活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

摘要

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。

摘要

体内 成像技术为研究细胞及亚细胞结构在其天然环境中的动态行为提供了前所未有的机会。在哺乳动物等高等脊椎动物中开展此类成像实验通常需要通过外科手术进入目标系统。而斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，可避免此类侵入性操作，实现对完整生物体的成像。事实上，斑马鱼现已成为利用活体成像技术可视化动态细胞行为的成熟模型 体内 显微镜技术在从增殖到迁移和分化的多种发育过程中得到广泛应用。近年来，斑马鱼越来越多地被用于研究亚细胞事件，包括线粒体运输和中心体动态。利用荧光蛋白对这些亚细胞结构进行遗传标记的相对简便性，以及采用光学显微技术对其进行成像，正在将斑马鱼转变为一个 体内 细胞生物学模型。本文描述了构建荧光标记细胞器的遗传载体的方法，以线粒体和中心体作为具体示例。我们采用双组分Gal4-UAS系统，在多种配置中限制基因在特定细胞类型中的表达，并提供了构建瞬时表达和稳定转基因鱼的实验方案。最后，我们给出了选择最适合观察亚细胞动态的光学显微镜方法的指导原则。

引言

体内成像可在最接近生理状态的环境中直接观察细胞行为。斑马鱼胚胎具有透明性、发育迅速且为体外发育，加之拥有丰富的遗传工具可用于荧光标记，这些优势共同推动了体内显微镜技术在揭示关键发育过程动态机制中的广泛应用。例如，利用斑马鱼开展的神经系统发育成像研究极大地拓展了我们对神经前体细胞行为及其子代细胞命运的认识，包括这些细胞随后的迁移、分化以及神经环路整合过程^1-8。

现在可以开始研究这些细胞行为背后的亚细胞动态机制。事实上，斑马鱼已被用作研究工具 体内 细胞生物学。现在可以对线粒体进行可视化观察^9-11中心体^2,8,12-14，高尔基体¹⁵微管⁴ 和肌动蛋白¹⁶ 细胞骨架，内体¹⁷ 顶膜复合体的组分^1,18，以及其他斑马鱼胚胎中的亚细胞结构 体内到目前为止，关于这些细胞器功能的大部分认识都来源于对培养细胞中其行为的研究。然而 体外 研究已为细胞生物学提供了巨大洞见，但培养条件下的细胞并不能完全代表生物体内细胞的复杂性 体内 因此不能必然反映细胞器亚结构的功能与动态变化 体内斑马鱼胚胎提供了一种可行的 体内 研究亚细胞动态的替代方法。

作为脊椎动物，斑马鱼拥有许多与哺乳动物物种同源的器官系统（例如，神经视网膜）。此外，斑马鱼胚胎正越来越多地被用于模拟人类疾病^19,20，包括与中心体功能相关（例如，小头畸形²¹ 和 Leber 先天性黑蒙²²）以及线粒体功能相关（例如，帕金森病²³、tau 蛋白病^10,24 和 Barth 综合征²⁵）的疾病。在体 对这些情况下的细胞和亚细胞水平进行成像，将有助于更深入地理解这些病理状态背后的细胞生物学机制。

本文所述方法的总体目标是提供一份全面指南，用于利用斑马鱼胚胎研究细胞器及其他亚细胞结构 体内 光学显微镜。可视化和追踪亚细胞结构所涉及的完整工作流程 体内 进行了描述——从基因标记方法，到构建瞬时表达和稳定型转基因鱼，最后利用宽场显微镜和共聚焦显微镜进行成像。尽管上述各项技术已被众多斑马鱼实验室广泛应用，但本文所述方案经过优化和简化，特别适用于研究亚细胞结构的动态变化。本文所描述工作的两个具体方面值得特别指出：第一，采用Gal4-UAS表达系统在多种构型中实现对特定细胞类型中细胞器的遗传标记；第二，对宽场显微镜与共聚焦显微镜在亚细胞结构成像中的应用进行直接比较 体内.

