对肌红蛋白鲸类检测基于金免疫层析胶体试纸条的研制

摘要

该方案描述了两种对鲸类动物肌红蛋白具有强烈反应的 IgG 类单克隆抗体 （mAb） 的开发。这些 mAb 应用于基于夹心格式的胶体金免疫层析试纸上，以区分鲸类动物与海豹和其他动物的 Mb。

摘要

该协议描述了基于三明治格式的胶体金免疫层析试纸的开发，该试纸可用于区分鲸类动物的肌红蛋白 （Mb） 与海豹和其他动物的肌红蛋白 （Mb）。该条带提供快速和现场的鲸豚肉筛查，从而限制其非法贸易和食用。开发了两种对鲸类动物 Mb 具有反应性的单克隆抗体 （mAb）。分析来自各种动物的 Mb 抗原反应区的氨基酸序列，以设计两种合成肽 （一种通用肽和一种特异性肽），然后提高 mAb（亚类 IgG₁）。mAb 选自间接 ELISA、western blot 和 dot blot 筛选的杂交瘤。CGF5H9 对兔、狗、猪、牛、山羊和鲸类动物的 Mbs 具有特异性，而对鸡、金枪鱼和海豹的 Mbs 表现出弱亲和力或无亲和力。CSF1H13 可以结合海豹和鲸类动物，具有很强的亲和力，但对其他动物没有亲和力。本研究使用了来自四个科 （Balaenopteridae、Delphinidae、Phocoenidae 和 Kogiidae） 的鲸类样品，结果表明这两种 mAb 对来自不同鲸类动物的 Mbs 具有广泛的结合能力。将这些 mAb 应用于夹心型胶体金免疫层析试纸上。CGF5H9 可识别许多物种，采用胶体金标记并用作检测抗体。涂在测试区的 CSF1H13 检测到鲸类和海豹 Mbs 的存在。来自金枪鱼、鸡、海豹、5 种陆生哺乳动物和 15 种鲸类动物的肌肉样本一式三份进行了测试。所有鲸类样本均显示阳性结果，所有其他样本均显示阴性结果。

引言

从历史上看，鲸类动物的肉在世界许多地方都有消费，这种消费一直持续到今天¹。由于鲸类动物的营养水平，已知它们的肉中存在高水平的汞和其他毒素²。因此，食用鲸豚肉不仅会给孕妇等高危人群带来健康问题，还会给普通人群带来健康问题³。此外，鲸类肉在其加工和储存过程中也可能发生人畜共患或潜在人畜共患病原体的污染⁴。即使是经验丰富的代理人也很难仅凭外观来识别鲸类肉类。因此，需要一种可靠的科学鉴定方法来区分鲸类肉类和其他肉类。这将有助于限制鲸类动物肉的消费。

目前的物种鉴定方法包括分子技术和免疫学方法。分子技术，如聚合酶链反应（PCR）和DNA测序，不仅可以从生肉⁵和分解样本⁶中识别样本，还可以从加工食品（如熟香肠和饲料^7,8）中识别样本。免疫学方法，如酶联免疫吸附测定 （ELISA），通常用于食品生产中，以检测猪肉⁹、牛肉¹⁰ 和鲶鱼¹¹ 等肉类的含量。基于 PCR 的 DNA 分析可用于鉴定鲸类动物肉¹²，并帮助防止了日本、韩国、菲律宾、台湾、香港、俄罗斯、挪威和美国的鲸类动物肉非法国际贸易¹。这些方法有效且可靠，但可能需要数小时或数天才能完成，并且涉及费力的步骤。鲸类肉类的鉴定通常基于分子技术，目前没有可用的免疫学方法。对于监管机构来说，非常需要开发一种可靠且快速的技术，该技术可用于现场识别鲸类肉类。

免疫层析试纸条用作检测工具，其优点是通过适合现场使用的简单方案快速产生结果。免疫层析试纸和 ELISA 的原理非常相似，包括抗体、抗原和标记物。许多不同的标记物，如胶体金、碳和乳胶，已被用于免疫层析试纸条的开发。目前，这种方法常用于检测抗生素、毒素、细菌和病毒¹³，但很少用于鉴定肉类中的蛋白质^14,15。在这里，我们提出了一种用于快速检测鲸类肌红蛋白 （Mb） 的侧流色谱酶免疫测定法。

