一种用于在三维环境中评估癌细胞球体侵袭能力的实验方法

摘要

该方法用于评估癌细胞从类球体向周围三维基质的侵袭。类球体通过悬滴培养法生成，随后包埋于含有基底膜成分和I型胶原的基质中，继而监测类球体外的侵袭情况。

摘要

癌细胞系的侵袭性被认为与其转移潜能相关。然而，大多数传统检测方法并未在三维环境中考察这些侵袭特征，导致所得数据的生物学适用性降低。本文介绍了一种在生理相关条件下可视化细胞系侵袭能力的方法。癌细胞球体侵袭实验首先利用重力作用，在悬挂在细胞培养皿盖上的培养基液滴中形成球体。随后，将这些球体嵌入由基底膜材料与I型胶原混合组成的三维基质中。接着，随时间推移监测癌细胞从球体向周围基质中的迁移情况。本文所述方法可进行修改，以检测不同类型细胞共培养后、添加药物/抑制剂后，或细胞外基质（ECM）成分改变后的侵袭行为。

引言

已知癌细胞的运动能力可预测其转移潜能，因为这种行为有助于癌细胞穿过基底膜并进入循环系统。¹大多数关于运动性的研究集中于细胞在二维（2D）环境中的行为，尽管目前普遍认识到，细胞在三维（3D）基质中的运动更能真实反映这些细胞的实际行为方式 体内²三维培养系统正被越来越多地用于研究细胞行为，范围涵盖细胞形态、生长动力学以及药物敏感性³在三维微环境中监测癌细胞侵袭能力的需求，推动了已有技术的整合与发展，其中通过悬滴培养法生成三维细胞聚集体（球状体）是关键技术之一⁴，随后将这些球体嵌入由胶原蛋白和基底膜成分构成的三维细胞外基质（ECM）中⁵该方法旨在通过提供一种简化的操作流程，改进此前已建立的技术，以便在多种实验条件下轻松地比较侵袭能力。

评估细胞运动性的更传统方法 体外 划痕损伤实验和Transwell实验⁶前者在二维环境中描述细胞运动能力，因此不依赖于多种对 体内 侵袭， 例如 蛋白酶活性⁷Transwell 实验在小室插入物包被了细胞外基质（ECM）底物后能更好地模拟细胞侵袭，但仅能提供单一参数， 即 对侧膜表面细胞的出现情况进行测量，因此细胞侵袭的许多细微特征难以直接观察。与这些技术不同，肿瘤细胞球体侵袭实验（图1

方案

1. 类球体的生成

1. 通过使用 PBS 洗涤并随后暴露于 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使约 70% 汇合度的贴壁癌细胞脱离，制备用于悬滴培养的单细胞悬液。
   1. 用细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并取部分细胞悬液进行细胞计数。注意：具体的细胞培养基取决于所测试的细胞系。请遵循 ATCC 的培养基推荐，通常为 DMEM + 10% FBS。更多信息见材料表。
   2. 进行稀释，以便在每 20 µl 细胞培养基液滴中接种 500–1,000 个细胞。
2. 取一个 10 cm 培养皿，在底部加入 5 ml 无菌 PBS。注意：此步骤可防止悬滴蒸发。可使用成本较低的“细菌学级”培养皿替代细胞培养级培养皿，因为细胞不会接触培养皿表面。
3. 使用多通道移液器将稀释后的细胞悬液以 20 µl 液滴形式转移至培养皿盖内表面。
   1. 在 10 cm 培养皿的皿盖上点样 40 个液滴（8 列 × 5 行）。
4. 将皿盖翻转并置于培养皿上方。将悬滴培养物在 37 °C 下孵育 72 小时，以生成球状体。
   1. 以稳定而果断的方式翻转皿盖。注意：翻转过快或过慢均可能导致液滴移位。某些细胞系可能在 48 小时或更短时间内形成球状体，而其他细胞系可能需要超过 72 小时才能形成致密的细胞聚集体。

结果

使用球状体侵袭实验（图1），检测了一组癌细胞系形成球体的能力，以及在植入由基底膜成分和I型胶原构成的三维基质后细胞迁移出球体的程度（表1。这些结果表明，并非所有癌细胞系都能形成结构完整的球状体，其中具有上皮样形态的细胞系 体外 倾向于形成规则且光滑的聚集体。不同细胞系在该实验中的侵袭能力也各不相同。已知具有侵袭性的细胞系，如4T1、E0771和U-87 MG，在实验中表现出较高的类球体外排能力。而侵袭性较弱的细胞系，如MCF-7、BT474和MCF10DICS.com，则未表现出侵袭行为，与预期一致。然而，A-431和COLO 357 PL细胞缺乏侵袭性则出乎意料。部分细胞系的实验数据示例如下（图2对于4T1和E0771细胞，细胞侵袭在将类球体嵌入三维基质后24小时已显著出现；而对于U-87 MG细胞，侵袭在植入基质后即刻开始。

细胞侵袭的定性评估可通过图像分析软件中的定量分析进一步支持。文中提供了两种不同的侵袭程度定量策略（图3.......

讨论

本研究评估了一组癌细胞系在球体侵袭实验中的表现（表1）。通常情况下，我们发现上皮样特征更明显的细胞系更有利于球体的形成，因为细胞间连接的存在促进了类似球体结构的构建。已知经历上皮-间质转化的细胞系（如 MDA-MB-231 细胞）在悬滴培养中无法形成球体，这很可能归因于其 E-、N- 和 P-钙黏蛋白表达水平降低¹⁶。

类球体侵袭实验中的某些步骤需要严格遵循操作规程。在移液基底膜与胶原蛋白混合物时，操作必须迅速，且在整个操作过程中必须将混合物保持在接近 4 °C 的温度，因为该混合物在室温下会开始凝固。此外，可溶性胶原蛋白制剂呈酸性，通过加入少量氢氧化钠和盐并升温至 37 °C 可诱导其形成凝胶。据我们经验，将等体积的胶原蛋白与基底膜材料直接混合后，升温即可使其具备成胶能力，因为基底膜组分能够中和胶原蛋白的酸性。如果计划使用较低比例的基底膜：胶原蛋白，则应在加入基底膜混合物之前预先中和胶原蛋白，以促进其聚合。一旦形成，大多数类球体具有较强的抗解离能力，能够在构成三维培养体系的黏稠混合物中存活。在重悬步骤中，还必须小心避免产生气.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生长因子减少型Matrigel	Corning	CB-40234
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源，100 mg	Millipore	08-115
DMEM	Life Technologies	11995-065
RPMI 1640培养基	Life Technologies	11875-093
PBS	Life Technologies	10010-023
0.05%胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
胎牛血清，热灭活	Omega Scientific	FB-12
100 mm细胞培养处理培养皿	Corning Incorporated	430167
24孔细胞培养处理板	NEST Biotechnlology	702001
Olympus IX-71倒置显微镜
细胞系在DMEM + 10% FBS中培养，BT-474和LNCaP细胞除外，这两种细胞系在RPMI + 10% FBS中培养。