基于胶体金的免疫层析试纸条的研制及其在鲸类肌红蛋白检测中的应用

摘要

本方案描述了两种IgG类单克隆抗体（mAbs）的制备，这些抗体对鲸目动物的肌红蛋白具有强反应性。这些单克隆抗体被应用于基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条，以区分鲸目动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。

摘要

本方案描述了一种基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条的研制方法，可用于区分鲸类与海豹及其他动物的肌红蛋白（Mb）。该试纸条可对鲸肉类进行快速、现场筛查，从而遏制其非法贸易与消费。研究开发了两种针对鲸类肌红蛋白具有反应性的单克隆抗体（mAbs）。通过分析多种动物肌红蛋白抗原反应区域的氨基酸序列，设计了两种合成肽（一种通用肽和一种特异性肽），并以此免疫制备单克隆抗体（亚类为IgG₁）。通过间接ELISA、Western blot和点印迹法筛选杂交瘤，获得目标mAbs。其中，CGF5H9特异性结合兔、犬、猪、牛、山羊及鲸类的肌红蛋白，但对鸡、金枪鱼和海豹的肌红蛋白亲和力极弱或无亲和力；CSF1H13可强效结合海豹和鲸类的肌红蛋白，但对其他动物无亲和力。本研究使用了来自四个科（须鲸科、海豚科、鼠海豚科和小抹香鲸科）的鲸类样本，结果表明，这两种单克隆抗体对不同鲸类的肌红蛋白均具有广泛的结合能力。将这两种抗体应用于夹心型胶体金免疫层析试纸条：识别多种物种的CGF5H9标记胶体金作为检测抗体，而包被于检测区的CSF1H13用于检测鲸类和海豹肌红蛋白的存在。对金枪鱼、鸡、海豹、五种陆生哺乳动物以及15种鲸类的肌肉样本进行了三重复检测。所有鲸类样本均呈阳性结果，其余样本均呈阴性结果。

引言

历史上，鲸豚类动物的肉在全球许多地区曾被食用，且至今仍存在此类消费行为¹。由于鲸豚类处于食物链较高营养级，其肉类中已知含有较高水平的汞及其他毒素²。因此，食用鲸豚类肉类不仅可能对孕妇等高风险人群造成健康问题，也可能影响一般人群³。此外，在鲸豚类肉类的加工和储存过程中，还可能受到人畜共患或潜在人畜共患病原体的污染⁴。即使是经验丰富的专业人员，也难以仅凭外观准确识别鲸豚类肉类。因此，需要一种可靠的科学鉴定方法，以区分鲸豚类肉类与其他肉类，从而有助于限制鲸豚类肉类的消费。

目前物种鉴定的方法包括分子技术和免疫学方法。分子技术（如聚合酶链式反应（PCR）和DNA测序）不仅可以用于鉴定生肉⁵和腐败样本⁶，还可用于鉴定加工食品，如熟香肠和饲料^7,8。免疫学方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA））通常应用于食品生产中，以检测猪肉⁹、牛肉¹⁰和鲶鱼¹¹等肉类成分。基于PCR的DNA分析可用于鲸豚类肉类的鉴定¹²，并已在日本、韩国、菲律宾、中国台湾、中国香港、俄罗斯、挪威和美国帮助遏制了鲸豚类肉类的非法国际贸易¹。这些方法有效且可靠，但通常需要数小时甚至数天才能完成，且操作步骤繁琐。鲸豚类肉类的鉴定通常依赖于分子技术，目前尚无可用的免....

方案

伦理声明：本研究遵循国际指南，并经国立嘉义大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，批准编号：99022。鲸类样本的使用已获得中国台湾行政院农业委员会的许可（研究许可编号：100M-02.1-C-99）。

1. 肌肉样品制备和SDS-PAGE

注：本研究使用了来自23个物种的肌肉样本，包括16种海洋哺乳动物、5种陆生哺乳动物、金枪鱼和鸡（表1）。鲸类肌肉样本来源于搁浅个体、渔业兼捕及执法查没。兔、大鼠、犬和鸡的肌肉组织来自中国台湾嘉义大学动物疾病诊断中心。牛肉、猪肉、羊肉和金枪鱼样本购自当地超市。港海豹（Phoca vitulina）的肌肉样本由远雄海洋公园提供。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离肌肉样本中不同分子量的可溶性蛋白质。

1. 所有样品在使用前均需在 -20 °C 下保存。
2. 将研钵预冷至 -20 °C，然后加入 3 g 冷冻肌肉样品。
3. 使用组织匀浆器，加入 10 ml 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）对样品进行匀浆处理。
4. 将匀浆后的样品在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液，并在使用前于 -20 °C 保存。
5. 配制 5 ml 的 5% 浓缩胶（含 3.07 ml 蒸馏....