方案

道德守则:由嘉义大学，批准编号的机构动物护理和使用委员会（IACUC）按照国际准则进行研究并批准:99022.鲸类动物样品的使用是由台湾农业委员会（研究许可证许可100M-02.1-C-99）。

1.肌肉样品制备和SDS-PAGE

注:从23种肌肉样本，包括16种海洋哺乳动物，5种陆栖哺乳类动物，金枪鱼和鸡肉在这项研究中（ 表1）使用。鲸类动物的肌肉样本来自个人搁浅，误捕渔业，和没收所得。兔，鼠，狗和鸡肌肉组织从嘉义大学的动物疫病诊断中心获得。牛肉，猪肉，羊肉，鱼和金枪鱼的样品从当地超市购买。斑海豹（ 斑海豹的肌肉样本）由远雄海洋公园提供。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来可溶性蛋白与肌肉样品在不同的分子量分离。

1. 在-20°C，直到使用存储所有样本。
2. 在-20℃的预冷砂浆。然后把3克冰冻肌肉样品进去。
3. 均质使用组织匀浆10毫升凉爽磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的样本。
4. 离心匀浆样品以10,000 xg离心在4℃下10分钟。收集上清液并储存于-20℃直到使用。
5. 制备5毫升5％浓缩胶（3.07毫升蒸馏水，1.25毫升液pH 6.8，625微升40％的丙烯酰胺，50微升10％过硫酸铵（APS）的，和5μl四甲基乙二胺的4倍上凝胶缓冲液（ TEMED））和10毫升15％分离胶（3.65毫升蒸馏水，2.5毫升4倍的pH值8.8下的凝胶缓冲液，3.75毫升40％的丙烯酰胺，加入100μl的10％APS，和4微升TEMED的）。
   1. 在电泳单元，倒入堆叠上分离凝胶（15％丙烯酰胺），后者已凝固后的顶部凝胶（5％丙烯酰胺）。插入在层叠凝胶的凝胶梳子。
6. 按照下列条件进行PAGE:初始运行条件:100伏，20分钟，并最终条件:120伏，40分钟。
7. 染色在室温下用考马斯亮蓝将凝胶进行30分钟，直到凝胶的颜色均匀的蓝色。
   注:染色完成后的凝胶不再是在染料溶液中可见。
8. 在室温下用乙酸溶液（10％）1小时脱色它。乐队将开始出现。继续在4℃过夜，脱色直到背景是清楚的。

