利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

摘要

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。

摘要

特定的代谢通路正逐渐被认识到是巨噬细胞亚群的关键特征。脂多糖（LPS）诱导的经典活化型M1或M_(LPS)巨噬细胞具有促炎特性，而白细胞介素-4（IL-4）诱导替代性巨噬细胞活化，这类所谓的M2或M_(IL-4)巨噬细胞则有助于炎症消退和伤口愈合。 recent证据表明，代谢重编程在调控M1和M2巨噬细胞极化过程中发挥着至关重要的作用。

在本研究中，采用细胞外通量分析仪评估初始状态、M1型和M2型极化的小鼠骨髓来源巨噬细胞的代谢特征。该仪器利用pH和氧气传感器，分别测量细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），这两项指标可分别反映糖酵解和线粒体氧化代谢水平。因此，可在单次实验中实时同步检测糖酵解和线粒体氧化代谢活动。

利用该技术，我们在此证明炎症性M1巨噬细胞表现出增强的糖酵解代谢和降低的线粒体活性。相反，抗炎性M2巨噬细胞显示出高水平的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），并具有增强的备用呼吸能力（SRC）。

本功能检测方法提供了一个研究框架，用于探究特定细胞因子、药理学化合物、基因敲除或其他干预措施如何影响巨噬细胞的代谢表型和炎症状态。

引言

巨噬细胞在几乎所有疾病中均发挥核心作用，但调控其表型的分子机制尚未完全阐明。巨噬细胞具有高度异质性，可响应微环境而呈现不同的表型¹。由LPS（+IFNγ）诱导的经典活化M1或M_(LPS)巨噬细胞可促进炎症反应，保护宿主免受多种微生物威胁²。其他研究则使用IFNγ单独或联合TNF作为刺激物，以诱导M1极化。IL-4和/或IL-13可诱导巨噬细胞的替代性活化，这些M2或M_(IL-4)细胞是正在进行的免疫反应的强效抑制者和调控者³。极化后的巨噬细胞在细胞代谢方面表现出明显差异：LPS活化的M1巨噬细胞发生代谢转换，增强糖酵解^4-6；相反，IL-4诱导的M2巨噬细胞则通过增强脂肪酸氧化（FAO）和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）获得持续能量供应^7-9。因此，代谢改变不仅是极化巨噬细胞亚群的特征，也是其实现正确极化和炎症调控的前提条件。重要的是，已有研究证明，抑制糖酵解或OXPHOS/FAO分别会损害M1或M2的活化^8,10。因此，识别巨噬细胞中的代谢变化可作为评估其极化状态和炎症潜能的工具。

因此，一种能够稳定检测巨噬细胞代谢的实验方法可用于预测药物、基因敲低或其他处理是否会影响巨噬细胞的极化状态与功能。在本视频中，采用细胞外通量分析仪对初始态、M1型和M2型巨噬细胞的生物能量学特征进行表征。

本文详细描述了一种优化的实验方案，可在单次检测中同时测定所有相关糖酵解参数（糖酵解、最大糖酵解和糖酵解储备）以及线粒体功能特征（总呼吸、基础线粒体呼吸、ATP生成、质子泄漏、最大呼吸和备用呼吸能力）。利用该实验体系，可对对照组与“经修饰”组（例如 基因敲低、转基因过表达或药物处理的细胞

