方法文章

用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化

DOI：

10.3791/53445

⸱

2015年12月23日

 ,  , 
1Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, 3Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, 4Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, 5Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, 6Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 7Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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这是一种快速且成本效益高的方案，用于表达分泌型糖基化哺乳动物蛋白，并通过单步纯化获得足量均一的蛋白，适用于X射线晶体学及其他生物物理研究。

摘要

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分泌型哺乳动物蛋白的制备在结构与生物物理研究中可能具有挑战性，且耗时较长、成本较高。本文介绍了一种高效、低成本的哺乳动物细胞表达分泌蛋白并利用镍亲和层析一步纯化的方法。该系统基于悬浮培养的哺乳动物细胞大规模瞬时转染，显著缩短了蛋白制备周期，避免了诸如构建表达病毒或建立稳定表达细胞系等繁琐步骤。本方案采用价格低廉的转染试剂，这些试剂可通过简单的化学修饰自行制备，也可选用价格适中、转染效率更高且细胞毒性更低的商用试剂以提高产量。通过严密监测并维持培养基中的葡萄糖水平，可进一步提高蛋白产量。在表达阶段控制天然糖链的成熟过程，有助于获得更高比例的正确折叠且具有功能的哺乳动物蛋白，这类蛋白特别适合用于X射线晶体学研究。在某些情况下，仅需一步纯化即可获得足以用于结晶的高纯度蛋白，本文以实例对此进行了展示。

引言

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在原子水平上理解蛋白质结构对于揭示生物通路和疾病的分子基础至关重要。X射线蛋白质晶体学是测定大分子结构最广泛使用且适用性最强的方法。该方法的主要挑战在于获得足够数量正确折叠且纯度足够的蛋白质。当研究经历特定翻译后修饰的分泌型哺乳动物蛋白质时，这一问题尤为突出。

由细菌表达的蛋白质是蛋白质数据库（Protein Data Bank）中已沉积的结晶蛋白质的主要来源1。细菌表达系统之所以被广泛采用，是因为其速度快、成本低，并且通常能产生较高的蛋白质产量。然而，在细菌中表达的哺乳动物蛋白质的胞外域常常不能正确折叠，此时需要进行复性及 extensive 纯化步骤，以获得均一折叠的蛋白质。此外，许多哺乳动物蛋白质需要翻译后糖基化修饰才能实现正确折叠2。尽管在酵母或昆虫细胞中进行表达和糖基化可部分解决折叠问题，但其翻译后修饰（包括糖基化）与哺乳动物细胞中的修饰存在显著差异3，导致所产生的蛋白质具有错误或非均一的修饰形式。

哺乳动物细胞表达所有必需的分子机制，以确保正确的翻译后修饰和蛋白质折叠；然而，由于产量有限以及试剂和耗材成本较高，大多数实验室通常不优先选择这些表达系统。聚乙烯亚胺（PEI）是一种标准的转染试剂，价格相对低廉，但具有显著的细胞毒性且转染效率较低，导致细胞培养基、DNA 和培养设备的成本增加。许多 PEI 的替代试剂价格过于昂贵。我们通过结合改进的细胞....

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方案

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1. 用于大规模瞬时转染的质粒DNA毫克级制备

  1. 使用限制性酶切位点克隆或其他适当技术，将目标蛋白克隆至高拷贝数的哺乳动物表达载体中。
    1. 为获得最佳结果，建议使用 pHLsec 7 载体，该载体含有内置的C端6His标签、强启动子Kozak序列以及优化的分泌信号。
  2. 将质粒转化至感受态细胞中。
    1. 将20 µl感受态大肠杆菌细胞加入1 µg质粒DNA中，冰上孵育30分钟。
    2. 42 °C热激35秒，随后冰上孵育2分钟。
    3. 加入300 µl微生物培养基（SOC），在37 °C下以220 rpm振荡培养45分钟。
    4. 将细胞涂布于含适当抗生素筛选的琼脂平板上。
      1. 若质粒位于pHLsec载体中，请使用100 µg/ml羧苄青霉素。
  3. 在250 ml LB培养基（含100 µg/ml抗生素羧苄青霉素）中培养菌落，37 °C、220 rpm振荡过夜（O/N）。
  4. 根据生产商说明书，使用Hi-Speed Plasmid Maxi试剂盒从菌液中纯化质粒DNA。
    1. 使用缓冲液EB（10 mM Tris-Cl，pH 8.5）洗脱DNA，而非缓冲液TE。
    2. 将纯化的质粒按转染所需量分装，并于-20 °C保....

