具有可变角度荧光显微镜植物细胞表面动力学的实时成像

Summary

该协议的目的是演示如何监测荧光标记蛋白动力学上的植物细胞表面与可变角荧光显微镜，表示闪烁GFP标记PATROL1，一个膜运输蛋白质的点，在所述气孔络合物在细胞皮质拟南芥。

Abstract

植物的细胞表面是它感知环境线索的界面;它对细胞生物变化做出反应，如膜运输和细胞骨架重排。对此类细胞内事件进行实时和高分辨率图像分析将增加对分子水平植物细胞生物学的理解。可变角度落射荧光显微镜 （VAEM） 是一种新兴技术，可提供植物细胞表面荧光标记蛋白质的高质量延时图像。本文介绍了 VAEM 标本制备、VAEM 光学系统调整、视频捕获和图像分析的实用程序。作为 VAEM 观测的一个例子，介绍了 PATROL1 动力学的代表性结果。这是一种对气孔运动至关重要的蛋白质，被认为参与将质子泵输送到拟南芥气孔复合体中的质膜。VAEM 对拟南芥子叶中的保卫细胞和子细胞的实时观察显示，荧光标记的PATROL1在质膜上以点状结构出现数秒，然后消失。对 VAEM 电影数据的 Kymograph 分析确定了点状结构存在的时间分布（称为"停留时间"）。此示例将讨论 VAEM 的使用。

Introduction

植物细胞表面，包括质膜及其紧邻的细胞质，是植物细胞感知和整合来自细胞外环境的生物和非生物线索的主要区域。作为对这些线索的响应，包括质膜蛋白和皮质细胞骨架在内的细胞表面成分在几秒钟到^1-4 分钟的时间尺度上发生动态变化。因此，细胞表面荧光蛋白的实时和高分辨率成像可以在分子水平上阐明植物对环境线索的反应。

共聚焦激光扫描显微镜是确定荧光标记蛋白质定位的强大工具³，然而，由于其捕获时间相对较长，通常很难监测实时蛋白质动力学。可变角度落射荧光显微镜 （VAEM） 是一种用于实时监测植物细胞中蛋白质的新兴技术，它是通常用于全内反射荧光 （TIRF） 显微镜的设备的一种改编。在 TIRF 显微镜中，荧光激发光源是一个消逝的光场，当激光的入射角足够浅，可以在玻璃-水界面处完全在内部反射光时产生。倏逝光场的穿透深度约为 100 nm。TIRF 显微镜是单分子成像的出色工具，例如检测动物细胞中的胞吐作用⁵。然而，倏逝光无法到达植物细胞的质膜或皮质细胞质，因为它们具有较厚的细胞壁。最近，植物细胞生物学家对 TIRF 显微镜设备进行了改造，观察到激光的角度如果比用于诱导全内反射现象时的角度稍深，则可以激发植物细胞样品的表面，从而产生高质量的植物细胞成像^6,7。通过调整激光器的入射角来改变激发照明深度;因此，这种技术被描述为 VAEM。这种光学系统也称为可变角度 TIRF 显微镜 （VA-TIRFM），因为有可能....

Protocol

1.准备幼苗

1. 消毒的种子。
   1. 和1μl10％的Triton X-100，以500微升无菌水:通过添加500微升的NaClO（5.0％有效氯）制备灭菌溶液。
   2. 广场约 10株转基因A.拟南芥种子携带的GFP-PATROL1 ^8成 1.5毫升管中。
   3. 加入1毫升70％的乙醇溶液，并通过反转五次拌匀。离开1分钟。
   4. 观察种子沉到试管底部。在洁净层流柜，轻轻取出使用微量的70％的乙醇，并加入1毫升消毒液。颠倒五次拌匀，离开5分钟。
   5. 洗净的种子。在无菌条件下仍然工作在一个干净的长椅，轻轻取出使用微量的解决方案，并加入1毫升无菌水。重复此五次。所述灭菌的种子可以被存储在无菌水中，在4℃下2天。
2. 所以瓦特上的0.5％吉兰糖胶凝固1/2 MS培养基板（pH为^5.8）9的消毒的种子。胶带盖到使用外科带的两层板。
3. 孵育板在黑暗中，在4℃冷库室，O / N。
4. 板转移到生长室设定在23.5℃，用100微摩尔米^-2秒 -1白色灯12小时/ 12小时光照-黑暗周期，并培育7天。幼苗具有约1mm长子叶然后可以收获。

2.天空跌落安装子叶标本

注:在试样准备VAEM观测的一....

Results

在这个视频文章，为VAEM A中观察GFP-PATROL1的协议提供了拟南芥子叶气孔复杂的细胞。天空降安装是一个简单的制备方法，可以帮助减少在 A中的VAEM制剂气泡的发生拟南芥子叶（ 图1）。 Overtilting条目激光和/或标本VAEM z定位将提供的图像不清晰。如果出现这种情况，则建议立即从样品上方的位置重新开始，作为判断通过荧光照明。后的VAEM观察几天的经验，应该有可能获得VAEM电影成功和常规，如这里所示的GFP-PATROL1的斑点闪烁之一。使用kymograph分析在图4中，185的GFP-PATROL1点从12个独立的副卫细胞在A中的停留时间呈现拟南芥子叶进行了测量。拟合密度功能显示，大部分GFP-PATROL1点的子公司小区居住的人，为2至10秒，大约3.5秒（ 图4E）的峰值，这表明快速胞吐/质子泵内吞作用的子公司细胞表面。

Discussion

在这个视频文章，方案给出了监测和测量GFP-PATROL1点对拟南芥的气孔复杂的动态行为。如图所示，VAEM观察是一个强大的工具，用于植物细胞表面的实时成像。下这里使用的GFP-PATROL1监测实验条件下，有用于视频捕捉1分钟的样品中很少荧光光漂白，因为高度敏感的EM-CCD的允许使用在VAEM光学相对弱激发激光的。激光定心和聚焦，每次实验开始前，对于成功VAEM观察重要。用户应该由专业的工作人员从选择的显微镜公司使用VAEM前培训。

VAEM表明GFP-PATROL1具有动态定位与不动的点状隔室上闪烁质膜。荧光标记质膜的质子泵AHA1误升在patrol1突变保卫细胞和辅助细胞，ocalizes如先前报道^8,9。因此，VAEM-可视GFP-PATROL1点动力学可表示输送质子泵入质膜。 GFP-PATROL1这种动态行为很难想象使用常规电反射镜型共聚焦激光扫描显微镜，表示VAEM在植物细胞表面露出实时蛋白动力学的有用性。 GFP-PATROL1观测是在植物细胞生物学VAEM应用的一个例子。 VAEM将适用于众多的事件在细.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒置显微镜	奥林巴斯	IX-73
TIRF 装置	奥林巴斯	IX3-RFAEVAW
TIRF 物镜	奥林巴斯	UAPON 100 及时间;OTIRF	NA = 1.49
激光角度控制箱	中央精机	QT-AK
光泵半导体激光器	相干	蓝宝石TM LP USB 488-20 CDRH 激光器
510–550 nm 带通滤光片	奥林巴斯	U-FBNA
EM CCD 相机	滨松光子学	ImagEM C9100-13
C 接口相机放大倍率更换装置	奥林巴斯	U-TVCAC
MetaMorph 软件	分子设备	MetaMorph 版本 7.7.11.0
TIRF 显微镜手册	奥林巴斯	AX7385	说明：全内反射照明系统（2012 年 8 月 24 日在日本印刷）
浸油	奥林巴斯	浸油类型 F	ne = 1.518（23 度）