染色质免疫沉淀是一种用于鉴定拟南芥蛋白质DNA结合位点的强大技术 体内该实验流程包括染色质交联与片段化、使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，以及对结合的DNA进行qPCR分析。本文介绍一种针对拟南芥植物优化的简易ChIP检测方法。
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摘要
摘要
复杂的基因调控网络协调植物中的生物学过程和发育转变。基因的选择性转录激活与沉默介导了植物对环境信号和发育提示的响应。因此，深入了解调控植物基因表达的机制，对于全面理解植物中生物学过程的调控方式至关重要。本文所述的染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一种用于鉴定模式物种Arabidopsis thaliana中基因或基因组区域蛋白质DNA结合位点的方法。利用ChIP实验流程，可高效分析转录因子、染色质蛋白或组蛋白翻译后修饰形式等目标蛋白与DNA的相互作用。该方法基于在体（in vivo）固定蛋白质-DNA相互作用，随后对染色质进行随机片段化，利用特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合物，并通过PCR技术对与目标蛋白结合的DNA进行定量。该方法在拟南芥中的应用，已显著推动了对调控多种植物生物学过程的转录调控机制的揭示。通过该方法，研究人员成功鉴定了拟南芥染色质蛋白EBS在开花主控基因FT调控区域的结合位点。同时，ChIP分析也揭示了该蛋白对FT基因组区域特定组蛋白修饰富集的影响。
引言
近年来，在模式物种Arabidopsis thaliana中已开发出多种遗传学、分子生物学和基因组学工具。这些技术极大地推动了人们对植物发育调控机制的理解。在利用拟南芥作为模式植物所研究的各类发育过程之中，开花时间的遗传调控已被广泛深入地分析。这些研究表明，植物能够非常精确地调节开花时间，以响应内源性信号（如激素和植株年龄）以及环境信号（如光周期和温度），从而将开花时间与自然季节周期同步1,2。分离和鉴定开花时间发生改变的拟南芥突变体，对于揭示调控开花时间的复杂基因网络起到了决定性作用。这些遗传通路最终汇聚于少数几个关键基因，这些基因作为开花的“开关”发挥作用，而花器官起始的精确时间则取决于作用于成花整合基因上游的促进开花与抑制开花活动之间的平衡1,3。
通过基因组学方法的辅助，对控制开花起始相关基因的功能表征揭示了转录调控在开花时间调节中的核心作用。事实上，许多开花主控基因编码的是转录因子4。此外，多种染色质重塑蛋白复合物也影响开花主控基因的表达。在拟南芥中分离出的多个开花时间异常的突变体，其突变基因实际上编码了多种染色质修饰蛋白。不同的染色质重塑因子在组蛋白尾部引入翻译后修饰、相对于DNA重新定位核小体，或以组蛋白变体替换经典组蛋白，这些过程对于拟南芥开花的正常调控至关重要5,6。其中一些染色质重塑活性可催化特定组蛋白残基上共价修饰（如乙酰化或甲基化）的添加或去除。这些组蛋白标记可被特异的效应因子识别，进而招募其他染色质重塑复合物、转录因子或转录机器的组分，以调控开花相关基因的转录活性。
染色质免疫沉淀（ChIP）可用于鉴定 体内 目的蛋白的DNA结合位点（图1）。该方法利用某些化学物质将蛋白质与DNA交联的能力，形成的DNA-蛋白质复合物可使用针对转录因子、染色质结合蛋白或特定修饰及异源表位（通常称为“标签”）的特异性抗体进行免疫沉淀。从这些免疫沉淀物中纯化的DNA可作为定量PCR（qPCR）反应的模板，用于检测特定目标序列的富集情况。通过这种方法，可确定转录因子的结合位点或组蛋白修饰在特定基因中的分布。7,8此外，结合能够实现大规模并行测序的下一代测序技术（NGS），染色质免疫沉淀技术（ChIP）已能够实现转录因子结合位点的全基因组鉴定，并揭示组蛋白修饰的表观基因组景观。进一步地，通过同时分析基因表达，可监测转录调控因子的结合或特定组蛋白修饰的沉积如何与基因的转录活性相关联。9.
