本实验方案的目的是演示如何利用变角落射荧光显微镜监测植物细胞表面荧光标记蛋白的动态变化，展示拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体细胞皮层中GFP标记的膜运输蛋白PATROL1呈现闪烁点状的动态行为。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
植物的细胞表面是其感知环境信号的界面，会通过膜运输和细胞骨架重排等细胞生物学变化作出响应。对这类细胞内事件进行实时、高分辨率的图像分析，将有助于在分子水平上加深对植物细胞生物学的理解。可变角度落射荧光显微技术（VAEM）是一种新兴技术，可对植物细胞表面荧光标记的蛋白质提供高质量的时间序列图像。本文描述了VAEM样本制备、VAEM光学系统的调节、动态图像采集以及图像分析的实用操作步骤。以VAEM观察为例，展示了PATROL1蛋白动态行为的代表性结果。PATROL1是气孔运动所必需的一种蛋白，被认为参与拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体中质子泵向质膜的递送过程。对拟南芥（A. thaliana）子叶保卫细胞和副卫细胞进行VAEM实时观察发现，荧光标记的PATROL1在质膜上以点状结构形式存在数秒后消失。通过对VAEM动态图像数据进行线扫描分析（kymograph analysis），确定了这些点状结构存在时间（称为“驻留时间”）的分布情况。本文结合该实例讨论了VAEM技术的应用。
引言
植物细胞表面，包括质膜及其紧邻的细胞质，是植物细胞感知和整合胞外环境生物与非生物信号的主要区域。响应这些信号，细胞表面组分（包括质膜蛋白和皮层细胞骨架）会在数秒至数分钟的时间尺度上发生动态变化1-4。因此，对细胞表面荧光蛋白进行实时、高分辨率成像，可揭示植物在分子水平上对环境信号的响应过程。
共聚焦激光扫描显微镜是确定荧光标记蛋白定位的有力工具3，但由于其成像时间相对较长，通常难以实时监测蛋白动态变化。一种用于植物细胞中蛋白质实时监测的新兴技术是可变角度落射荧光显微镜（VAEM），该技术源于通常用于全内反射荧光（TIRF）显微镜的设备。在TIRF显微镜中，荧光激发光源是一种隐逝光场，当激光入射角足够浅，使光在玻璃-水界面发生全内反射时即产生该光场。隐逝光场的穿透深度约为100 nm。TIRF显微镜是单分子成像的出色工具，例如可用于检测动物细胞中的胞吐作用5。然而，由于植物细胞具有较厚的细胞壁，隐逝光无法到达质膜或皮层细胞质。最近，植物细胞生物学家对TIRF显微镜设备进行了改进，发现当激光入射角度略大于诱导全内反射现象所需角度时，仍可激发植物细胞样品表面，从而实现高质量的植物细胞成像6,7。通过调节激光入射角可改变激发光的照明深度，因此该技术被称为VAEM。由于在细胞壁-周质空间界面处仍有可能发生全反射，该光学系统也被称为可变角度TIRF显微镜（VA-TIRFM）7；但本文采用VAEM这一术语，以符合其在植物研究中的首次报道6。
本实验方案旨在演示利用VAEM观察植物细胞表面荧光标记蛋白动态变化的实用操作步骤。此外，还描述了一种用于VAEM视频分析的图像分析流程，以量化分子的停留时间（存在持续时间）。GFP-PATROL1在气孔复合体细胞上的点状闪烁现象 拟南芥 子叶被用作示例。 PATROL1 通过正向遗传学方法被鉴定为气孔响应缺陷突变体的致病基因 拟南芥8PATROL1 是 MUNC-13 的植物同源蛋白，而 MUNC-13 是突触囊泡胞吐过程中的一种启动因子。8在环境信号（如光照或湿度）的刺激下，PATROL1 被认为可逆地调控质子泵向气孔复合体中质膜的运输。每个气孔复合体由一对保卫细胞组成。8 和副卫细胞9，且其气孔运动依赖质子泵。在这些细胞中，GFP标记的PATROL1定位于点状结构，该结构在质膜上停留时间少于1分钟9.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 幼苗准备
