这是一种快速且成本效益高的方案，用于表达分泌型糖基化哺乳动物蛋白，并通过单步纯化获得足量均一的蛋白，适用于X射线晶体学及其他生物物理研究。
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方法文章
用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
分泌型哺乳动物蛋白的制备在结构与生物物理研究中可能具有挑战性，且耗时较长、成本较高。本文介绍了一种高效、低成本的哺乳动物细胞表达分泌蛋白并利用镍亲和层析一步纯化的方法。该系统基于悬浮培养的哺乳动物细胞大规模瞬时转染，显著缩短了蛋白制备周期，避免了诸如构建表达病毒或建立稳定表达细胞系等繁琐步骤。本方案采用价格低廉的转染试剂，这些试剂可通过简单的化学修饰自行制备，也可选用价格适中、转染效率更高且细胞毒性更低的商用试剂以提高产量。通过严密监测并维持培养基中的葡萄糖水平，可进一步提高蛋白产量。在表达阶段控制天然糖链的成熟过程，有助于获得更高比例的正确折叠且具有功能的哺乳动物蛋白，这类蛋白特别适合用于X射线晶体学研究。在某些情况下，仅需一步纯化即可获得足以用于结晶的高纯度蛋白，本文以实例对此进行了展示。
引言
在原子水平上理解蛋白质结构对于揭示生物通路和疾病的分子基础至关重要。X射线蛋白质晶体学是测定大分子结构最广泛使用且适用性最强的方法。该方法的主要挑战在于获得足够数量正确折叠且纯度足够的蛋白质。当研究经历特定翻译后修饰的分泌型哺乳动物蛋白质时，这一问题尤为突出。
由细菌表达的蛋白质是蛋白质数据库（Protein Data Bank）中已沉积的结晶蛋白质的主要来源1。细菌表达系统之所以被广泛采用，是因为其速度快、成本低，并且通常能产生较高的蛋白质产量。然而，在细菌中表达的哺乳动物蛋白质的胞外域常常不能正确折叠，此时需要进行复性及 extensive 纯化步骤，以获得均一折叠的蛋白质。此外，许多哺乳动物蛋白质需要翻译后糖基化修饰才能实现正确折叠2。尽管在酵母或昆虫细胞中进行表达和糖基化可部分解决折叠问题，但其翻译后修饰（包括糖基化）与哺乳动物细胞中的修饰存在显著差异3，导致所产生的蛋白质具有错误或非均一的修饰形式。
哺乳动物细胞表达所有必需的分子机制，以确保正确的翻译后修饰和蛋白质折叠；然而，由于产量有限以及试剂和耗材成本较高，大多数实验室通常不优先选择这些表达系统。聚乙烯亚胺（PEI）是一种标准的转染试剂，价格相对低廉，但具有显著的细胞毒性且转染效率较低，导致细胞培养基、DNA 和培养设备的成本增加。许多 PEI 的替代试剂价格过于昂贵。我们通过结合改进的细胞培养工具和化学修饰的 PEI，解决了上述问题，建立了一种快速且相对经济的分泌型哺乳动物蛋白表达方法，并可实现单步纯化。该方法稳定可靠，所得蛋白产量足以满足功能和生物化学研究的需求4，在某些情况下，获得的蛋白无需进一步纯化即可用于结晶。
本方案描述了多种技术，用于在悬浮培养的人胚胎肾（HEK）293F细胞中最大化分泌型哺乳动物蛋白的表达水平和产量。遵循本方案可显著提高转染效率（及成本效益）、蛋白表达量和纯化效果。通过单步开环反应在聚乙烯亚胺（PEI）上引入氨基甲酸酯基团所制备的改性PEI（PEI-TMC-25，其合成方法与性质详见参考文献5）可显著提高转染效率，降低阳离子膜破坏引起的细胞毒性，从而降低实验成本。此外，在培养基中添加补充物以提供葡萄糖和维生素，可显著提高细胞存活率和蛋白表达水平。对于糖基化蛋白的生产，使用无毒的甘露糖苷酶I抑制剂——千佛菌素（kifunensine）处理，可产生具有确定且未成熟糖链的蛋白，这些糖链可通过内切糖苷酶EndoHf切除，从而获得仅保留一个N-乙酰氨基葡萄糖（而非完整N-连接糖链）的蛋白6。最后，将蛋白分泌至无血清、化学成分明确的培养基中，有利于后续结构与生化研究的快速、简便纯化。采用一步法镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）树脂纯化，可去除上清液中大部分杂质，在某些情况下，所得蛋白纯度已足以用于结晶。
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方案
1. 用于大规模瞬时转染的质粒DNA毫克级制备
- 使用限制性酶切位点克隆或其他适当技术，将目标蛋白克隆至高拷贝数的哺乳动物表达载体中。
- 为获得最佳结果，建议使用 pHLsec 7 载体，该载体含有内置的C端6His标签、强启动子Kozak序列以及优化的分泌信号。
- 将质粒转化至感受态细胞中。
- 将20 µl感受态大肠杆菌细胞加入1 µg质粒DNA中，冰上孵育30分钟。
- 42 °C热激35秒，随后冰上孵育2分钟。