目前，在斑马鱼中对细胞器及其他亚细胞结构进行遗传标记的策略，主要利用带帽的mRNA^1,4,8，或使用启动子元件直接驱动融合蛋白表达的DNA载体^9,14,15。体外转录的带帽RNA可实现快速而广泛的表达，但缺乏组织特异性。此外，随着带帽RNA被稀释或降解，其表达水平随时间逐渐下降。因此，基于RNA的载体在发育后期阶段（通常不超过受精后3天）研究细胞器动态变化的应用受到限制。

通过使用DNA构建体，可以克服这些局限性，其中表达的空间和时间控制由特定的启动子元件决定。当基于DNA的构建体应用于Gal4-UAS系统时，可显著提高外源基因的表达水平^26,27。在此双组分表达系统中，细胞类型特异性的启动子元件驱动转录激活因子Gal4的表达，而报告基因则被克隆在Gal4结合的上游激活序列（UAS）下游。通过将UAS报告基因与适当的Gal4驱动系相结合，可将表达限制在特定的细胞类型中，从而避免每次需要特定表达模式时都必须将报告基因克隆到不同启动子下游的繁琐步骤。此外，多个UAS报告基因的表达可由单个Gal4激活因子驱动。因此，Gal4-UAS系统为亚细胞标记提供了一种多功能且灵活的遗传学方法。

宽场显微镜和共聚焦显微镜是大多数实验室的核心设备。宽场系统通常采用弧光灯作为光源，并在光路末端配备高灵敏度相机来检测发射光。这种成像方式通常仅适用于较薄的样品，因为在较厚样品中，来自非焦平面的离焦光会干扰和掩盖焦平面内的清晰信息。共聚焦显微镜与宽场系统不同，其设计旨在优先获取来自焦平面的信号，而抑制非焦平面产生的信号即, "光学切片")²⁸为了实现光学切片，在发射光路中设置一个针孔，其位置与点光源共轭。采用激光作为光源，信号由光电倍增管（PMT）检测。实际操作中，激光束逐点扫描样品，每个点（像素）处的荧光发射信号由PMT检测。

在此，我们利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中的相同亚细胞结构进行成像，以直接比较这两种显微技术。提供此类比较的根本目的在于为针对特定科学问题选择最合适的显微技术提供指导依据。

利用本文所述方法，我们展示了基于Gal4-UAS系统的线粒体和中心体的遗传标记技术。通过宽场显微镜和共聚焦显微镜对神经系统中不同类型的细胞以及肌细胞中的这些细胞器进行成像，以展示每种成像方式的适用性。本文描述的方法可轻松适用于活体斑马鱼胚胎中其他细胞器和亚细胞结构的研究。