在拟南芥中使用染色质免疫沉淀（ChIP）技术，使得研究人员能够评估多种转录调控因子对开花主控基因染色质结构的影响，以及这些结构变化如何调控基因表达5,6。先前的研究结果表明，拟南芥基因座EARLY BOLTING IN SHORT DAYS（EBS）作为开花的抑制因子发挥作用，该基因的突变体会表现出开花时间提前以及开花主控基因FT的表达上调。此外，FT基因功能缺失突变能够完全抑制ebs突变体的早花表型，表明FT是ebs突变体提前开花所必需的，同时也说明EBS对于抑制该开花主控基因的表达具有必要性10,11。EBS编码一种含有PHD结构域的蛋白，该蛋白可特异性结合组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化和三甲基化修饰（H3K4me2/3），提示EBS可能在染色质介导的FT基因抑制中发挥作用12。利用ChIP技术已证实，拟南芥中含PHD结构域的蛋白EBS10,11能够结合开花整合基因FT的调控区域，从而抑制其表达12。通过ChIP技术获得的进一步数据显示，该蛋白在拟南芥发育早期阶段对于维持开花主控基因染色质中较低水平的组蛋白乙酰化（活跃转录的标志）是必需的。这些发现，结合遗传学和基因表达数据，表明该拟南芥含PHD结构域的蛋白在通过调控开花整合基因FT的表达来精确调控开花时间方面具有核心作用12。本文所报道的工作提供了一种经过优化的方法，不仅适用于组蛋白的分析，也适用于其他染色质相关蛋白的研究，且具有更高的效率和更短的实验周期。此外，本研究还展示了ChIP技术的应用如何加深我们对染色质修饰变化与植物基因转录状态之间关系的理解，以及这些由染色质介导的基因表达调控机制如何影响拟南芥开花起始的过程。
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方案
1. 植物材料的交联（1 小时）
- 在含有MS-琼脂培养基（1 L：1×Murashige & Skoog盐、10 g蔗糖、0.5 g MES，用KOH调节pH至5.7，1%琼脂）的大型培养皿（150 mm）上培养实验所用的拟南芥品系（野生型——WT——与突变体，或表达目标蛋白融合标签的品系与仅表达未融合蛋白的标签的品系）12–18天。或者，将植物种植于装有土壤与蛭石按3:1比例混合基质的花盆中。
注意！甲醛经吸入、皮肤接触或吞咽后具有毒性，操作时应在通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。步骤1.2–1.6应在通风橱中完成。 - 用经实验室酒精灯加热的针头在50 ml离心管盖上打若干小孔。向管中加入40 ml 1×PBS缓冲液和1.08 ml甲醛，使其终浓度为1%（使用37%储备液）。将1.5 g植物材料收集至这些50 ml离心管中。交联过程中将离心管置于冰上保存。
- 盖紧50 ml离心管的盖子，将离心管放入真空干燥器中并抽真空。真空浸润组织10分钟，然后缓慢释放真空，以防止溶液剧烈翻腾。混匀样品，重复该过程两次。浸润完成后，观察植物材料，确认其变得略微半透明并倾向于沉入管底（图2）。
- 加入2.5 ml 2 M甘氨酸，使其终浓度达到0.125 M。抽真空5分钟。甘氨酸可作为甲醛交联的競爭性抑制剂。
- 通过将带有小孔的50 ml离心管倒置，弃去PBS-甲醛-甘氨酸溶液。
- 用1×PBS缓冲液清洗幼苗两次，再用水清洗一次，清洗液按步骤1.5所述方式弃去。将材料用纸巾吸干后，置于液氮中速冻。
注：冷冻组织可在–80 °C下保存数周。
2. 抗体的制备（1天）
注意：进行免疫沉淀时，建议使用通过蛋白G或蛋白A连接子与抗体结合的磁珠，这些连接子对抗体重链的恒定区具有高亲和力。DNA-蛋白质复合物可能非特异性地结合到磁珠-抗体偶联物的表面。因此，有必要在不含特异性抗体的情况下进行对照实验，以量化非特异性的背景结合。
- 每次免疫沉淀实验，取15 µl磁珠置于1.5 ml微量离心管中。磁珠用量取决于用于免疫沉淀的染色质数量以及所用抗体的特性。
- 洗涤步骤：向磁珠中加入1 ml染色质免疫沉淀（ChIP）稀释缓冲液，旋转混匀，将1.5 ml微量离心管置于磁力架上。静置约1分钟，使磁珠吸附至管壁。保持1.5 ml微量离心管仍在磁力架上，用移液器吸除上清液。重复该步骤两次。
注意：每种植物品系需进行两组免疫沉淀实验：一组使用磁珠和抗体（Ab），另一组作为无抗体对照（No-Ab），仅使用磁珠。 - 将磁珠重悬于200 µl ChIP稀释缓冲液中。向为每种植物品系准备的两个管中的一个加入适量特异性抗体（Ab）（不同抗体所需稀释度不同，需通过实验优化，或对于商业抗体，按照生产商说明书操作）。该样品用于免疫沉淀实验。向另一管中加入等量的非特异性IgG，作为阴性对照。
