含1.2 l 1x MMR（pH 8）的独立水箱中，在18 °C下饲养13-17小时。
  3. 将卵倒入600-1,000 ml的玻璃烧杯中收集。
    注意：仅选用质量良好的卵批次，即单独产出、大小均匀、色素明显且具有深色与浅色两半的卵。避免使用呈串状或外观肿胀发白的卵。在整个操作过程中，应使用塑料巴氏吸管将不良卵剔除。有关良卵与劣卵的详细描述，请参见Gillespie et al.6。
  4. 通过倾倒上清液并在卵沉降后重新加入新鲜缓冲液的方式，用1x MMR对卵进行约4次充分洗涤。
    注意：在去胶前卵较为稳定，可直接将洗涤缓冲液加至卵上。
  5. 将卵在2%半胱氨酸溶液中孵育以去胶。2-4分钟后倾去缓冲液，并小心加入新鲜缓冲液更换一次。当卵体积显著缩小且排列更加紧密时，视为去胶完成。
    注意：去胶过程约需5-7分钟，应在可见变化后停止，最迟不超过10分钟。
  6. 通过倾倒并重新填充上清液的方式，用1x MMR对卵进行约4次洗涤。
    注意：去胶后的卵更为脆弱，因此洗涤操作需更加小心。应将MMR缓冲液沿烧杯壁缓缓加入，避免直接冲击卵。
  7. 在100 ml 1x MMR中加入8 µl钙离子载体（2 mg/ml溶于乙醇）以激活卵。当动物极帽收缩现象可见或10分钟后，停止激活。
    注意：动物极帽收缩表现为卵的黑色半部发生紧缩。
  8. 通过倾倒并重新填充上清液的方式，小心洗涤4次，使用1x MMR。
  9. 在室温下将卵于1x MMR中孵育20分钟。
  10. 在孵育期间准备离心管：在5 ml离心管（13 x 51 mm）中加入50 µl蔗糖缓冲液、50 µl 100倍蛋白酶抑制剂混合液、5 µl 1 M DTT、12.5 µl环己酰亚胺（用于抑制翻译，特别是cyclin B的合成）以及2.5 µl细胞松弛素B（用于抑制肌动蛋白聚合）。若卵体积超过30 ml，可使用14 ml离心管（14 x 95 mm），此时所有试剂体积增加2.4倍。
  11. 用冷蔗糖缓冲液将卵洗涤两次（在玻璃烧杯中倾倒并重新加液），然后使用开口较宽的塑料巴氏吸管（剪去细端）将卵转移至离心管中。
  12. 以130 × g离心1分钟使卵沉淀。为此目的，将离心管放入15 ml锥形离心管中（14 ml管则放入50 ml锥形离心管中）。目标是尽可能去除缓冲液，防止提取物被稀释。离心后，用塑料巴氏吸管吸除多余缓冲液，并可酌情补充更多卵至管顶。
  13. 在4 °C条件下，使用6 × 5 ml摆动转子离心机以21,000 × g离心20分钟。
  14. 使用带有16 G 1 ½‘‘针头的5 ml注射器，从顶部黄色卵黄层与底部深色破碎卵碎片之间的区域吸取低速提取物。操作时，将针头刺入离心管壁，位置略高于底部破碎卵碎片层。插入针头时应将离心管抵住固定物以保持稳定。
    注意：一支装满的5 ml离心管可获得1.8-2.5 ml提取物。
  15. 每1 ml提取物中加入10 µl 100倍蛋白酶抑制剂混合液、1 µl 1 M DTT、2.5 µl环己酰亚胺（20 mg/ml）和0.5 µl细胞松弛素B（10 mg/ml）。提取物需保持在冰上。
    注意：提取物可立即用于实验，也可分装后迅速冷冻并储存在液氮中数月。冷冻会降低其活性。对于免疫耗竭等精细实验，强烈建议立即使用新鲜提取物。