- 对种子进行灭菌。
- 将500 µl次氯酸钠（有效氯：5.0%）和1 µl 10% Triton X-100加入500 µl无菌水中，配制消毒溶液。
- 放置 约 10 转基因 拟南芥 携带 GFP-PATROL1 的种子8 转移到1.5 ml离心管中。
- 加入1 ml 70%乙醇溶液，颠倒混匀5次，充分混匀。静置1分钟。
- 观察种子沉入管底。在洁净的超净工作台中，用微量移液器轻轻吸去70%乙醇，加入1 ml消毒液。轻轻颠倒混匀5次，静置5 min。
- 清洗种子。在超净工作台内保持无菌条件下，用微量移液器轻轻吸去溶液，加入1 ml无菌水，重复此步骤5次。灭菌后的种子可置于4 °C的无菌水中保存2天。
- 将灭菌后的种子播种于含0.5%凝胶糖固化的1/2 Murashige和Skoog培养基平板（pH 5.8）上9用两层医用胶带将培养皿盖子封好。
- 在4 °C的低温培养箱中避光孵育过夜。
- 将培养板转移至设定为23.5 °C、光照-黑暗周期为12小时/12小时（光强100 µmol m⁻² s⁻¹）的生长培养箱中−2 秒−1 白光下培养7天。待幼苗子叶长约1 mm时，即可收获。
2. 子叶样本的悬滴法装片
注意：进行VAEM观察时，样品制备的一个重要因素是避免样品与盖玻片之间产生气泡。气泡会因折射率差异而显著降低VAEM的图像质量。我们称之为“悬滴法”的简单方法可用于避免拟南芥（A. thaliana）子叶与盖玻片之间形成气泡。该操作应在观察前立即进行。
- 在载玻片（尺寸：76×26 mm，厚度：1.0–1.2 mm）中央加入 30 µl 基础缓冲液 [pH 6.5 的 5 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸-三(羟甲基)氨基甲烷 (MES-Tris)、50 mM KCl、100 µM CaCl2]。
- 使用解剖剪从 7 日龄幼苗上取下一片子叶。将子叶的观察面朝上漂浮于基础缓冲液液滴中（图 1，步骤 1）。
- 在盖玻片（尺寸：18×18 mm，厚度：0.12–0.17 mm）中央加入 30 µl 基础缓冲液（图 1，步骤 2）。轻轻将盖玻片翻转倒置，表面张力可防止缓冲液滴脱落。用镊子夹住盖玻片一侧边缘，将对侧边缘置于载玻片上，使缓冲液滴大致位于子叶上方。
- 保持盖玻片一侧边缘接触载玻片，并继续用镊子夹持对侧边缘，调整盖玻片下缓冲液滴的位置，使其正对子叶样品上方（图 1，步骤 3）。松开镊子，让盖玻片自然落下，使液滴覆盖样品，制得无气泡的标本。
- 用无绒纸巾擦去多余的缓冲液。立即观察标本（见步骤 3）。
注意：无需密封样品。
3. VAEM 观察与电影采集
注意：本研究中使用的全内反射荧光显微镜系统9描述如下：倒置显微镜配备全内反射荧光装置和数值孔径为1.49的全内反射物镜。为实现对激光入射角度的计算机控制，使用一个控制盒。绿色荧光蛋白（GFP）由488 nm的光泵浦半导体激光器激发，荧光信号通过510–550 nm带通滤光片检测，以避免叶绿体自发荧光的干扰。测得光纤输出功率的最大值为13.0–13.5 mW。检测采用电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）相机头系统，并配备C型接口相机放大倍率转换装置。