- 在4 °C旋转摇床上孵育过夜，使抗体与磁珠充分结合。
3. 染色质提取（4 小时）
- 使用研钵和研杵在液氮中将冷冻的植物材料充分研磨，直至粉末呈均匀的浅绿色。将粉末转移至一个新的50 ml离心管中。
- 在步骤 3.2–3.6 中，需在通风橱内操作。加入 30 ml 提取缓冲液 1（ExB 1），充分混匀以浸透组织粉末。从本步骤开始，所有样品必须始终置于 4 °C 环境中。残留的冷冻组织和液氮可能导致缓冲液冻结。需每 2 分钟将管子颠倒 4–5 次，确保冷冻组织完全解冻。
- 将浆液通过孔径为22-25 µm的滤膜过滤至新的50 ml离心管中，于4 °C下以1,000 x g离心20分钟。
注意：此步骤中，细胞核和所有细胞器将形成沉淀。ExB 1 含有足量蔗糖，可提供高密度并防止细胞器结构被破坏。 - 轻轻倾倒去除上清液。此时应观察到约2 ml的绿色沉淀。
- 将沉淀重悬于5 ml ExB 2中。此时沉淀的重悬较为困难。在4 °C下以1,000 × g离心10分钟。
注意：ExB 2 含有 1% Triton X-100，有助于破裂叶绿体并去除叶绿素。 - 将沉淀重悬于300 µl提取缓冲液3（ExB 3）中。
- 在洁净的微量离心管中加入 600 µl ExB 3。取步骤 3.6 中重悬的沉淀，小心地铺加到洁净的 ExB 3 上层。
- 在 4 °C、16,000 x g 条件下离心 1 小时。
注意：此步骤有助于去除样品中的去污剂。 - 用移液器吸取去除上清液。加入300 µl超声破碎缓冲液，通过缓慢吹打重悬细胞核沉淀，避免产生气泡，以免影响超声破碎效率。小心将全部悬液转移至一支洁净的1.5 ml微量离心管中。
注意：此缓冲液含有SDS，用于裂解细胞核并释放染色质。 - 将悬浮液进行超声处理，以裂解细胞核并将染色质随机剪切为较小的片段。采用适当的超声条件，使染色质片段主要富集在200–800 bp范围内（根据材料与试剂表中所述超声设备，设置为4 °C下30秒开启/30秒关闭，重复20–30个循环）。通过琼脂糖凝胶电泳分离所获得的DNA片段，以检测超声处理的效率。13，上样 2 µl 超声处理的染色质（图3).
警告！ 超声处理步骤中，若超声设备未置于隔音柜内，务必佩戴听力保护装置。
关键步骤！ 染色质片段化在很大程度上取决于超声破碎设备。应优化超声条件以获得合适大小的DNA片段富集。参见 图3 有关如何优化染色质片段化的示例。 - 在 4 °C 条件下，以 12,000 x g 离心 10 分钟。用移液器将上清液转移至一支洁净的 1.5 ml 微量离心管中，弃去沉淀。取十分之一上清液加入新的 1.5 ml 微量离心管中，标记为 Input，并于 -20 °C 冻存。
- 用ChIP稀释缓冲液将染色质稀释10倍，使SDS的终浓度为0.1%。
注意：样品可在 -20 °C 冻存数周。
4. 目标蛋白的免疫沉淀及DNA的回收（1天3小时）
- 按照步骤 2.2 所述，用 1 ml ChIP 稀释缓冲液将步骤 2.4 中包被抗体的磁珠洗涤三次，以去除过量抗体。用 200 µl ChIP 稀释缓冲液重悬磁珠。加入 50 µl 分离的染色质，在 4 °C 条件下于旋转摇床上孵育过夜。
注意：使用微量紫外-可见分光光度计检测染色质浓度。50 µl 分离的染色质应含有超过 10 µg 的 DNA。 - 步骤 4.2–4.5 均在 4 °C 条件下操作。按照步骤 2.2 所述，用 1 ml 低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。
- 用 1 ml 高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。
- 用 1 ml LiCl 洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。
- 用 1 ml TE 缓冲液洗涤磁珠两次。最后一次洗涤后，务必用移液器彻底吸除管内残留的 TE 缓冲液。
- 取出 INPUT 样品（步骤 3.9）。将 5 µl INPUT 转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，并与 ChIP 样品同步进行后续操作。加入 200 µl 5% 螯合离子交换树脂以逆转交联，在 95 °C 孵育 10 分钟，每 2–3 分钟振荡一次。在 16,000 x g 离心 30 秒后，小心用移液器将上清液转移至新的微量离心管中。
注意：传统逆转交联方法需在 NaCl 中过夜孵育，而使用螯合离子树脂在 95 °C 孵育 10 分钟即可高效实现脱交联和 DNA 洗脱，从而使实验流程缩短一天。 - 加入 2 µl 蛋白酶 K（10 mg/ml），在 37 °C 孵育 30 分钟以消化蛋白质并释放 DNA。