6. 缓冲液的制备 体外 染色质去凝集的重建

  1. 配制能量混合物贮存液，其中包含25 mM ATP、25 mM GTP、127.5 mg/ml磷酸肌酸和2.5 mg/ml肌酸激酶，溶于含250 mM蔗糖、1.2 mM Hepes、5.9 mM KCl和0.3 mM MgCl2的缓冲液中。分装后于-80 °C保存。解冻后新鲜使用，避免再次冻融。
  2. 将0.2 g/ml糖原溶解于去离子水中，于-20 °C保存。将6-二甲基氨基嘌呤（DMAP）溶于DMSO中，终浓度为0.25 M。分装后于-20 °C保存。解冻后新鲜使用，避免再次冻融。
  3. 配制30 %（w/v）蔗糖的PBS溶液，过滤后于4 °C保存。配制4 % VikiFix溶液，其中含80 mM PIPES（pH 6.8）、1 mM MgCl2、150 mM蔗糖和4 %多聚甲醛（PFA）（注意！需在化学通风橱中操作，佩戴手套和口罩）。
    注：PFA难以溶解，建议按以下步骤操作：配制1 L Viki-Fix时，分别在两个烧杯中用热（接近沸腾）的去离子水溶解24.2 g PIPES和40 g PFA。两者均需加入10 N NaOH助溶，但需注意避免过量。将51.4 g蔗糖和1 ml 1 M MgCl2加入PFA溶液中，再将PIPES溶液加入该混合液。加水至终体积1 L，并通过加入NaOH调节pH至中性。
  4. 将10 mg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶于水中（注意！需佩戴手套）。避光保存于-20 °C。

7. 实验方案 体外 染色质去凝集的重建

  1. 在固定角转子中，将两相间提取物于386,000 × g下离心12分钟（适用于20 × 0.2 ml规格），或于355,000 × g下离心12分钟（适用于10 × 2.0 ml转子）。
  2. 使用真空泵或移液器小心去除上层脂质，收集上清液（此后称为高速提取物），避免触及底部沉淀物造成膜污染，并弃去沉淀。
    注意：为减少可能的膜污染，建议将提取物离心两次，或在离心前用相当于提取物体积20%的蔗糖缓冲液进行稀释。然而，稀释及额外的离心步骤可能会降低提取物的活性。
  3. 将18 µl高速提取物移入1.5 ml反应管中，加入0.7 µl有丝分裂集落（可根据染色质储备浓度略微调整用量）、0.5 µl糖原、0.5 µl能量混合物和0.3 µl DMAP。在加入染色质后，立即使用带宽口的枪头混匀反应体系，以防止去凝缩染色质发生剪切。
    注意：该反应可在有或无膜的情况下进行（参见 图3)。为了在膜存在的情况下使染色质去凝集，加入 2 µl 按 Eisenhardt 所述方案制备的上浮膜。 等. 16
  4. 在20 °C下孵育反应混合物长达2小时（或更短时间以研究染色质去凝集过程的早期时间点）。
  5. 通过加入0.5 ml含0.5%戊二醛和0.1 mg/ml DAPI的冰上预冷Viki-Fix溶液，冰上孵育20–30分钟，对样品进行固定。
    注意：如果样品后续将进行免疫荧光处理，则固定时不应使用戊二醛，因为戊二醛常会干扰抗体染色。然而，如果仅分析DAPI染色，添加戊二醛可更好地保存染色质结构。
  6. 将圆形盖玻片（直径12 mm）与多聚-L-赖氨酸溶液孵育5分钟，以增强盖玻片对染色质的亲和力。随后将盖玻片置于滤纸上干燥。
  7. 将平底离心管（6 ml，16/55 mm）组装好，把覆有涂层的一面朝上放置于离心管底部。加入800 µl 30%蔗糖垫层，然后将固定后的样品铺在上方。
  8. 在 4 °C 条件下，以 2,500 × g 离心 15 分钟。
    注意：平底离心管适用于可容纳15 ml锥形离心管的转子。
  9. 弃去上清液，然后用16 G 1½英寸注射针头小心穿刺离心管底部，将盖玻片从管中取出。操作时，可将针头及其针帽底部用胶带固定在一起，并剪去针帽前端，使针头前端外露约3 mm。当针头将盖玻片一端挑起后，用镊子夹住盖玻片并将其取出。
  10. 将盖玻片浸入去离子水中快速清洗，轻轻将其边缘接触滤纸以吸干水分，然后将其放置在载玻片上的一滴封片剂液滴中。用指甲油封片，干燥后避光保存。
    注意：未使用戊二醛固定的样品可保存在24孔板中的PBS内，并可用于后续免疫荧光染色。若需保存数天，应添加0.05%叠氮化钠警告！ 佩戴手套以避免细菌污染 PBS。
  11. 使用DAPI信号的荧光显微镜分析样品（采用 例如， 配备405 nm激光器的共聚焦显微镜）

