利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面动态进行实时成像

摘要

本实验方案的目的是演示如何利用变角落射荧光显微镜监测植物细胞表面荧光标记蛋白的动态变化，展示拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体细胞皮层中GFP标记的膜运输蛋白PATROL1呈现闪烁点状的动态行为。

摘要

植物的细胞表面是其感知环境信号的界面，会通过膜运输和细胞骨架重排等细胞生物学变化作出响应。对这类细胞内事件进行实时、高分辨率的图像分析，将有助于在分子水平上加深对植物细胞生物学的理解。可变角度落射荧光显微技术（VAEM）是一种新兴技术，可对植物细胞表面荧光标记的蛋白质提供高质量的时间序列图像。本文描述了VAEM样本制备、VAEM光学系统的调节、动态图像采集以及图像分析的实用操作步骤。以VAEM观察为例，展示了PATROL1蛋白动态行为的代表性结果。PATROL1是气孔运动所必需的一种蛋白，被认为参与拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体中质子泵向质膜的递送过程。对拟南芥（A. thaliana）子叶保卫细胞和副卫细胞进行VAEM实时观察发现，荧光标记的PATROL1在质膜上以点状结构形式存在数秒后消失。通过对VAEM动态图像数据进行线扫描分析（kymograph analysis），确定了这些点状结构存在时间（称为“驻留时间”）的分布情况。本文结合该实例讨论了VAEM技术的应用。

引言

植物细胞表面，包括质膜及其紧邻的细胞质，是植物细胞感知和整合胞外环境生物与非生物信号的主要区域。响应这些信号，细胞表面组分（包括质膜蛋白和皮层细胞骨架）会在数秒至数分钟的时间尺度上发生动态变化^1-4。因此，对细胞表面荧光蛋白进行实时、高分辨率成像，可揭示植物在分子水平上对环境信号的响应过程。

共聚焦激光扫描显微镜是确定荧光标记蛋白定位的有力工具³，但由于其成像时间相对较长，通常难以实时监测蛋白动态变化。一种用于植物细胞中蛋白质实时监测的新兴技术是可变角度落射荧光显微镜（VAEM），该技术源于通常用于全内反射荧光（TIRF）显微镜的设备。在TIRF显微镜中，荧光激发光源是一种隐逝光场，当激光入射角足够浅，使光在玻璃-水界面发生全内反射时即产生该光场。隐逝光场的穿透深度约为100 nm。TIRF显微镜是单分子成像的出色工具，例如可用于检测动物细胞中的胞吐作用⁵。然而，由于植物细胞具有较厚的细胞壁，隐逝光无法到达质膜或皮层细胞质。最近，植物细胞生物学家对TIRF显微镜设备进行了改进，发现当激光入射角度略大于诱导全内反射现象所需角度时，仍可激发植物细胞样品表面，从而实现高质量的植物细胞成像^6,7。通过调节激光入射角可改变激发光的照明深度，因此该技术被称为VAEM。由于在细胞壁-周质空间界面处仍有可能发生全反射，该光学系统也被称为可变角度TIRF显微镜（VA-TIRFM）⁷；但....

方案

1. 幼苗准备

1. 对种子进行灭菌。
   1. 将500 µl次氯酸钠（有效氯：5.0%）和1 µl 10% Triton X-100加入500 µl无菌水中，配制消毒溶液。
   2. 放置 约 10 转基因 拟南芥 携带 GFP-PATROL1 的种子⁸ 转移到1.5 ml离心管中。
   3. 加入1 ml 70%乙醇溶液，颠倒混匀5次，充分混匀。静置1分钟。
   4. 观察种子沉入管底。在洁净的超净工作台中，用微量移液器轻轻吸去70%乙醇，加入1 ml消毒液。轻轻颠倒混匀5次，静置5 min。 
   5. 清洗种子。在超净工作台内保持无菌条件下，用微量移液器轻轻吸去溶液，加入1 ml无菌水，重复此步骤5次。灭菌后的种子可置于4 °C的无菌水中保存2天。
2. 将灭菌后的种子播种于含0.5%凝胶糖固化的1/2 Murashige和Skoog培养基平板（pH 5.8）上⁹用两层医用胶带将培养皿盖子封好。
3. 在4 °C的低温培养箱中避光孵育过夜。
4. 将培养板转移至设定为23.5 °C、光照-黑暗周期为12小时/12小时（光强100 µmol m⁻² s⁻¹）的生长培养箱中⁻² 秒⁻¹ 白光下培养7天。待幼苗子叶长约1 mm时，即可收获。

结果

在本视频文章中，介绍了通过VAEM观察GFP-PATROL1的实验方案 A. thaliana 子叶气孔复合体细胞已提供。天空滴定法是一种简单的制备方法，可能有助于减少VAEM制备过程中气泡的产生 A. thaliana 子叶（图1）。对进入的激光过度倾斜和/或对样品进行VAEM观察时的z轴定位不当，将导致图像不清晰。若发生这种情况，建议根据落射荧光照明的判断，从样品正上方的位置重新开始调整。经过数天的VAEM观察实践后，应能够成功且常规地获取VAEM视频，例如此处展示的GFP-PATROL1斑点闪烁的视频。利用本文提供的kymograph分析方法，可对这些动态过程进行定量分析。 图412个独立的副卫细胞中，185个GFP-PATROL1斑点的驻留时间 A. thaliana 子叶被测量。拟合的密度函数显示，大多数GFP-PATROL1斑点在副卫细胞中停留的时间为2至10秒，峰值约为3.5秒（图4E），表明副卫细胞表面质子泵的快速胞吐/胞吞作用。

讨论

在本视频文章中，提供了用于监测和测量拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体上GFP-PATROL1斑点动态行为的实验方案。如本文所示，VAEM观察是活体成像植物细胞表面的有力工具。在本实验所采用的GFP-PATROL1监测条件下，进行1分钟视频采集时样品的荧光漂白非常轻微，这是因为VAEM光学系统中使用的高灵敏度EM-CCD允许使用相对较弱的激发激光。每次实验开始前的激光居中与聚焦对于成功的VAEM观察至关重要。使用者应在使用VAEM前接受所选显微镜公司专业人员的培训。

VAEM 显示，GFP-PATROL1 具有动态定位特征，在质膜上表现为一个静止的点状区室闪烁出现。如先前报道所述，荧光标记的质膜质子泵 AHA1 在 patrol1 突变体的保卫细胞和副卫细胞中发生错位^8,9。因此，VAEM 观察到的 GFP-PATROL1 点状结构的动态行为可能代表了质子泵向质膜的递送过程。这种 GFP-PATROL1 的动态行为使用传统的振镜式共聚焦激光扫描显微镜难以观察，表明 VAEM 在揭示植物细胞表面蛋白质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
倒置显微镜	Olympus	IX-73
TIRF装置	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF物镜	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
激光角度控制盒	Chuo Seiki	QT-AK
光泵浦半导体激光器	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH 激光器
510–550 nm 带通滤光片	Olympus	U-FBNA
EM CCD相机	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C接口相机放大倍率切换装置	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph软件	Molecular Devices	MetaMorph版本7.7.11.0
TIRF显微镜使用手册	Olympus	AX7385	说明：全内反射照明系统（2012年8月24日于日本印刷）
浸油	Olympus	Immersion Oil Type-F	ne = 1.518（23摄氏度）