染色质免疫沉淀实验用于鉴定拟南芥体内蛋白质-DNA 相互作用 In Vivo

摘要

染色质免疫沉淀是一种用于鉴定拟南芥蛋白质DNA结合位点的强大技术 体内该实验流程包括染色质交联与片段化、使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，以及对结合的DNA进行qPCR分析。本文介绍一种针对拟南芥植物优化的简易ChIP检测方法。

摘要

复杂的基因调控网络协调植物中的生物学过程和发育转变。基因的选择性转录激活与沉默介导了植物对环境信号和发育提示的响应。因此，深入了解调控植物基因表达的机制，对于全面理解植物中生物学过程的调控方式至关重要。本文所述的染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一种用于鉴定模式物种Arabidopsis thaliana中基因或基因组区域蛋白质DNA结合位点的方法。利用ChIP实验流程，可高效分析转录因子、染色质蛋白或组蛋白翻译后修饰形式等目标蛋白与DNA的相互作用。该方法基于在体（in vivo）固定蛋白质-DNA相互作用，随后对染色质进行随机片段化，利用特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合物，并通过PCR技术对与目标蛋白结合的DNA进行定量。该方法在拟南芥中的应用，已显著推动了对调控多种植物生物学过程的转录调控机制的揭示。通过该方法，研究人员成功鉴定了拟南芥染色质蛋白EBS在开花主控基因FT调控区域的结合位点。同时，ChIP分析也揭示了该蛋白对FT基因组区域特定组蛋白修饰富集的影响。

引言

近年来，在模式物种Arabidopsis thaliana中已开发出多种遗传学、分子生物学和基因组学工具。这些技术极大地推动了人们对植物发育调控机制的理解。在利用拟南芥作为模式植物所研究的各类发育过程之中，开花时间的遗传调控已被广泛深入地分析。这些研究表明，植物能够非常精确地调节开花时间，以响应内源性信号（如激素和植株年龄）以及环境信号（如光周期和温度），从而将开花时间与自然季节周期同步^1,2。分离和鉴定开花时间发生改变的拟南芥突变体，对于揭示调控开花时间的复杂基因网络起到了决定性作用。这些遗传通路最终汇聚于少数几个关键基因，这些基因作为开花的“开关”发挥作用，而花器官起始的精确时间则取决于作用于成花整合基因上游的促进开花与抑制开花活动之间的平衡^1,3。

通过基因组学方法的辅助，对控制开花起始相关基因的功能表征揭示了转录调控在开花时间调节中的核心作用。事实上，许多开花主控基因编码的是转录因子⁴。此外，多种染色质重塑蛋白复合物也影响开花主控基因的表达。在拟南芥中分离出的多个开花时间异常的突变体，其突变基因实际上编码了多种染色质修饰蛋白。不同的染色质重塑因子在组蛋白尾部引入翻译后修饰、相对于DNA重新定位核小体，或以组蛋白变体替换经典组蛋白，这些过程对于拟南芥开花的正常调控至关重要^5,6。其中一些染色质重塑活性可催化特定组蛋白残基上共价修饰（如乙酰化或甲基化）的添加或去除。这....

方案

1. 植物材料的交联（1 小时）

1. 在含有MS-琼脂培养基（1 L：1×Murashige & Skoog盐、10 g蔗糖、0.5 g MES，用KOH调节pH至5.7，1%琼脂）的大型培养皿（150 mm）上培养实验所用的拟南芥品系（野生型——WT——与突变体，或表达目标蛋白融合标签的品系与仅表达未融合蛋白的标签的品系）12–18天。或者，将植物种植于装有土壤与蛭石按3:1比例混合基质的花盆中。
   注意！甲醛经吸入、皮肤接触或吞咽后具有毒性，操作时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。步骤1.2–1.6应在通风橱中完成。
2. 用经实验室酒精灯加热的针头在50 ml离心管盖上打若干小孔。向管中加入40 ml 1×PBS缓冲液和1.08 ml甲醛，使其终浓度为1%（使用37%储备液）。将1.5 g植物材料收集至这些50 ml离心管中。交联过程中将离心管置于冰上保存。
3. 盖紧50 ml离心管的盖子，将离心管放入真空干燥器中并抽真空。真空浸润组织10分钟，然后缓慢释放真空，以防止溶液剧烈翻腾。混匀样品，重复该过程两次。浸润完成后，观察植物材料，确认其变得略微半透明并倾向于沉入管底（图2）。
4. 加入2.5 ml 2 M甘氨酸，使其终浓度达到0.125 M。抽真空5分钟。甘氨酸可作为甲醛交联的競爭性抑制剂。
5. 通过将带有小孔的50 ....