方案

1. 骨髓来源巨噬细胞的培养与极化

1. 第0天：从6至10周龄的目标小鼠（本实验中为C57Bl/6）中分离股骨和胫骨。
2. 去除骨骼上的肌肉组织，并将骨骼置于盛有冰上预冷的PBS的9 cm培养皿中。
3. 将骨骼转移至盛有70%乙醇的9 cm培养皿中，轻轻振荡30秒。
4. 将骨骼转移至另一新鲜的9 cm培养皿中，其中盛有冰上预冷的无菌PBS。
5. 用无菌剪刀在两端剪断股骨和胫骨。
6. 使用10 ml注射器和25 G针头，以10 ml冰上预冷的无菌PBS冲洗骨骼，收集骨髓至50 ml离心管中。
7. 使用23 G针头将骨髓细胞转移至新的50 ml离心管中。
8. 使用25 G针头重复此步骤。注意：这些步骤用于去除细胞团块和骨残留物。
9. 在4 °C下以300 × g离心5分钟。
10. 弃去上清液，将细胞重悬于40 ml细胞培养基中（RPMI-1640，含2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）以及15%过滤后的L-929细胞（ATCC,CCL-1）条件培养基（含M-CSF），或使用10 ng/ml重组M-CSF替代L-929细胞条件培养基）。
    注意：L-929细胞条件培养基的制备方法此前已在本期刊2013年发表的文章中详细描述。¹¹
11. 将一只小鼠的细胞接种于两个15 cm培养皿中（请勿使用细胞培养处理过的培养板，因为巨噬细胞无法从这类塑料表面脱落），每皿加入20 ml培养基，置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。
12. 第3天，每皿加入10 ml新鲜细胞培养基，无需移除原有的20 ml培养基。
13. 第6天，将每皿中的旧培养基更换为20 ml新鲜培养基。此操作同时可去除非贴壁细胞。
14. 第8天：
    1. 在37 °C下用10 ml柠檬酸盐生理盐水（135 mM氯化钾加15 mM柠檬酸钠溶于H₂O中，经高压灭菌）孵育5分钟以解离细胞，随后用10 ml PBS洗涤。使用细胞计数仪在第8天计数成熟的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）。
    2. 通过显微镜观察或流式细胞术验证成熟（CD11b+ F4/80+）BMDM的形成。取10⁵个细胞，加入1/100稀释的抗CD16/CD32抗体，在100 µl PBS中室温封闭20分钟，随后加入1/200稀释的抗CD11b-FITC和1/200稀释的抗F4/80-APC-Cy7抗体，室温孵育，洗涤后进行流式细胞术分析。
       注意：小鼠骨髓来源巨噬细胞的培养方法此前已在本期刊由Ying et al.发表的文章中详细描述。¹¹
15. 在细胞培养微孔板中，每孔接种50,000个细胞（最佳细胞数量需自行优化），每孔加入100 µl培养基。背景校正孔（A1、A12、H1、H12）不接种细胞，仅加入培养基（无细胞）。提示：为获得最均匀的细胞层，建议将移液枪倾斜，沿孔壁中段缓慢加样。
16. 将细胞置于细胞培养超净台中室温静置1小时，以促进细胞均匀分布并减少边缘效应。使用显微镜监测贴壁情况，并在37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。
17. 接种3小时后，分别使用10 ng/ml LPS或20 ng/ml重组小鼠IL-4刺激细胞24小时，以诱导生成M1或M2型巨噬细胞。设置未处理的初始状态（M0）巨噬细胞作为对照。通过检测LPS诱导的IL-6、IL-12、TNF分泌（ELISA）以及IL-4诱导的精氨酸酶-1活性和/或MMR（CD206）、MGL（CD301）表面表达（流式细胞术）来评估M1和M2巨噬细胞的极化情况，方法如前所述^3,11。
    注意：此时可对细胞进行药物预处理，或使用其他因子刺激巨噬细胞。由于不同孔之间的差异可能较大，建议每组条件至少使用4个孔，理想情况下使用6个孔。

2. 细胞外通量分析的准备

1. 在进行检测前一天对传感器盒进行水化：
   1. 将传感器盒倒置放置在工具板旁边。
   2. 向工具板的每个孔中加入 200 µl 校准液，并将传感器盒缓慢放至工具板上，使传感器浸入校准液中。
   3. 确认校准液液面足够高以保持传感器完全浸没，然后将其置于不含 CO₂ 的 37 °C 培养箱中过夜。
2. 在检测当天按如下步骤配制检测培养基：
   1. 将 50 ml XF 基础培养基预热至 37 °C。
   2. 加入 500 µl 200 mM L-谷氨酰胺，使终浓度为 2 mM。
   3. 使用 1 N NaOH 将 pH 调整至 7.4，并用 0.2 µM 滤器过滤除菌，将检测培养基保持在 37 °C。
3. 轻柔地移除极化巨噬细胞的细胞培养基，并将其储存于 -20 °C 以备后续使用（例如 ELISA 检测以确认巨噬细胞极化状态）。用 100 µl 检测培养基洗涤细胞，每孔加入 180 µl 检测培养基，并在显微镜下确认细胞未被冲走。在检测运行前，将细胞培养板置于不含 CO₂ 的 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
4. 按照 表 1 所述配制 10 倍注射化合物混合液 A 至 D，预热至 37 °C，调节 pH 至 7.4，并过滤除菌。
   1. 将这些混合液中的所有化合物配制成其在细胞培养孔中终浓度的 10 倍，并针对每种细胞类型优化这些浓度。
5. 使用提供的加样导引工具，将已配制的 10 倍注射化合物混合液分别按指定体积（表 1）加入传感器盒的 A、B、C 和 D 孔中。