2.多肽合成和单克隆抗体生产

1. 从GenBank中检索兆的氨基酸序列包括金枪鱼，鸡，鸵鸟，家养哺乳动物，密封和18种鲸类（ 表2）。
2. 使用对齐适当的软件¹⁶的序列:
   1. 通过选择对齐启动对齐浏览器:编辑/编译启动栏上的对齐 ;选择创建新对齐 ，然后单击确定 。将出现一个对话框，询问"你建立一个DNA或蛋白质序列比对？"
   2. 点击标有" 蛋白质 "按钮;选择数据:打开:检索文件 ，并选择序列文件序列 ;选择编辑:全选菜单命令，选择所有网站在数据创建多序列比对每一个设置序列。
   3. 选择路线:由ClustalW比从主菜单中对齐使用的ClustalW算法选择的序列数据对齐 ;选择"BLOSUM"作为蛋白质权重矩阵，然后点击确定按钮。
3. 分析序列比对:
   1. 专注于5抗原反应SITES ^17:站点1（AKVEADVA，15-22），现场2（KASEDLK，56-62），现场3（ATKHKI，94-99），现场4（HVLHSRH，113-119），与本站5（KYKELGY，145- 151），并发现鲸类动物中是保守的片段。 *（星号;在对齐共识符号（协议2.2.3））表明其中有一个单一的，完全保守残基的位置。在鲸类下面的保守片段发现:序列KASEDLKKHG（包括​​站2）和序列HVLHSRHP（包括站4）。
4. 根据序列分析，并用卵清蛋白蛋白（OVA）作为使用商业服务载体蛋白质缀合物合成候选序列片段。
   1. 添加疏水性氨基酸（ 例如 ，甲硫氨酸），以抗原反应部位的N-末端，用于防止所述肽从分解（ 例如 ，M-KASEDLKKHG）。
   2. 延长的抗原反应部位的C末端的核心抗原性位点暴露于免疫细胞。此外，conju栅极通过加入半胱氨酸（Cys，C）与C末端以OVA肽（ 例如 ，M-KASEDLKKHG-NTVL-C）。
5. 乳化完全弗氏佐剂免疫原1或弗氏不完全佐剂对免疫原2在PBS等体积各合成肽（3毫升，最终浓度30-50微克/ 100微升）。
6. 接种免疫原1（0.1毫克）皮下注射到各5只雌性BALB / c小鼠。
7. 在两周的时间间隔执行皮下加强注射用免疫原2五次，每次增压之前收集来自小鼠尾部剪裁取样测试血清。
8. 确定用于第一次筛选的血清滴度。
   1. 溶解100微克游离肽在25毫升反应缓冲液和试样50微升溶液中加入96孔板的每个孔中。加10微升偶联试剂溶液导入各孔中，并混合板。将培养板在室温下2小时。
   2. 除去孔中的内容，用蒸馏水洗各孔3次，并通过加入200微升的封闭溶液的遮挡板。孵育在室温下1小时。移除的内容，并用蒸馏水洗涤各孔3次。
   3. 用于确定第一轮筛选血清效价进行间接ELISA（协议5.1-5.7）。选择与脾集最高价（最高光密度）鼠标。
9. 脾收集前三天，接种0.1毫克免疫原1的皮下到小鼠呈现最高滴度。
10. 收集来自所选择的免疫的小鼠和保险丝与鼠骨髓瘤细胞F0（SP2 / 0-AG14）的脾细胞，以获得杂交瘤细胞单抗生成^18。
11. 融合后14天内，通过筛选倾向于使用间接ELISA免费合成肽的杂交瘤上清液（协议5.1-5.7）的反应选择阳性克隆。
12. 稀释细胞以适当数量，每孔为maximizING仅包含一个单一的克隆（稀释克隆）的孔的比例。
    1. 添加100μl的细胞培养基中，除了该空孔A1中的96孔板的所有孔中。
    2. 加入200微升细胞悬浮液至A1孔。然后迅速从A1到B1转移100微升，并轻轻吹打混合。重复这些1:2稀释了整个列，然后丢弃从H1 100微升，使其具有相同的体积，它上面的孔中结束。
    3. 额外的100微升培养基中加入1列有一个8通道微量。然后快速地从每个孔中在第1列使用相同的移液管转移100μl到那些在第2栏，并轻轻吹打混匀。
    4. 使用同样的技巧，重复这些1:2稀释整个板块。丢弃从每个孔中加入100μl在最后一列。
    5. 通过加入到每个100微升培养基以及将所有孔中以200微升的最终体积。解放军孵育德在加湿_的 CO ₂培养箱中不受干扰在37℃。
    6. 检查每口井，并标记包含只是一个单一的殖民地所有的井。开展两个或两个以上clonings直到包含单克隆井> 90％是阳性抗体产生。
13. 屏幕Western blot和斑点杂交（协议3.1-4.6）的克隆。然后，从水井到大型船舶的亚文化群体扩大获得单克隆抗体的细胞。一般每个克隆被转移到一个单一的井在12或24孔板中。
14. 测量单克隆抗体和牛，羊，猪，狗，兔，金枪鱼，鸡肉，密封肌肉提取物，并通过免疫印迹和斑点杂交（协议3.1-4.6）四个具有代表性的鲸类之间的亲和力。
15. 接种选定杂交瘤细胞（最多至3×10 ^6）腹膜内入小鼠以诱导腹水。腹部肿胀通常是明显在7-10天后注射杂交瘤细胞。收集流体使用皮下注射针（小于20号）。
16. 离心机腹水液（10,000×g离心10分钟）以去除细胞和碎片。通过0.45微米的过滤器过滤。添加1〜20毫升样品，15毫升结合缓冲液和3至5ml洗脱缓冲液进G蛋白Sepharose柱。收集含有从小鼠腹水纯化抗体的洗脱级分。
17. 确定由抗体分型试剂盒使用制造商的说明将抗体同种型。