- 根据制造商的说明校准激光的居中和聚焦。
注意：此步骤对于精确的VAEM观察至关重要。强烈建议定期按照适用于您显微镜的程序检查激光光路的调整。- 确定显微镜室天花板上无物镜时照明光路的中心位置。为标记该中心位置，可在天花板上贴一个彩色圆形标签（图2，步骤1、2）。
- 使用物镜照亮天花板（图2，步骤3、4）。将照明区域移动至中心位置（图2，步骤5）。聚焦激光（图2，步骤6）。微调聚焦后的激光位置，使其精确对准中心（图2，步骤7）。
- 将样品放置在显微镜载物台上，并使用明场照明选择待观察的细胞。
- 检查细胞中是否可观察到荧光蛋白，并使用落射荧光照明将z轴位置设定在细胞表面（图3A）。
- 进行VAEM观察。
- 通过控制器盒逐渐倾斜激光束的入射角度，同时仔细监测实时图像。初始时，图像会模糊不清（图3B）。
- 随着激光入射角度的增加，VAEM图像将逐渐变得清晰，最终获得清晰的图像（图3C和D）。此时停止增加激光角度。若荧光信号消失，则减小入射角度。
- 微调激光入射角度以获得更佳图像。微调z轴位置也可能改善图像质量。如有必要，调整光学参数（激光功率、波长和滤光片组）和图像传感器参数［图像尺寸、曝光时间、增益、数字化频率和电子倍增（EM）增益］。
注意：对于上述TIRF显微镜设备，典型参数如下：相机前镜头放大倍数：2X；激光输出功率：1.0 mW；图像尺寸：512 × 512 像素；曝光时间：100 msec；增益：5×；数字化频率：11 MHz；电子倍增增益：100。
- 使用商用显微镜软件以多页TIFF图像文件格式采集视频。此处视频为气孔细胞表面GFP标记的点状结构闪烁的动态图像。
注意：典型的图像采集条件如下：采集模式：流式写入内存；帧数：600；多页TIFF文件大小：约302 MB。
4. 使用 Fiji 软件通过 Kymograph 分析定量测定 GFP 标记点的停留时间
- 安装 Fiji（“Fiji is Just ImageJ”）软件10 按照作者的说明进行操作（http://fiji.sc/Fiji）。
- 运行 Fiji，使用 Fiji 菜单打开获取的多页 TIFF 文件文件-打开”.
- 在感兴趣区域使用 Fiji 工具栏菜单中的“线”工具划线直线选择工具”。可选择性地使用“分段线选择工具” 或 “自由手绘线条选择工具”。在本研究结果中，将一条100像素（对应8.0 µm）的直线置于一个副卫细胞上图 4A).
- 使用 Fiji 菜单制作 kymograph 图像图像堆栈-动态重新切片”（http://fiji.sc/Dynamic_Reslice）（图4B）。可选地， "垂直翻转“和“旋转90度”选项也可在复选框窗口中找到（本文所展示结果未使用该功能）。Kymograph图像中的x轴和y轴分别表示线段位置（100像素对应8.0 µm）和观察时间（600像素对应60秒）。如果kymograph图像效果不理想，可调整多帧图像上划线的位置及类型（直线、分段线或自由手绘线）。随着线段的调整，kymograph图像将动态更新。使用Fiji菜单将kymograph图像保存为TIFF文件文件-另存为-Tiff”.
- 测量斑点在时间轴方向上的长度。
- 为了进行降噪处理，使用 Fiji 菜单中的“高斯滤波器”对kymograph图像进行处理过程-滤镜-高斯模糊”。 “Sigma（半径)”参数是可调节的（本文所示结果采用1像素半径）。
- 通过阈值分割信号区域，使用 Fiji 菜单“图像-调整-阈值”.