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结果

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本文随后展示了该表达系统应用于人源髓系细胞表达触发受体2（hTREM2，残基19-132）的一种分泌型13 kDa免疫球蛋白（Ig）结构域的结果。TREM2是一种I型跨膜蛋白，包含一个具有两个二硫键和两个N-连接糖基化位点的单一胞外Ig结构域。与许多其他Ig结构域蛋白不同8，TREM2无法从大肠杆菌包涵体中有效复性9。后续的定点突变实验确认，N-连接糖链对于其正确表达和正确折叠是必需的。为了便于开展结构与功能研究，采用标准的分子生物学技术将TREM2插入pHLsec载体，并在C末端添加6His标签7。在HEK293F细胞中进行瞬时表达，并使用kifunensine处理，所得蛋白通过Ni-NTA亲和层析纯化（图1B，泳道2），随后对样品进行去糖基化处理，以获得天然折叠且均一的蛋白（图1B，泳道3）。在293F细胞中表达TREM2的产量为5-10 mg/L（每百万个转染细胞可获得5-10 µg蛋白）。将蛋白置换至储存缓冲液后，成功获得晶体（图1C）。尽管最终纯度约为80%，这.......

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讨论

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HEK 293F 细胞可高效表达需要翻译后修饰的蛋白质。该系统能够快速、可扩展地表达正确折叠的蛋白质，这些蛋白质含有二硫键、糖基化和磷酸化等修饰，而这些修饰若使用常规表达工具则通常无法实现。此外，通过共转染多个质粒，该系统还可用于多蛋白复合物的表达与纯化。除 TREM2 外，本实验室已广泛将该系统用于其他目标蛋白的功能研究。 关键词：HEK 293F 细胞，蛋白质表达，翻译后修饰，二硫键，糖基化，磷酸化，多蛋白复合物，共转染，质粒，TREM210,11哺乳动物细胞还提供无内毒素的蛋白质表达，适用于 体内 用于实验或生产天然折叠抗原，以生成构象依赖性抗体。

最佳的细胞活力和转染条件是实现高效蛋白质表达的关键。为了提高细胞活力，应使用低代次的细胞培养物，并添加细胞培养补充剂，同时降低生长培养基中的抗生素浓度。改良型PEI-TMC-25对大多数蛋白质具有适宜的转染效率；然而，也有其他价格适中、转染效率更高且细胞毒性更低的替代试剂可供选择。Hype 5（Oz Bioscience）相较于PEI或其他转染试剂，在成本显著低于昂贵试剂（如293fect.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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本工作由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）R01-HL119813（授予 T.J.B.）、美国肺脏协会 RG-196051（授予 T.J.B.）、CIMED 试点与可行性研究资助（授予 T.J.B.）、美国心脏协会博士前奖学金 14PRE19970008（授予 Z.Y.）和 15PRE22110004（授予 D.L.K.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养瓶GeneMateF-5909B
293 Freestyle 培养基Gibco/Life Technologies12338-018
GlutaMAXGibco/Life Technologies35050-061用于替代谷氨酰胺
Hype 5 转染试剂Oz BiosciencesHY01500
293fectin 转染试剂Life Technologies12347019
PEI 转染试剂Sigma-Aldrich408727
质粒大提试剂盒Qiagen12162
Ni-NTA Superflow Qiagen30430
Endo HfNEBP0703L
淀粉树脂NEBE8021S
Cell Boost R05.2HyCloneSH30584.02细胞培养添加剂
GlucCellCESCO BioengineeringDG2032葡萄糖监测系统
Opti-MEMLife Technologies519850.91用于DNA转染的无血清培养基
LB培养基（Luria Broth）Life Technologies10855-001
GC10 感受态细胞Sigma-AldrichG2919

参考文献

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  1. Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
  2. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15

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