结果

该ChIP实验方案可分为八个主要步骤，用于鉴定 体内 蛋白质-DNA 相互作用，包括植物材料的培养与收获、染色质交联、染色质分离、染色质片段化、通过免疫沉淀选择性分离目标蛋白质与DNA的复合物、蛋白质消化、DNA纯化以及qPCR分析（图1）。ChIP 实验方案中的一个关键步骤是通过交联反应固定 DNA-蛋白质相互作用。通常在植物 ChIP 中使用甲醛进行交联。甲醛可穿透组织，在 NH₂ DNA中的蛋白质组或蛋白质与核苷酸¹⁶一种高效的核蛋白复合物固定方法 体内 需要确保甲醛进入植物细胞核内的染色质，因此必须将植物组织完全浸没在甲醛缓冲液中，以保证在免疫沉淀过程中能够有效富集蛋白-DNA复合物。拟南芥叶片表面覆盖有蜡质层，会阻碍交联剂进入细胞。此外，表皮毛容易在叶片表面形成气泡，阻止甲醛溶液渗入植物组织内部。为克服这一限制，本步骤中对样品施加真空处理，以防止固定液中气泡的形成，并促进甲醛充分渗透至所有细胞的细胞核内。经有效交联处理后的幼苗如图所示。 图2.

讨论

本文所述的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案是一种可在拟南芥植株中可重复且强有力地分析蛋白质与特定DNA序列在体（in vivo）相互作用的技术。要成功鉴定目标蛋白的结合位点，关键在于选择合适的植物器官或发育阶段，以确保相关相互作用确实正在发生。此外，获得适当的植物材料固定效果，并通过超声处理实现染色质的最佳片段化，也至关重要。高效免疫沉淀目标蛋白或标签所需的高特异性抗体同样是实验成功的关键因素。

在植物中使用ChIP方法面临一些困难，这些困难与次生代谢物和细胞壁的存在有关，可能会干扰实验方案中的不同步骤。此外，植物器官结构复杂，通常包含多种细胞类型，而目标DNA结合蛋白在其中的分布或活性可能各不相同，这也限制了该方法的应用。因此，只要可能，最好在ChIP实验中使用已证实目标蛋白存在和/或具有活性的均质组织。含有多种组织的复杂植物材料往往会导致目标蛋白实际发挥作用的细胞类型被稀释。组织切片²⁰已被用于植物中特定组织或细胞类型的研究。然而，在近年来，已开发出多种方法用于分离拟南芥中特定细胞类型的染色质⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MES	Sigma	M8250
MS（Murashige 和 Skoog 基本盐混合物）	Sigma	M5524
甲醛 37%	Sigma	F8775-25	在通风橱中使用
蛋白酶抑制剂混合物 cOmplete ULTRA 片剂，迷你型，无 EDTA，EASYpack	罗氏	5892791001
Bioruptor Standard 超声破碎仪	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
甘氨酸	Sigma	50046
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
与蛋白A或蛋白G偶联的Dynabeads磁珠	Life Technologies	10003D/10001D	查看制造商说明’抗体亲和力测定手册
Miracloth	默克密理博	475855
Triton X-100 Surfact-Amps 去垢剂溶液	Life Technologies	85112
（小鼠，大鼠，兔）…-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
磁力架 - DynaMag-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac 多克隆抗体 - 优质	Diagenode	C15410200-10
Chelex 100 树脂	Bio-Rad	142-2832
蛋白酶K	Life Technologies	17916
抗c-Myc标签抗体，克隆4A6	Millipore	05-724
LightCycler 480 SYBR Green I Master	罗氏	4707516001