混合物/注射	化合物	配制10倍混合液所加体积 (µl)	测定培养基体积 (ml)	运行过程中注射体积 (µl)	测定体系中的终浓度
A	2.5 M (45%) 葡萄糖	300	2.7	20	25 mM
B	5 mM 寡霉素A (OM)	9	3.0	22	1.5 µM
C	5 mM FCCP	9	2.7	25	1.5 µM
	100 mM 丙酮酸钠溶液	300			1 mM
D	5 mM 抗霉素A (AA)	15	3.0	28	2.5 µM
	5 mM 鱼藤酮 (Rot)	7.5			1.25 µM

表1. 注射混合物。

3. 使用细胞外通量分析仪对极化M1和M2型BMDM进行生物能量表征

1. 使用检测向导创建检测模板，设置混合时间为2分钟，检测时间为3分钟，并在每次注射前（表1）以及最后一次注射后，至少进行3次混合和速率测量循环。
   注意：这些浓度适用于骨髓来源的巨噬细胞和Raw264.7巨噬细胞系，但应针对每种细胞类型进行优化。在FCCP混合物中添加丙酮酸盐是必要的，以支持最大呼吸作用。
2. 按下启动按钮开始运行，并按照仪器的提示操作。首先将装有水化探针的 cartridge 板装入仪器，以进行仪器校准，随后装入细胞板。
3. 检测完成后，小心弃去所有检测培养基，并将已分析的细胞培养微孔板储存在-20 °C，以备后续使用细胞增殖检测试剂盒进行细胞归一化处理，具体操作详见供应商说明书。
   1. 简要步骤：通过将组分B用蒸馏水稀释20倍制备1x细胞裂解缓冲液，并将化合物A用1x细胞裂解缓冲液稀释400倍。每孔加入200 µl，室温孵育5分钟，然后以约180 nm激发波长和约520 nm发射波长最大值检测荧光强度。
      注意：当处理非贴壁细胞或细胞贴壁性较差时，可选用直接细胞增殖检测试剂盒作为替代方案，因为该方案无需完全弃去检测培养基。然而，与本实验室所用方案相比，该直接检测法的灵敏度略低。
4. 荧光检测后，将每孔的细胞数量进行归一化处理，以所有未处理巨噬细胞孔的平均细胞数设为1，计算各孔细胞数的相对比值。
   注意：蛋白定量（例如使用BCA法）可作为细胞数量归一化的替代方法。但在本实验室实践中，该方法的灵敏度低于细胞增殖检测试剂盒。

结果

完成细胞外通量检测和细胞计数后，可对数据进行基于细胞数量的归一化处理并加以分析。通常可得到如图1A和图1B所示的ECAR和OCR曲线图。

葡萄糖注射后（A），ECAR 的升高代表糖酵解速率。使用寡霉素（oligomycin）抑制 ATP 合酶后 ECAR 进一步升高（B），可反映糖酵解储备和糖酵解能力（图 1A）。在分析 OCR 值时，寡霉素注射（B）可用于计算用于线粒体 ATP 合成的耗氧量。FCCP（C）可解除线粒体呼吸的偶联，相应的 OCR 测量值可提供最大呼吸能力和备用呼吸能力的信息。最后，注射鱼藤酮（Rot）和抗霉素 A（AA）可阻断线粒体复合体 I 和 III，残余的 OCR 代表非线粒体耗氧量（图 1B）。

图 1：由 XF 细胞外通量分析获得的代谢参数。（A）细胞糖酵解的以下参数由 ECAR 值（单位：mpH/min）计算得出：糖酵解、最大糖酵解能力及糖酵解储备。（B）OCR 测量值（单位：pMoles/min）用于计算线粒体功能的以下基本参数：基础呼吸、ATP 生成、质子漏、最大呼吸及备用呼吸能力。Gluc = 葡萄糖；OM = 寡霉素 A；FCCP = 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；AA = 抗霉素 A；Rot = 鱼藤酮 请点击此处查看该图的放大版本。

运行结束后，可将每个孔的ECAR和OCR测量值1至15导出至Excel，并可根据ECAR测量值按如下方法计算以下糖酵解参数：

非糖酵解性酸化 = avg. ECAR_(1,2,3)

糖酵解 = 平均 ECAR_(4,5,6) – 平均 ECAR_(1,2,3)

最大糖酵解能力 = avg. ECAR_(7,8,9) – avg. ECAR_(1,2,3)

糖酵解储备能力 = 平均 ECAR_(7,8,9) - 平均 ECAR_(4,5,6)

根据 OCR 速率，可确定以下代谢特征：

非线粒体呼吸 = 平均 OCR_(13,14,15)