3.免疫印迹

1. 制备2×上样缓冲液通过混合950微升2×Laemmli样品缓冲液中以50μl的BME的含有β巯基乙醇（BME）。使用多克隆兔抗人兆抗体时5（家畜和金枪鱼），以及:淡化肌肉上清液（协议1.1-1.4）的加样缓冲液以合适的比例以获得良好的信号:1:50（鲸类和密封）和1- 1:1（猪，兔，鸡和金枪鱼），1:5（牛，羊和狗）和1:25（鲸类和盖章）时，ntibody是从杂交瘤上清液。
2. 在95℃下5分钟热样品。负载样品到SDS-PAGE凝胶（4％丙烯酰胺堆叠和12％丙烯酰胺分离）与分子量标记物沿着所述孔中。在50运行5分钟的凝胶V，那么增加的电压为150V以完成运行在约1小时。
3. 放置在1×转移缓冲液的凝胶15分钟。分离的蛋白转移到硝酸纤维素（NC）膜后，他们用PAGE分离。传输可以在100V进行60-90分钟。
4. 制备阻断溶液:含有1×PBS中的0.1％吐温20，用5％的脱脂奶粉。在25毫升阻断在室温下溶液1小时的阻断NC膜。洗涤三次，每次5分钟，用吐温20（PBST）15毫升磷酸盐缓冲盐水。
5. 孵育在10毫升抗体稀释缓冲液在4℃下用5％封闭溶液稀释过夜膜与第一抗体（腹水或杂交瘤上清液）。
6. 洗MEMBRANË三次PBST再擦去过多的抗体。
7. 在温和搅拌，在室温下1小时，阻断溶液1250:在1孵育用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG的膜。
8. 再次洗膜，并在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/对 - 氮蓝四唑氯化物孵育它（BCIP / NBT）磷酸酶底物混合物为10至20分钟，直到显色。
9. 通过在蒸馏水几个变化洗膜终止反应。

4.点杂交

1. 稀释肌肉上清液（协议1.1-1.4）在PBST 5％牛血清白蛋白（BSA）以适当的比例获得良好的信号:1:5的家畜和金枪鱼和1:25鲸类和密封。现货5微升样品到膜上。最小的区域，该解决方案通过采用缓慢它渗透（一般3-4毫米直径）。
2. 在室温（干燥膜如<在30-60分钟的层流/ em>的），用封闭在培养皿溶液在室温下1小时阻止它，并用PBST清洗。
3. 孵育初级抗体的膜（单抗从杂交瘤上清液在1:10,000或腹水流体在1:100 000 5％封闭溶液稀释的）在室温下1小时。
4. 使用PBST洗涤膜3次，每次5分钟（1碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG:1.250，在5％封闭溶液）以除去过量的抗体，然后用第二抗体孵育它在室温下1小时。
5. 再次洗膜，并在10至20分钟的BCIP / NBT磷酸酶底物混合物，直至显色孵化它。
6. 通过在蒸馏水几个变化洗膜终止反应。