注意：可选择的阈值算法有多种。在展示的结果中，选择了“Yen”算法（图4C). - 准备使用菜单测量斑点的时间（y）轴长度分析-设置测量”。检查“边界矩形”在“设置测量参数”窗口。理想情况下，设定的面积应尽可能小，以排除噪声。此处，最小面积设为50像素。使用菜单“测量”来测量该斑点在时间（y）轴方向上的长度分析-分析颗粒”。为了获得结果值并验证测量区域的可靠性，请勾选“显示结果” 和 “添加到管理器” 盒子。
- “中的数值高度”列是所测斑点的时间（y）轴长度图4D）。使用结果表格菜单“保存数值”文件-另存为”并使用统计软件包和/或电子表格软件对斑点图像持续时间的数据集进行计算和处理（图4E).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本视频文章中，介绍了通过VAEM观察GFP-PATROL1的实验方案 A. thaliana 子叶气孔复合体细胞已提供。天空滴定法是一种简单的制备方法，可能有助于减少VAEM制备过程中气泡的产生 A. thaliana 子叶（图1）。对进入的激光过度倾斜和/或对样品进行VAEM观察时的z轴定位不当，将导致图像不清晰。若发生这种情况，建议根据落射荧光照明的判断，从样品正上方的位置重新开始调整。经过数天的VAEM观察实践后，应能够成功且常规地获取VAEM视频，例如此处展示的GFP-PATROL1斑点闪烁的视频。利用本文提供的kymograph分析方法，可对这些动态过程进行定量分析。 图412个独立的副卫细胞中，185个GFP-PATROL1斑点的驻留时间 A. thaliana 子叶被测量。拟合的密度函数显示，大多数GFP-PATROL1斑点在副卫细胞中停留的时间为2至10秒，峰值约为3.5秒（图4E），表明副卫细胞表面质子泵的快速胞吐/胞吞作用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本视频文章中，提供了用于监测和测量拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔复合体上GFP-PATROL1斑点动态行为的实验方案。如本文所示，VAEM观察是活体成像植物细胞表面的有力工具。在本实验所采用的GFP-PATROL1监测条件下，进行1分钟视频采集时样品的荧光漂白非常轻微，这是因为VAEM光学系统中使用的高灵敏度EM-CCD允许使用相对较弱的激发激光。每次实验开始前的激光居中与聚焦对于成功的VAEM观察至关重要。使用者应在使用VAEM前接受所选显微镜公司专业人员的培训。
VAEM 显示，GFP-PATROL1 具有动态定位特征，在质膜上表现为一个静止的点状区室闪烁出现。如先前报道所述，荧光标记的质膜质子泵 AHA1 在 patrol1 突变体的保卫细胞和副卫细胞中发生错位8,9。因此，VAEM 观察到的 GFP-PATROL1 点状结构的动态行为可能代表了质子泵向质膜的递送过程。这种 GFP-PATROL1 的动态行为使用传统的振镜式共聚焦激光扫描显微镜难以观察，表明 VAEM 在揭示植物细胞表面蛋白质...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我感谢藤本正治博士在VAEM技术方面提供的建议。我也感谢伊庭康教授和桥本住本美美博士提供了GFP-PATROL1转基因植物，并就PATROL1相关问题进行了讨论。我感谢长泽清一郎教授对我工作的持续支持。本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（KAKENHI）项目编号25711017资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置显微镜 | Olympus | IX-73 | |
| TIRF装置 | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF物镜 | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| 激光角度控制盒 | Chuo Seiki | QT-AK | |
| 光泵浦半导体激光器 | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH 激光器 | |
| 510–550 nm 带通滤光片 | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD相机 | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C接口相机放大倍率切换装置 | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph软件 | Molecular Devices | MetaMorph版本7.7.11.0 | |
| TIRF显微镜使用手册 | Olympus | AX7385 | 说明：全内反射照明系统（2012年8月24日于日本印刷） |
| 浸油 | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518（23摄氏度） |
参考文献
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215(2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