方案

所有动物实验均按照德国上巴伐利亚州政府的当地法规进行。

1. 细胞器及其他亚细胞结构的标记

注意： 此处描述了可荧光标记中心体、线粒体和细胞膜的遗传报告基因构建体。

1. 采用常规克隆方法²⁹构建可荧光标记中心体和线粒体的融合蛋白。将斑马鱼centrin4（cetn4）的编码序列与荧光蛋白²（FP）（如黄色荧光蛋白）同框克隆，以生成cetn4-YFP。将细胞色素c氧化酶亚基VIII的线粒体靶向序列与荧光蛋白（如青色荧光蛋白）同框克隆，以生成mitoCFP^9-11。
2. 为将融合蛋白（cetn4-YFP或mitoCFP）的表达限制在斑马鱼胚胎的特定细胞中（例如神经元或肌细胞），使用双组分Gal4-UAS表达系统^26,27。首先构建UAS报告载体。使用常规方法将融合蛋白序列克隆至UAS表达载体中，位于Gal4结合位点UAS盒（变体范围为1x至14x UAS，参见讨论部分）^26,27,30和最小启动子（来自鲤鱼βactin基因的E1b基础启动子）下游，从而构建UAS:cetn4-YFP和UAS:mitoCFP。
   注意：若需为建立稳定转基因品系而制备UAS报告载体，则还需克隆额外元件（见下文3）
3. 为观察中心体或线粒体标记所处的细胞环境，构建可使细胞膜被荧光蛋白标记的UAS报告载体。将斑马鱼Gap43的前二十个氨基酸（含棕榈酰化位点）与荧光蛋白同框克隆，以将该荧光蛋白靶向至细胞膜（memFP）^31,32。
4. 获取驱动载体或转基因品系，其中细胞类型特异性启动子元件可驱动转录激活因子Gal4-VP16²⁷、Gal4FF³³或KalTA4³⁰的表达。
5. 将UAS报告载体与合适的驱动载体联用，以将表达限制在目标细胞类型中（例如神经元或肌细胞）。为此，可在受精卵单细胞期共注射Gal4驱动载体和UAS报告载体（详细操作见下文2），以获得瞬时表达的鱼类。或者，构建UAS报告载体的稳定转基因品系（详细操作见下文3），再与Gal4驱动稳定转基因品系杂交，以获得同时携带两种转基因的子代。
   注意：也可将UAS报告载体注射至Gal4驱动稳定转基因品系的受精卵中，或将Gal4驱动载体注射至UAS报告稳定转基因品系的受精卵中。
6. 为利用Gal4-UAS系统共表达多种不同的融合蛋白，可采用以下任一配置组合Gal4驱动载体与UAS报告载体：A. 多个独立的UAS报告载体（例如共注射UAS:mitoCFP和UAS:memYFP与Gal4驱动载体）¹⁰；B. 单个报告载体上含多个UAS盒（例如UAS:cetn4-YFP、UAS:memCerulean）¹²；C. 双向UAS报告载体（例如UAS:memYFP,mitoCFP）^2,10,24（图1）。

图 1. 利用Gal4-UAS系统共表达融合蛋白的策略。
可通过使用UAS报告基因盒在不同构型中实现多个融合蛋白的共表达：（A）多个独立的UAS驱动的构建体，（B）单个构建体上携带多个UAS盒，或（C）单个构建体上带有双向UAS盒。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 生成瞬时表达的鱼类

注意：以下内容是对先前已发表方案的改编^34,35。基本的注射装置应包括一台放大倍数可达12倍的体视显微镜、一个带有微移液器夹持器的显微操作仪，以及一个气压源。请提前准备好2.1-2.5部分：