5.间接ELISA

1. 制备洗涤缓冲液（0.002 1M咪唑缓冲盐水0.02％吐温20）。洗净板洗涤3次每个接下来的步骤（协议5.2-5.5）之间的缓冲。
2. 准备1:25稀释涂料缓冲肌肉上清液（协议1.1-1.4）的。涂层的96孔ELISA板用100μl稀释的上清液在4℃下过夜，用在室温下1小时封闭缓冲液（在PBS中的1％BSA）阻止它。
3. 制备1:2000稀释，用稀缓冲纯化mAb的和稀释的mAb添加100μl的各孔中。将培养板在室温下1小时。
4. 加入山羊抗小鼠IgG缀合的辣根过氧化物酶（1:200稀释在稀释缓冲液中）进行进一步孵育。
5. 添加过氧化物酶底物至每孔（100μl/孔）并孵育10至15分钟。
6. 停止时通过彩色显影观察到过氧化物酶终止溶液（100μl/孔）的酶反应。
7. 读在使用微板分光光度计450nm处的光密度。

6.制备胶体金标记的单克隆抗体的

注意:胶体金溶液中，混合物的颜色应始终为红色。当黑色的沉淀物发现调节pH，单克隆抗体浓度，离心机转速。步骤6.1和6.2的优化步骤。

1. 添加纯化的检测的mAb（50微克/毫升，3微升）至100μl随着pH值从5-9不同的胶态金溶液。该保持红色两小时的最小pH值被视为最适PH值。注意:在此研究中，0.1M碳酸钾用于调整胶体金（40纳米）溶液至pH 8.0（最适pH）。
2. 至100微升胶体金溶液的加入各种数量的纯化检测mAb的（500微克/毫升，1-20微升）在pH 8.0。注意:在此研究中的最佳浓度为6微克/毫升（无黑色沉淀）。
3. 根据上述结果，添加的纯化检测单克隆抗体滴加至10ml胶体金溶液的60微克。轻轻乳化混合物在室温下10分钟。广告D 2毫升在PBS中的5％BSA的溶液（pH 7.4）至该混合物中并在室温下轻轻地乳化15分钟，以减少背景干扰。
4. 离心该混合物以10,000 xg离心在4℃下30分钟。
5. 小心地取出与未缀合的抗体上清液并暂停将所得丸粒在4毫升的PBST含有1％BSA和0.1％吐温20，并重复离心和悬浮液数次。
6. 暂停的最终沉淀在1ml PBST并储存于4℃直至使用。

7.免疫带建设

注意: 图1显示了免疫条设计。制备和组装<以延长储存寿命（20％相对湿度（1年）在低湿度的实验室环境条件下的条带）>。垫和膜的尺寸为:结合垫300毫米×10毫米，吸收垫300毫米×24毫米，样品垫300毫米×24毫米，NC膜300毫米×25毫米，粘贴板300毫米×80毫米。

1. 添加来自步骤6.6的胶体金标记的单克隆抗体溶液用微量至饱和的偶联物垫，然后组装前在37℃下使其干燥1小时。
2. 在控制区分配抗原特异性捕获在测试区单克隆抗体（500微克/毫升）和兔抗小鼠IgG（500微克/毫升），用于使用吸液管或免疫条打印机NC膜上检测的mAb。这两个区域之间保持距离（> 5mm）的，以避免干扰。
3. 粘贴复合垫，吸水垫和NC膜与双面胶带粘贴板。
   注意:通过约2mm重叠在NC膜的每一侧的垫。不适当带建设将导致不完全的测试。
4. 将在结合垫样品垫（2毫米），将其粘贴在纸板。
5. 创建具有切纸机6毫米宽的条带。包在铝箔袋干燥剂的条带，且他们在4℃储存直至使用。

8.交叉反应试验

1. 均匀0.03克原肌样品用竹签或研磨棒1ml的PBS（含有0.1％BSA）在1.5毫升离心管中。
2. 由端相对的测试区域保持条和样品垫部浸入试样5-10分钟，并直接观察结果。
   1. 可选:收集500微升上层清液，并转移到一个新的离心管中。
      注意:如果当带材被直接浸透到上清液中的信号并不明显建议此步骤。
3. 一式三份测试各种肌肉样品。
   注:在这里，我们测试的金枪鱼，鸡肉，密封，15种鲸类动物5种陆生哺乳动物。
4. 有五个独立的监察员8.3重复五次， 即在总使用575条。