结果

单克隆抗体特性

我们开发了两种IgG₁单克隆抗体（CGF5H9和CSF1H13），分别针对鲸类肌红蛋白（cetacean Mb）的两种合成肽段（MKASEDLKKHGNTVLC和AIIHVLHSRHPAEFGC），并利用这些抗体构建了一种夹心型胶体金免疫层析试纸条，用于快速检测鲸类肌红蛋白。图2显示，CGF5H9在约17 kDa的预测分子量处检测到鲸类及其他哺乳动物，呈现单一染色条带。小须鲸（Balaenoptera acutorostrata）的条带强度相较于其他鲸类较弱。金枪鱼、鸡和海豹未出现条带，而猪在约50 kDa处出现条带。尽管猪和金枪鱼存在多个非特异性条带，但CSF1H13具有高度特异性，仅在约17 kDa的预测分子量处与鲸类和海豹反应产生条带。小须鲸仅在1:10稀释度下显示强信号（数据未显示），在1:25稀释度下无信号。图2显示点印迹实验结果相同。

讨论

使用与载体蛋白偶联的合成肽作为免疫原，其效果显著优于相应的天然蛋白。对于基于夹心法的技术，由于单克隆抗体是利用已知相对位置的表位开发的，本研究中的两种单克隆抗体不太可能相互干扰其与目标抗原表位的结合。此外，用合成肽-载体偶联物免疫小鼠所产生的抗体与天然蛋白之间的反应性，可能强于由天然蛋白免疫所产生的抗体与天然蛋白之间的反应性¹⁹。因此，建议在免疫程序中使用合成肽偶联物，以有效产生合适的抗肽单克隆抗体。

蛋白质的结构主要涉及多肽链中氨基酸的序列。每个氨基酸都有其侧链，从而赋予特定的性质，而氨基酸序列的微小改变会导致结构变化。由于长度为10-20个氨基酸的肽段非常适合用于抗体的制备，因此在C末端区域合成了较长的肽段（免疫原），以确保核心抗原区域能够被有效识别。因此，可以有效区分不同动物肌红蛋白（Mbs）中导致表位结构差异的氨基酸残基。例如，图3A 显示了所述肽段设计使得CGF5H9与鲸类动物强烈反应，但与海豹无反应。另一个例子是CGF5H9对鸡和狗具有不同的亲和力，尽管鸡在核心抗原位点2的序列与狗完全相同。这表明外部区域的序列差异.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	含有 Protein G Sepharose 的离心柱
IsoStrip 小鼠单克隆抗体分型试剂盒	Roche	11493027001	分型条带，预先包被针对小鼠 Ig 亚类和轻链特异性的抗体
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
硝酸纤维素膜	Whatman	Z613630
抗体封闭液	LTK BioLaboratories		用于减少样本中非特异性 IgG 的非特异性结合
BCIP/NBT 磷酸酶底物	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP 微孔试剂盒（抗小鼠）	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA 板	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA 读板仪	Thermo Electron Corporation	51118170
胶体金（40 nm）溶液	REGA biotechnology Inc.		40–50 nm 适用于免疫层析条
牛血清白蛋白	Gibco	15561-020
快速检测免疫层析条打印机	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	仅适用于研发用途的小规模免疫层析条生产
层析条组件（NC 膜、样品垫（#33 玻璃纤维，S&S）、结合垫（#16S，S&S）和吸收垫（CF6，Whatman））	REGA biotechnology Inc.
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	用于制备抗原的油包水乳剂
丙烯酰胺、凝胶缓冲液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）	Protech		用于 SDS-PAGE 凝胶的制备
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad	1610436	SDS-PAGE 凝胶中蛋白质染色
Laemmli 上样缓冲液和 β-巯基乙醇	Bio-Rad	1610737, 1610710	在上样至 SDS-PAGE 凝胶前稀释蛋白质样品