1. 制备卵显微注射腔室时，配制1.5%（w/v）的琼脂糖水溶液。将琼脂糖粉末加入水中，微波加热至琼脂糖完全溶解。用该溶液填充一个培养皿（100 × 15 mm）。
   1. 让琼脂糖溶液冷却至约 45 ^o将塑料微注射模具（40 mm × 66 mm，表面具有6条长50 mm、宽1.5 mm、深1 mm、间距3 mm的脊状结构）放置于熔融琼脂糖表面之前，需确保界面处不产生气泡。
   2. 琼脂糖凝固后，于 4 ℃ 保存 ^oC O/N。用刮铲小心地将模具移除。每次制备多个显微注射室，4 ℃保存。 ^oC，并在数周内重复使用。
2. 使用微量移液器拉制仪制备具有长柄的玻璃注射毛细管³⁶.
   注意： 生成注射毛细管所需的具体参数应通过实验经验确定。注射毛细管可预先拉制并储存，以备后续使用。
3. 使用分光光度计根据制造商说明书测定用于显微注射的质粒DNA（Gal4驱动载体和UAS报告载体）浓度。测定260 nm与280 nm处吸光度的比值（A260/280）。将DNA稀释至终浓度为100 ng/μL。µl 在无核酸酶的水中。
   注意： A260/A280 比值约为 1.8 表示 DNA 纯度较高。建议使用商品化试剂盒（基于硅胶膜结合基质）纯化用于注射的质粒 DNA。质粒 DNA 应具有高纯度，以避免毒性。
4. 准备 10 µl 注射-混合，通过将DNA（0.5至 2.5 µl 100 ng/µl 终浓度为 5 至 20 ng/μl），Danieau 溶液（0.33 µl 30倍浓缩液）、酚红（0.25 µl，可选）和无核酸酶水至一个 10 μl 总体积
   注意： 通过实验确定能够产生适宜表达水平的DNA浓度。Gal4驱动质粒和UAS报告质粒需共同注射。若仅将Gal4驱动质粒或UAS报告质粒单独注射至野生型受精卵中，则不会产生表达。然而，若受精卵来源于Gal4驱动品系，则仅需注射一个或多个UAS报告质粒即可。反之，若对UAS报告品系进行显微注射，则只需注射Gal4驱动质粒。最后，尽管酚红有助于观察注射过程，但它本身也是一种荧光化合物。因此，若计划在受精后24小时内（hpf）进行成像，酚红可能会干扰荧光蛋白（FPs）的观察，因其在此时可能尚未充分稀释。
5. 注射前一晚，设置若干对（通常为5至10对）雄性和雌性斑马鱼用于繁殖。使用带有网格底板插件和可拆卸隔板的繁殖缸，将雄鱼和雌鱼分隔开。
   注意： 雄性和雌性斑马鱼通常可通过体型加以区分。雄鱼体型较为纤细，而雌鱼腹部下侧则通常向外突出。此外，雄鱼腹部下侧区域通常呈现黄红色。
6. 在进行DNA注射前，立即移除隔板以使雄鱼和雌鱼交配。移除隔板后约15至30分钟，检查鱼缸底部是否有卵。使用渔网将成鱼转移至新的繁殖缸中。
7. 将含有新产出的受精卵的水从繁殖缸倒入筛子中例如， 一个塑料茶筛）。使用装有Danialleau溶液的喷雾瓶在筛子中清洗卵。将筛子倒置在培养皿上，用装有Danialleau溶液的喷雾瓶冲洗，以回收全部卵（通常每个成年鱼配对可获得50至200枚卵）。
8. 使用微量移液器将DNA注射混合液反向注入拉制好的注射毛细管中。将注射毛细管安装至显微操作仪的持针器上，在体视显微镜下用镊子修剪尖端，以制备出可穿透卵膜和细胞胞质并能输送适量DNA的微针。
   注意： 注射毛细管尖端的修剪程度需通过实验经验确定，最佳判断方法是在注射卵细胞时进行评估。
9. 为确定注射用 DNA 体积，将一滴注射液排入石蜡油中。使用校准测微计测量液滴的半径（r），并计算其体积（4/3 π r³）。³通过调节注射压力和/或每次注射脉冲的持续时间来调节注射体积。
10. 使用塑料移液管，转移所有收集的卵（通常为50–200个，来自 2.7 将上述样品注入微注射室的沟槽中。在体视显微镜的视觉控制下，使用镊子调整卵子的方向，以便清晰识别细胞胞质（透明）和卵黄（致密、不透明）。
11. 在体视显微镜的视觉控制下，将DNA注入受精卵的细胞质中，注意确保注射体积（1至2 nl）约为细胞体积的10%。
    注意： DNA 溶液中的酚红有助于观察注射的体积。
12. 注射后，用装有 Danieau 溶液的喷雾瓶冲洗注射模具的沟槽，使胚胎脱离。随后使用塑料移液管将胚胎转移至新的培养皿中，并在 28.5 ℃ 下培养。 ^oC 培养箱
13. 将未注射的卵作为对照，以确定注射是否导致高死亡率，这种死亡率可能源于显微注射针穿刺造成的物理损伤或DNA混合物的影响。
    注意： 注射后高死亡率可能由多种因素导致，包括DNA浓度过高、注射体积过大和/或质粒中含有污染物。为避免低质量DNA制备物引起的毒性，可使用商品化试剂盒（基于硅胶结合基质）。
14. 注射后定期使用体视显微镜检查未受精卵及死亡或畸形的胚胎，并将其剔除。
    注意： 将受精数小时后仍呈现单细胞阶段的卵子视为未受精。通过明显的解剖学缺陷（如前后体轴发育异常）识别畸形胚胎。若卵膜内出现无定形物质，表明胚胎未能正常发育并已死亡。为确定显微注射后的胚胎是否经历正常发育过程，可参考解剖学图谱。³⁷.
15. 使用塑料移液管将胚胎转移至含有1×1-苯基-2-硫脲（1×PTU）的Danieu's溶液中，时间为受精后10至24小时，以抑制色素形成。在实验期间，始终将胚胎维持在含有PTU的Danieu's溶液中。
    注意： 除了黑色素细胞外，皮肤表面的虹彩细胞也可能对成像造成干扰。尽管PTU不能抑制虹彩细胞的形成，但已存在虹彩细胞数量减少的突变品系，例如roy orbison（roy），可用于此类实验。³⁸.
16. 胚胎孵化后（通常在受精后第2或第3天，2或3 dpf），弃去卵膜，并更换含有PTU的Danieau溶液。
    注意： 这些步骤对于确保胚胎培养基的质量以及健康胚胎的存活能力至关重要。