结果

单克隆抗体的特点

我们分别开发了两种抗体₁单克隆抗体（CGF5H9和CSF1H13）承认两个合成肽（MKASEDLKKHGNTVLC和AIIHVLHSRHPAEFGC），鲸类MB，而这些被用来构建一个三明治式胶体金免疫层析试纸的快速检测鲸类MB的。 图2示出CGF5H9检测鲸类和其他哺乳动物作为在近似17 kDa的预测分子量的单个染色带。该小须鲸（ 鲸acutorostrata）显示出比其他鲸类的频段相对微弱带。乐队缺席金枪鱼，鸡和密封件，而在约50 kDa的一个带猪观察。虽然有用于猪和金枪鱼多个非特异性条带，CSF1H13是高度特异性的，因为它仅与在近似17 k的预测分子量鲸类和密封件作为带反应大。小须鲸只示出了在1:10与没有在1:25观察到的信号（数据未示出）的强烈信号。 图2示出了在斑点印迹相同的结果。

讨论

使用缀合载体蛋白的合成肽相比，它的同源蛋白是显着更有效。对于基于夹层技术，因为单克隆抗体是使用具有已知相对位置的表位开发的，在本研究的两种单克隆抗体不太可能彼此的与靶抗原表位的相互作用来干扰。此外，天然蛋白和合成肽结合物免疫的小鼠的抗体之间的反应性可能比天然蛋白和与天然蛋白¹⁹产生的抗体之间的反应性更强。因此，使用合成肽缀合物的建议适当抗肽mAb的有效免疫程序和生成。

蛋白质的结构主要涉及的氨基酸中的多肽链的序列。每个氨基酸都有其侧链导致特定性能，并且稍微改变的氨基ACIð序列导致结构的变化。因为具有10-20个氨基酸长度的肽是理想的抗体制剂，在C-末端区域的合成肽（免疫原）的长度增加至确保核心抗原区将被识别。因此，导致不同的表位结构的各种动物的Mbs的之间的氨基酸残基可以被有效地鉴别。例如， 图3A示出输入的肽设计，有助于CGF5H9与鲸类但负密封强烈反应。另一个例子是朝向CGF5H9的鸡和狗的不同亲和力虽然鸡具有相同序列，在核心抗原位点2的狗这表明在外部区域的序列差异可能导致结构的改变，从而可变结合抗原和抗体之间的亲和力。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲盐水	AMRESCO	J373
蛋白 G HP SpinTrap	GE 医疗保健	28-9031-34	离心柱，含有蛋白 G 琼脂糖凝胶
IsoStrip 小鼠单克隆抗体同种分型试剂盒	Roche	11493027001	Isotyping Strips，预包被亚类和轻链特异性抗小鼠 Ig 抗体
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
硝酸纤维素膜	Whatman	Z613630
抗体阻滞剂解决方案	LTK BioLaboratories		为了最大限度地减少样品中非特异性 IgG 的非特异性结合相互作用
BCIP/NBT 磷酸酶底物	KPL	50-81-00
蛋白检测仪 HRP 微孔试剂盒，抗小鼠	KPL	54-62-18
Nunc 免疫板 MaxiSorp ELISA 板	热 Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA 酶标仪	热 电子 Corporation	51118170
胶体金 （40 nm） 溶液	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm 适用于免疫条
牛血清白蛋白	Gibco	15561-020
快速检测免疫条带打印机	REGA biotechnology， Inc.	AGISMART RP-1000	仅适用于用于研发目的的小规模免疫试纸生产
条带组件（NC 膜、样品垫（#33 玻璃、S&S）、共轭垫（#16S、S&S） 和吸收垫 （CF6， Whatman））	REGA biotechnology Inc.
弗洛伊德s 辅助和不完全 Freund's 佐剂	Sigma-Aldrich	F5881， F5506	用于生产免疫原
烯酰胺、凝胶缓冲液、过硫酸铵 （APS）、四甲基乙二胺 （TEMED）		用于 SDS-PAGE
Laemmli 样品缓冲液和 &β;-巯基乙醇	Bio-Rad	1610737,1610710	在上样到 SDS-PAGE 凝胶之前稀释蛋白质样品