基础呼吸 = avg. OCR_(4,5,6) - avg. OCR_(13,14,15)

ATP 生成量 = avg. OCR_(4,5,6) - avg. OCR_(7,8,9)

质子泄漏 = avg. OCR_(7,8,9) - avg. OCR_(13,14,15)

最大呼吸速率 = avg. OCR_(10,11,12) - avg. OCR_(13,14,15)

备用呼吸能力（SRC）= avg. OCR_(10,11,12) - avg. OCR_(4,5,6)

图 2：初始型（M0）、LPS 极化（M1）和 IL-4 极化（M2）巨噬细胞的代谢特征。 每项测量数据均显示 8 个独立孔的平均值及标准误（SEM）。(A) 不同极化状态（M1 和 M2）及初始型巨噬细胞（M0）的细胞外酸化率（ECAR，单位为 mpH/min）和 (B) 氧消耗率（OCR，单位为 pMoles/min）。所有测量值均根据细胞数量进行归一化处理（通过 CyQUANT 测定），并将初始型巨噬细胞的平均细胞数量设为 1。注射 A = 葡萄糖；B = 寡霉素；C = FCCP；D = 抗霉素 A + 鱼藤酮。 请点击此处查看该图的放大版本。

如图2A所示，用LPS激活巨噬细胞会诱导糖酵解代谢增强。当观察图2B中的氧消耗率（OCR）时，LPS与IL-4处理的巨噬细胞之间的差异更为明显。事实上，M_(LPS)巨噬细胞的最大氧化代谢受到强烈抑制，而IL-4则可诱导M2巨噬细胞的基础呼吸以及尤其是最大呼吸。需要注意的是，糖酵解增强相对特异地出现在M_(LPS)巨噬细胞中，这并不一定是M1型巨噬细胞的普遍特征，因为M_(IFNγ)巨噬细胞并未表现出糖酵解增强。

总体而言，该细胞外通量分析表明，IL-4诱导的M2型巨噬细胞具有增强的氧化代谢特征，尤其是具有较高的备用呼吸能力（SRC）；而LPS激活的巨噬细胞则表现出增强的糖酵解代谢，且不具备任何备用呼吸能力。

讨论

本实验室的研究目标是阐明巨噬细胞极化与功能的调控机制，最终旨在改善动脉粥样硬化及其他炎症性疾病的预后。¹²为评估巨噬细胞极化状态，通常需检测LPS（+IFNγ）诱导的M1型和IL-4诱导的M2型标志基因的表达水平（qPCR），测定IL-6、IL-12、TNF和NO的分泌量（通过ELISA和Griess反应），并分析IL-4诱导的CD71、CD206、CD273和CD301表面表达（流式细胞术）以及精氨酸酶活性。^3,13此外，凋亡检测（通过Annexin-V/PI染色）、吞噬作用检测（使用荧光乳胶微球和/或pHrodo） E. coli) 可进行泡沫细胞形成实验（通过DiI-oxLDL摄取、LipidTOX中性脂质染色）以评估巨噬细胞功能¹⁴此外，可进行细胞外通量分析，以检测极化巨噬细胞的生物能量谱，作为一种新的、替代性的功能读出方法。

本论文表明，巨噬细胞极化会诱导代谢重编程，其中脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞转变为以增强的糖酵解作为其能量来源。相反，白细胞介素-4（IL-4）诱导的M2型巨噬细胞则主要依赖线粒体氧化磷酸化来生成ATP。重要的是，代谢重编程不仅为M1和M2极化巨噬细胞的特定功能需求提供能量，代谢变化还会影响代谢物浓度，而这些代谢物是巨噬细胞表型的直接调控因子^10,15,16。因此，巨噬细胞代谢不仅是巨噬细胞极化状态的一个特征（如本文图2所示），同时也是不同巨噬细胞极化状态的驱动因素，这一新认知推动了近年来免疫代谢研究领域的迅速发展。

然而，对巨噬细胞代谢谱进行可靠检测仍然存在困难并具有局限性。本研究采用细胞外通量分析仪，仅需少量巨噬细胞即可实时可靠地测量糖酵解、糖酵解储备、最大糖酵解能力、非糖酵解性酸化、基础呼吸和最大呼吸、ATP生成、备用呼吸能力、质子泄漏以及非线粒体呼吸。