- 加入300 µl微生物培养基（SOC），在37 °C下以220 rpm振荡培养45分钟。
- 将细胞涂布于含适当抗生素筛选的琼脂平板上。
- 若质粒位于pHLsec载体中，请使用100 µg/ml羧苄青霉素。
- 在250 ml LB培养基（含100 µg/ml抗生素羧苄青霉素）中培养菌落，37 °C、220 rpm振荡过夜（O/N）。
- 根据生产商说明书，使用Hi-Speed Plasmid Maxi试剂盒从菌液中纯化质粒DNA。
- 使用缓冲液EB（10 mM Tris-Cl，pH 8.5）洗脱DNA，而非缓冲液TE。
- 将纯化的质粒按转染所需量分装，并于-20 °C保存。
2. 293F 细胞的大规模培养与瞬时转染
- 在1 L 293F培养基中加入10 ml谷氨酰胺和5 ml青霉素-链霉素溶液（均为100倍浓缩液），混匀后于4 °C保存。在无血清条件下，5 ml青霉素-链霉素溶液的浓度已足够，较低的抗生素浓度有助于提高转染过程中细胞的存活率，从而提升蛋白产量。
- 将293F细胞接种于1 L聚碳酸酯带挡板的锥形瓶中，培养体积为300 ml，使用透气盖，在标准组织培养孵育箱中于37 °C、8% CO2条件下振荡培养。
- 转染前一天，将细胞稀释至密度为5 × 105/ml。
- 转染当天，向培养基中加入占总体积10%的2% w/v Cell Boost溶液（溶于293F培养基中）。
- 按照制造商说明，使用葡萄糖检测仪测定葡萄糖浓度，并根据需要添加补充物，使葡萄糖浓度维持在500 mg/dL。
- 在此步骤中加入kifunensine（终浓度为1 µg/ml），以调控蛋白的糖基化修饰。
- 根据每1 × 106个细胞使用1 µg质粒的比率计算所需DNA体积。在无菌条件下，将DNA稀释于5 ml无血清培养基中。
- 根据每1 µg质粒使用2 µl转染试剂的比率计算所需转染试剂体积。在无菌条件下，将转染试剂（PEI-TMC-25）稀释于5 ml无血清培养基中。
- 以每次1 ml的方式将转染试剂加入DNA溶液中，每加一次轻柔混匀。室温下孵育30 min ，使转染试剂-DNA复合物形成，随后逐滴加入细胞培养物中。
- 让转染后的细胞表达蛋白72–96小时。每天补充约10%体积的Cell Boost培养基，或根据需要补充，以维持葡萄糖浓度在400–600 mg/dL范围内。
3. 纯化
- 将培养物倒入离心瓶中，在1,300 × g条件下离心20分钟以沉淀细胞，然后收集上清液。如有必要，再次离心和/或使用0.22 µm滤膜过滤上清液以使其澄清。
- 加入10%体积的10× Ni-NTA结合缓冲液（1.5 M NaCl，0.5 M K2HPO4，0.1 M Tris pH 8.5，50 mM咪唑）。
- 在层析柱中加入2 ml Ni-NTA悬浊液，构建重力柱，并用10个柱体积（CV）的1×结合缓冲液进行平衡。如条件允许，所有层析柱操作均在4 °C环境中进行。或者，在上柱前将蛋白溶液和所有缓冲液置于冰上预冷，并在操作过程中将蛋白及流出液保持在冰上。
注意：Ni-NTA悬浊液的树脂体积浓度为50%，厂家标明的结合能力为50 mg/ml。Ni-NTA微珠可重复再生并多次使用。 - 将上清液缓慢流过树脂，收集穿流液。重复此步骤一次。
- 用10个柱体积的洗涤缓冲液（300 mM NaCl，50 mM K2HPO4，20 mM咪唑 pH 8）进行洗涤。
- 用5个柱体积的洗脱缓冲液（300 mM NaCl，50 mM K2HPO4，250 mM咪唑 pH 8）洗脱蛋白。
- 如需去糖基化：
- 对于终体积为0.5 ml的样品，使用离心浓缩装置将洗脱液浓缩至0.43 ml。若出现沉淀，于16,000 × g、4 °C条件下离心去除杂质。
- 加入50 µl 500 mM 柠檬酸钠（Na-Citrate）pH 5.5。
- 加入20 µl EndoHf（1 × 106 U/ml），室温孵育2小时。
注意：该酶在37 °C时活性最佳，但可能导致浓缩蛋白发生聚集。若通过SDS-PAGE或免疫印迹检测发现去糖基化不完全，可延长室温孵育时间。该酶在4 °C无活性。 - 去除EndoHf：用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或最终储存缓冲液将Amylose树脂洗涤3次。将蛋白溶液与树脂在4 °C孵育1小时。于1,000 × g离心5分钟以沉淀树脂微珠，收集上清液。
- 使用适当截留分子量的离心过滤装置浓缩蛋白，并置换至储存缓冲液（150 mM NaCl和20 mM HEPES pH 7.5）中。
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结果