- 在 95 °C 孵育 10 分钟以终止反应。
- 在 16,000 x g 短暂离心 30 秒，用移液器将上清液转移至新管中。
- 使用标准 DNA 片段纯化试剂盒对分离的 DNA 进行纯化。
注意：请按照试剂盒制造商提供的说明书操作。 - 将试剂盒中的 DNA 结合柱转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。向柱中央加入 20 µl 无 DNase 水，于 16,000 x g 离心 60 秒以洗脱纯化后的 DNA。暂停点：样品可在 -80 °C 保存数周。
5. 通过qPCR测定免疫沉淀DNA中结合位点的丰度（4小时）
注意：由于与目的蛋白结合，必须对从沉淀染色质中分离出的DNA进行分析，以确定从总染色质中免疫沉淀了哪些DNA片段。
- 针对目标基因组区域设计引物，引物的熔解温度（Tm）应为 60 °C，GC 含量为 30%–80%。由于染色质通过超声处理被片段化，扩增序列的长度不应超过 150–200 个核苷酸（表 1）。
注意：Primer 3 程序（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）是引物设计的有用工具。有关引物设计的其他指导原则，可参考先前的报道8,14,15。 - 使用 BLAST 程序确保引物具有特异性（特别是启动子区域可能共享相似的转录因子结合序列），并利用输入 DNA（步骤 4.9）的 1:10 水稀释液检测引物扩增效率。基因组中某些区域的纯化效果优于其他区域，因此必须针对输入 DNA 的稀释样本设计并验证 PCR 引物。
- 将纯化的 DNA 用无菌水稀释至 1:10，每管 PCR 反应中加入 5 µl 稀释后的 DNA。
注意：仅稀释所需量，因为 DNA 可能吸附在 1.5 ml 微离心管管壁上。反复冻融会增加 DNA 分子的吸附量。对于每对引物，均需在输入样本、抗体 ChIP 样本和无抗体 ChIP 样本中进行扩增分析。 - 在 PCR 体系中加入 Sybr Green PCR 主混合液，使其终浓度为 1x，并加入每种引物至终浓度 0.5 µM，最后用无 DNase 水补足至 20 µl。
- 按照 Sybr Green PCR 主混合液生产商提供的说明进行 qPCR 反应。
6. 数据分析
注意：在现有的 ChIP 数据分析方法中，最常用的有两种。第一种是倍数富集法，也称为“相对富集”、“信号相对于背景”或“相对于无抗体对照”。第二种方法称为“输入百分比”（% of input）。
- 通过倍数富集法进行数据分析。
- 创建一个电子表格，包含样品名称以及qPCR反应后获得的原始Ct值。
- 对每个样品，将其原始Ct值减去相应“无抗体”（No-Ab）对照组的原始Ct值。注意：经过此数学运算后，“无抗体”对照组的Ct值将等于0。
- 通过以2为底、指数为第6.1.2步所得负差值的幂运算，计算倍数富集（表2）。
倍数富集 = 2 - (Ct(样品) - Ct(No-Ab))
注意：该方法将ChIP样品中特定DNA片段的丰度与“无抗体”对照组中该片段的丰度进行比较。该方法假设不同引物组、样品及重复实验之间的背景信号水平具有可重复性。然而，这种“噪声”信号水平在不同引物组、样品和实验之间确实存在差异。
- 通过“输入量百分比”（% of input）法进行数据分析。
- 创建一个电子表格，包含样品名称以及qPCR反应后获得的原始Ct值。
- 通过从输入样品的原始Ct值中减去总提取染色质中作为输入部分所占比例的以2为底的对数值，对输入样品的原始Ct值进行校正。
注意：在本实验方案中，所减去的值为3.32，因为本方案中取总染色质的10%作为输入。Log2(10) 等于3.32。 - 通过将100乘以以2为底、指数为校正后的输入值与样品原始Ct值之差的幂运算结果，计算输入量百分比（表3）。
% 输入量 = 100×2 (校正输入值 – Ct(样品))
注意：该方法用于计算ChIP样品中特定DNA片段丰度与总分离染色质（输入样品）之间的关系。有关ChIP数据分析的更多细节，可参见Haring et al.8。
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结果