8. 免疫荧光染色缓冲液的制备 体外 重建染色质去凝集样品

  1. 根据1.1.1制备PBS。将NH4Cl溶解于PBS中，使其终浓度为50 mM。将该溶液保存于4 °C。用PBS新鲜配制5 µg/ml的DAPI溶液。向PBS中加入0.1 % Triton X-100，保存于4 °C。使用前新鲜配制封闭缓冲液：将3 %牛血清白蛋白（BSA）溶于含0.1 % Triton X-100的PBS中。

9. 免疫荧光染色实验方案 体外 重建染色质去凝集样品

注意：除非另有说明，所有后续盖玻片的孵育均在24孔板中进行，每孔至少加入250 µl溶液。体外去浓缩的染色质样本比固定细胞更敏感，因此在添加或移除溶液时需格外小心。建议使用切角的塑料巴斯德吸管。在洗涤步骤和二抗孵育过程中，将培养板置于室温下的摇床或旋转平台上，转速不超过100 rpm。

  1. 通过将盖玻片与 1 ml PBS 中的 NH4Cl 孵育 5 分钟来淬灭样品。用 1 ml 封闭缓冲液孵育样品至少 30 分钟以进行封闭。
  2. 为一抗孵育组装一个湿盒：将一张湿润的纸巾放在可密闭盒子的底部，再将 24 孔板的盖子倒扣在湿润的纸巾上。在倒置的盖子内放置一片 Parafilm，并在 Parafilm 上每份样品加入 70 µl 抗体溶液。抗体溶液的配制方法是将抗血清或亲和纯化的抗体用封闭缓冲液按 1:100 的比例稀释。
  3. 将盖玻片倒扣于抗体溶液上，孵育 1 至 2 小时。然后将盖玻片放回 24 孔板中，使样品面朝上，并用 1 ml 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
  4. 在室温下用 250 µl 用封闭缓冲液稀释的荧光标记二抗孵育盖玻片 1 小时，二抗稀释浓度应遵循制造商推荐。避光操作。用 1 ml 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
  5. 用 1 ml 含 5 µg/ml DAPI 的 PBS 孵育样品 10 分钟。用 1 ml 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  6. 将盖玻片在去离子水中快速浸洗，轻轻将其边缘接触滤纸以吸干液体，然后将其放置于载玻片上的一滴封片剂液滴上。用指甲油封片，干燥后于 4 °C 避光保存直至使用。通过荧光显微镜分析样品。

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结果

解凝聚反应的时间依赖性

图1 显示了染色体去凝集实验的典型时间过程。反应开始时可见的染色体簇逐渐去凝集，并融合成一个单一、圆形且表面光滑的细胞核。当用蔗糖缓冲液替代卵母细胞提取物时，染色体簇仍保持凝集状态，这表明去凝集活性存在于卵母细胞提取物中。

染色质去凝集是一个依赖能量的过程

该 体外 去凝聚反应可被方便地操控 例如， 通过添加抑制剂。在下图所示的实验中 图2，不可水解的ATP或GTP类似物，ATPγS 或 GTPγS 被加入反应体系中，两者均抑制了解聚过程，表明该过程是依赖 ATP 和 GTP 的主动过程（图2).

染色质去凝集与核膜重建可被分离

在有或无膜存在的情况下进行了染色质去凝缩实验...