本文随后展示了该表达系统应用于人源髓系细胞表达触发受体2（hTREM2，残基19-132）的一种分泌型13 kDa免疫球蛋白（Ig）结构域的结果。TREM2是一种I型跨膜蛋白，包含一个具有两个二硫键和两个N-连接糖基化位点的单一胞外Ig结构域。与许多其他Ig结构域蛋白不同8，TREM2无法从大肠杆菌包涵体中有效复性9。后续的定点突变实验确认，N-连接糖链对于其正确表达和正确折叠是必需的。为了便于开展结构与功能研究，采用标准的分子生物学技术将TREM2插入pHLsec载体，并在C末端添加6His标签7。在HEK293F细胞中进行瞬时表达，并使用kifunensine处理，所得蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化（图1B，泳道2），随后对样品进行去糖基化处理，以获得天然折叠且均一的蛋白（图1B，泳道3）。在293F细胞中表达TREM2的产量为5-10 mg/L（每百万个转染细胞可获得5-10 µg蛋白）。将蛋白置换至储存缓冲液后，成功获得晶体（图1C）。尽管最终纯度约为80%，这...
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讨论
HEK 293F 细胞可高效表达需要翻译后修饰的蛋白质。该系统能够快速、可扩展地表达正确折叠的蛋白质，这些蛋白质含有二硫键、糖基化和磷酸化等修饰，而这些修饰若使用常规表达工具则通常无法实现。此外，通过共转染多个质粒，该系统还可用于多蛋白复合物的表达与纯化。除 TREM2 外，本实验室已广泛将该系统用于其他目标蛋白的功能研究。 关键词：HEK 293F 细胞，蛋白质表达，翻译后修饰，二硫键，糖基化，磷酸化，多蛋白复合物，共转染，质粒，TREM210,11哺乳动物细胞还提供无内毒素的蛋白质表达，适用于 体内 用于实验或生产天然折叠抗原，以生成构象依赖性抗体。
最佳的细胞活力和转染条件是实现高效蛋白质表达的关键。为了提高细胞活力，应使用低代次的细胞培养物，并添加细胞培养补充剂，同时降低生长培养基中的抗生素浓度。改良型PEI-TMC-25对大多数蛋白质具有适宜的转染效率；然而，也有其他价格适中、转染效率更高且细胞毒性更低的替代试剂可供选择。Hype 5（Oz Bioscience）相较于PEI或其他转染试剂，在成本显著低于昂贵试剂（如293fect...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）R01-HL119813（授予 T.J.B.）、美国肺脏协会 RG-196051（授予 T.J.B.）、CIMED 试点与可行性研究资助（授予 T.J.B.）、美国心脏协会博士前奖学金 14PRE19970008（授予 Z.Y.）和 15PRE22110004（授予 D.L.K.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养瓶 | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle 培养基 | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | 用于替代谷氨酰胺 |
| Hype 5 转染试剂 | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin 转染试剂 | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI 转染试剂 | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| 淀粉树脂 | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | 细胞培养添加剂 |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | 葡萄糖监测系统 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | 用于DNA转染的无血清培养基 |
| LB培养基（Luria Broth） | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 感受态细胞 | Sigma-Aldrich | G2919 |
参考文献
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- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
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