3. 生成稳定转基因品系

注意：可利用 Tol2 转座子系统高效构建稳定的转基因品系。在单细胞期，将含有目的转基因的 Tol2 转座子载体与编码转座酶的 mRNA 共同注射到受精卵中。由注射的 mRNA 表达产生的转座酶可催化转基因片段从转座子载体上切除，并将其整合到基因组中³⁹。

1. 克隆转基因报告基因盒（例如， UAS:mitoCFP) 置于斑马鱼研究领域当前常用的一种 Tol2 载体的 Tol2 反向末端重复序列之间，具体方法如所述⁴⁰.
   注意： 含有选择性表达盒的 Tol2 载体，其中启动子元件驱动荧光蛋白在与目标区域无关的器官系统中表达（例如， 心脏⁴¹ 或晶状体⁴²在缺乏 Gal4 转录激活的情况下，可用于筛选 UAS 报告基因转基因品系。
2. 使用商用试剂盒（基于硅胶结合基质）纯化用于注射的质粒DNA。确保质粒DNA具有高纯度，以防止毒性。
3. 使用适当的转录载体（如 PCS-TP）转录 Tol2 转座酶编码 mRNA⁴³简而言之，将PCS-TP线性化，并使用商用试剂盒合成带帽mRNA，具体操作遵循制造商说明书。注意避免RNase污染。例如， 使用无RNA酶的移液器吸头和离心管。将RNA分装，浓度为100 ng/μL。µl，用于单次使用，并于 -80 保存 ^oC.
4. 注射当天早晨，将一份转座酶 mRNA 在冰上解冻。混合转座子 DNA 载体（2 µl 100 ng/µl）和转座酶 mRNA（2 µl 100 ng/µl以1:1的比例混合，并加入 6 µl 加入无RNase水，使总体积达到 10µl.
   注意： 20 ng/μL 的浓度µl 建议每种成分使用推荐浓度，但最佳浓度需通过实验确定。稀释时使用无RNase的水。操作DNA-RNA注射混合物时应佩戴手套，并在整个注射过程中将其置于冰上，以防止mRNA降解。
5. 使用详细的说明 第2节 上述操作完成后，在单细胞阶段将DNA-RNA注射混合物注入受精卵中。在体视显微镜的视觉控制下，将注射靶点定位在单细胞阶段的细胞质中，以获得最高的转基因效率。将注射后的胚胎在28.5 °C条件下培养 ^oC，直至准备筛选转基因表达时。
   注意： 可按照先前所述方法进行PCR以检测Tol2转座酶的效率⁴⁴.
6. 在荧光解剖显微镜下，使用目镜在培养皿中筛选转基因胚胎。
   注意： 使用显微镜的适当滤光片组观察筛选盒中荧光蛋白（FP）的表达情况（即， 在受精后2或3天观察心脏或晶状体中的荧光。根据心脏或晶状体中的表达情况鉴定潜在的转基因胚胎，并将这些胚胎培育至成年（F₀ 使用标准方案进行传代⁴⁵或者，按照所述方法通过PCR鉴定潜在的转基因胚胎 ⁴⁶.
7. 一旦UAS报告基因F₀ 鱼的年龄为2.5至3个月时，进行杂交（参见 2.5 （详情请参见）非转基因野生型鱼以获取卵子，用于建立 F₁ 生成。或者，将UAS报告基因F杂交₀ 将鱼类与Gal4驱动品系杂交以建立F₁ 后代。在后一种情况下，可通过杂交获得的胚胎直接检测由UAS驱动的转基因。
8. 使用荧光解剖显微镜筛选 F₁ 用于检测转基因或可筛选表达盒的胚胎。
   注意： 当确认表达后，则可认为该转基因已实现生殖系传递。转基因在F代呈非孟德尔式遗传。₀ 阶段。在单个产卵批次中，表达转基因的胚胎数量可能从少数到绝大多数不等。不同F代中的转座子整合情况₀ 鱼类之间可能存在很大差异，导致表达模式不同。因此需维持 F₁ 来自不同 F 的鱼类₀ 将创建者作为独立的亚系。F中的转座子整合₁ 鱼类是稳定的，并以孟德尔方式遗传给后代。
9. 维持每个 F₀ 将鱼分养于不同鱼缸中，以重新鉴定转基因携带者。