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讨论

Xenopus laevis 卵母细胞提取物是真实再现细胞过程的非常有用的工具 体外，并且该系统已成功用于细胞周期和细胞分裂事件的表征 2,3,5,6,17由于在卵子发生过程中卵细胞内储存了大量细胞核组分，因此卵提取物是获取细胞成分的优良来源。与哺乳动物组织细胞系中的RNA干扰或遗传操作等其他方法相比，该系统具有多项优势：无细胞体系可使研究者在不受细胞存活性限制的情况下研究细胞过程；此外，复杂过程中的各个独立步骤亦可通过简单的实验体系进行分析。本文所介绍的染色质去凝集实验，可特异性地研究有丝分裂后染色质去凝集的分子机制，且不受其他有丝分裂事件的干扰。 非洲爪蟾 卵母细胞提取物易于通过去除特定蛋白质以及添加抑制剂或突变蛋白进行操作 8例如， 图2 显示了在去凝集实验中加入不可水解的ATP或GTP类似物ATPγS和GTPγS的结果。通过稀释和差速离心法 非洲爪蟾 卵子组分（如膜和胞质溶胶）可以被分离 16. 图3 显...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了德国研究基金会和欧洲研究委员会（W.A. 获资助编号 AN377/3-2 和 309528 CHROMDECON）以及勃林格殷格翰基金会博士奖学金（A.K.S.）的支持。图 1 & 2 来自《发育细胞》的转载 31(3)，Magalska 等，RuvB样ATP酶在有丝分裂末期的染色质去凝集过程中发挥作用，305-318，2014年，经Elsevier许可转载。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亚精胺四盐酸盐Fluka analytical85610-25G
精胺三盐酸盐Sigma S2501-5G
高纯度皂苷Millipore300410-1GM有毒
PMSFApplichemA0999,0100有毒
胸腺嘧啶Calbiochem6060
诺考达唑Calbiochem487928有毒
37% 甲醛溶液Roth7398-1有毒
台盼蓝溶液 (0.4%)SigmaT8154有毒
1,4-二硫苏糖醇 (DTT)Roth6908.2
AEBSF 盐酸盐ApplichemA1421,0001
胃蛋白酶抑制剂Roth2936.1/2/3
亮抑蛋白酶肽RothCN334
抑肽酶RothA162.3
Percoll（胶体二氧化硅颗粒溶液）GE Healthcare17-0891-01
谷氨酰胺Gibco25030-024
青霉素-链霉素Gibco15140-122
75 cm² 组织培养瓶Greiner Bio-one658175
热灭活胎牛血清 (FBS)Gibco10500-064
匀浆器 (40 ml 组织研磨器)Wheaton357546
血细胞计数板（Neubauer 计数室）Assistent441/1
 橡树岭离心管，聚碳酸酯材质 (50 ml)Nalgene3118-0050
100 µm 细胞筛，尼龙材质BD Falcon352360
细胞松弛素 BApplichemA7657,0010有毒
放线菌酮Roth8682.3有毒
L-半胱氨酸Merck1,028,381,000
人绒毛膜促性腺激素 (hCG)，商品名 OvogestMSD1431593
孕马血清促性腺激素 (PMSG)，商品名 IntergonanMSD1431015
A23187（钙镁混合盐）EnzoALX-450-002-M010有毒
注射器针头 (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")Braun4665120
ATPServa10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20RothK056.1/2/3/4
磷酸肌酸二钠盐Calbiochem2380
肌酸磷酸激酶SigmaC3755-35KU
DMAPSigmaD2629-1G
DAPI Roche10236276001
多聚甲醛 (PFA)SigmaP-6148有毒
TLA 100 用离心管 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)Beckman Coulter343775
"Cell-Saver"（带宽口吸头，1,000 µl）Biozym729065
50% 戊二醛溶液，I 级Sigma alderichG7651-10 ml有毒
0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液SigmaP8920-100 ml
平底管 (6 ml, 16.0/55 mm)Greiner Bio-one145211
Vectashield 封片剂Vector laboratoriesH1000
TLA120 用离心管 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)Beckman Coulter343778
"Cell-Saver"（带宽口吸头，200 µl）Biozym729055
12 mm 盖玻片Thermo Scientific0784 #1

参考文献

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

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有丝分裂退出非洲爪蟾卵提取物有丝分裂染色质簇HeLa细胞核膜重组装高速提取物蔗糖垫离心多聚甲醛固定
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