该ChIP实验方案可分为八个主要步骤，用于鉴定 体内 蛋白质-DNA 相互作用，包括植物材料的培养与收获、染色质交联、染色质分离、染色质片段化、通过免疫沉淀选择性分离目标蛋白质与DNA的复合物、蛋白质消化、DNA纯化以及qPCR分析（图1）。ChIP 实验方案中的一个关键步骤是通过交联反应固定 DNA-蛋白质相互作用。通常在植物 ChIP 中使用甲醛进行交联。甲醛可穿透组织，在 NH2 DNA中的蛋白质组或蛋白质与核苷酸16一种高效的核蛋白复合物固定方法 体内 需要确保甲醛进入植物细胞核内的染色质，因此必须将植物组织完全浸没在甲醛缓冲液中，以保证在免疫沉淀过程中能够有效富集蛋白-DNA复合物。拟南芥叶片表面覆盖有蜡质层，会阻碍交联剂进入细胞。此外，表皮毛容易在叶片表面形成气泡，阻止甲醛溶液渗入植物组织内部。为克服这一限制，本步骤中对样品施加真空处理，以防止固定液中气泡的形成，并促进甲醛充分渗透至所有细胞的细胞核内。经有效交联处理后的幼苗如图所示。 图2.
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讨论
本文所述的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案是一种可在拟南芥植株中可重复且强有力地分析蛋白质与特定DNA序列在体（in vivo）相互作用的技术。要成功鉴定目标蛋白的结合位点，关键在于选择合适的植物器官或发育阶段，以确保相关相互作用确实正在发生。此外，获得适当的植物材料固定效果，并通过超声处理实现染色质的最佳片段化，也至关重要。高效免疫沉淀目标蛋白或标签所需的高特异性抗体同样是实验成功的关键因素。
在植物中使用ChIP方法面临一些困难，这些困难与次生代谢物和细胞壁的存在有关，可能会干扰实验方案中的不同步骤。此外，植物器官结构复杂，通常包含多种细胞类型，而目标DNA结合蛋白在其中的分布或活性可能各不相同，这也限制了该方法的应用。因此，只要可能，最好在ChIP实验中使用已证实目标蛋白存在和/或具有活性的均质组织。含有多种组织的复杂植物材料往往会导致目标蛋白实际发挥作用的细胞类型被稀释。组织切片20已被用于植物中特定组织或细胞类型的研究。然而，在近年来，已开发出多种方法用于分离拟南芥中特定细胞类型的染色质8
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢《植物细胞》期刊允许使用该期刊发表的部分数据，以展示本文图4中的代表性结果。本研究得到了欧盟第七框架计划“玛丽·居里初期培训网络EpiTRAITS”（资助协议编号316965）以及西班牙经济与竞争力部（资助项目BIO2010-15589和BIO2013-43098-R）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS（Murashige 和 Skoog 基本盐混合物） | Sigma | M5524 | |
| 甲醛 37% | Sigma | F8775-25 | 在通风橱中使用 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 cOmplete ULTRA 片剂，迷你型，无 EDTA，EASYpack | 罗氏 | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard 超声破碎仪 | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| 甘氨酸 | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 与蛋白A或蛋白G偶联的Dynabeads磁珠 | Life Technologies | 10003D/10001D | 查看制造商说明’抗体亲和力测定手册 |
| Miracloth | 默克密理博 | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps 去垢剂溶液 | Life Technologies | 85112 | |
| （小鼠，大鼠，兔）…-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| 磁力架 - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac 多克隆抗体 - 优质 | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 树脂 | Bio-Rad | 142-2832 | |
| 蛋白酶K | Life Technologies | 17916 | |
| 抗c-Myc标签抗体，克隆4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | 罗氏 | 4707516001 |
参考文献
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