因此，我们对生产商的实验方案进行了如下修改和优化。标准的线粒体应激测试（#103015-100）建议使用含葡萄糖和丙酮酸的培养基，并采用三次注射的方案（寡霉素、FCCP、抗霉素A/鱼藤酮）。我们选择起始时使用不含葡萄糖和丙酮酸的培养基，将葡萄糖作为第一针通过A孔注入（类似于糖酵解应激测试 #103020-100），并将丙酮酸与FCCP解偶联剂一同通过C孔加入。通过这种方式，所有与糖酵解相关的关键参数均来自ECAR的第1至第9次测量，而所有与线粒体功能相关的信息则来自OCR的第4至第15次测量。

需要注意的是，在解偶联时为支持最大呼吸速率，必须同时加入丙酮酸和FCCP。在使用该联合方案之前，应验证2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）在检测后可将ECAR水平降低至基础值（1-3），并确认所记录的ECAR速率4-6确实来源于糖酵解。此外，应明确本文中使用的化合物浓度和细胞数量适用于骨髓来源的巨噬细胞及Raw264.7巨噬细胞系，其他细胞类型需进行相应优化。同时应注意，用于诱导骨髓来源巨噬细胞的M-CSF会促进细胞呈现类似M2型的抗炎表型。因此，骨髓来源巨噬细胞的实验结果可能与原代组织驻留巨噬细胞或在培养过程中无需添加M-CSF的巨噬细胞系的测量结果不完全可比。

与现有方法相比，该方案仅需极少量的巨噬细胞，即可快速获得几乎所有基本的细胞代谢特征。这使得实验后仍有足够数量的剩余细胞可用于其他免疫学检测，甚至用于生物能量分析的细胞在检测后仍可继续用于其他用途。此外，采用特定的96孔板格式，可同时实时评估多种实验条件。然而，不同孔之间的变异可能较为显著，因此通常建议每种条件至少使用4个复孔。考虑到这一局限性，所描述的细胞外通量分析仍可同时运行超过10种实验条件（n = 6），远多于传统技术所能实现的数量。

总体而言，本文提供了一种简便且可重复的功能检测方法，可用于测量极化巨噬细胞亚群中所有相关糖酵解和线粒体参数。该技术可作为未来评估巨噬细胞功能以及评价不同干预措施效应的应用手段。例如 基因敲低，新药 等等。) 对巨噬细胞的（代谢）表型的影响。因此，细胞外通量数据可与其他检测方法结合使用，以深入表征巨噬细胞的活化状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
23G 和 25G 针头	Becton Dickinson	#300800 和 #300600	用于冲洗骨髓
10 ml 注射器	Becton Dickinson	#307736	用于冲洗骨髓
培养皿	Greiner	#639161	用于培养骨髓细胞
CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒	Molecular Probes	#C7026	用于后续时间点的细胞定量（仅适用于贴壁细胞）
CyQUANT Direct 细胞增殖检测试剂盒	Molecular Probes	#35011	用于检测后立即进行细胞定量（非贴壁细胞）
XFe96 细胞培养微孔板	Seahorse Bioscience	#101085-004	96 孔板，用于细胞培养及检测
重组小鼠白细胞介素-4（IL-4）	Peprotech	#214-14-B	用于诱导巨噬细胞的替代性活化
脂多糖（LPS）	Sigma	#L2637	促炎性刺激物
Seahorse 传感器 cartridge	Seahorse Bioscience	#102416-100	包含用于 pH 和 O₂ 测量的探针
Seahorse XF 校准液	Seahorse Bioscience	#100840-000	需用于探针的过夜水化
XF 基础培养基	Seahorse Bioscience	#102353-100	无缓冲液培养基，可高效检测 pH 变化
L-谷氨酰胺	Life Technologies	#25030-081
D-(+)-葡萄糖	Sigma	#G8769	加入细胞后可促进糖酵解
寡霉素 A	Sigma	#75351	抑制线粒体 ATP 合酶
FCCP（羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙）	Sigma	#C2920	解偶联线粒体呼吸
100 mM 丙酮酸钠溶液	Lonza	#BE13-115E	可在无需糖酵解的情况下实现线粒体呼吸最大化
抗霉素 A	Sigma	#BE13-115EA8674	抑制线粒体复合体 III
鱼藤酮	Sigma	#BE13-115EA8674R8875	抑制线粒体复合体 I
Casy 细胞计数仪	Roche Diagnostics	#05 651 697 001	用于细胞计数的仪器
抗 CD16/CD32 抗体	eBioscience	#14-0161	用于流式细胞术中的 Fc 受体阻断
抗 F4/80-APC-eFluor780 抗体	eBioscience	#47-4801	用于巨噬细胞染色的抗体
抗 CD11b-FITC 抗体	eBioscience	#11-0112	用于巨噬细胞染色的抗体