4. 为直立显微镜成像准备胚胎

注意：此处所述的实验步骤已针对配备长工作距离水浸式锥形物镜的直立显微镜成像进行了优化。

1. 使用荧光体视显微镜筛选胚胎中的转基因表达。
   注意： UAS 报告基因转基因的表达取决于所使用的特定 Gal4 驱动品系。根据期望的表达模式选择用于成像实验的胚胎。
2. 使用塑料移液管将选中的胚胎转移至另一个含有 Danieau 缓冲液、1× PTU 和 1× Tricaine 的培养皿中。
   注意： 当标记稀疏（仅器官系统中少数细胞）时，应将胚胎包埋于琼脂糖中（见下文 4.3–4.7），并使用配备高倍物镜的宽场显微镜进行转基因表达筛选（见下文 5.1）。Tricaine 可使鱼类麻醉，通常数秒内起效。若鱼类未被固定，可能表明 Tricaine 已降解。降解的可能原因包括 Tricaine 储存不当，因其对光敏感⁴⁷。
3. 通过将低熔点琼脂糖粉末溶解于 Danieau 缓冲液中，制备用于包埋鱼类的琼脂糖溶液，终浓度为 0.7%。分装（1 ml）后置于 40 °C 加热块中，待用前保温。
   注意： 也可使用更高浓度的琼脂糖（最高达 1.5%）进行包埋。
4. 向 1 ml 低熔点琼脂糖分装液中加入 50 μl 的 20× Tricaine 储存液和 20 μl 的 50× PTU 储存液，轻弹管壁充分混匀。将离心管放回加热块中。使用塑料移液管，轻轻将数个（1–10 个）已麻醉的胚胎移入琼脂糖中，尽量减少液体转移，以避免稀释琼脂糖。
5. 使用塑料移液管，将所有胚胎连同少量琼脂糖转移至玻璃底培养皿中。
6. 操作需相对迅速，使用镊子根据待成像结构将胚胎调整至所需方向。
   注意： 若需成像视网膜或 Rohon-Beard (RB) 感觉神经元，应将胚胎侧向放置。
7. 让琼脂糖凝固至少 15 分钟。加入含有 1× PTU 和 1× Tricaine 的 Danieau 缓冲液，覆盖包埋在琼脂糖中的胚胎。将含有琼脂糖包埋胚胎的培养皿置于 28.5 ^oC 培养箱中，直至准备成像。

5. 使用宽场或共聚焦显微镜成像细胞和亚细胞结构

注意：宽场显微镜和点扫描共聚焦显微镜是用于成像荧光标记斑马鱼胚胎最常用的两种成像方式。表1总结了这两种系统的优缺点。对于这两种显微镜技术，胚胎均按照上述4中的描述固定在琼脂糖中，并在整个成像过程中通过显微镜载物台上的加热腔将温度维持在28.5 ^oC。重要的是，在开始成像前，需让含有琼脂糖包埋胚胎的培养皿在28.5 ^oC下充分平衡，因为温度波动会导致z轴方向的漂移。在进行长时间成像实验（数小时以上）时，应在培养皿上加盖聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）盖板，以减少缓冲液的蒸发。

	宽视野	点扫描共聚焦
成本	相对便宜	昂贵（约贵5倍）
光漂白	低	高。样品在焦点平面的上方和下方均暴露于激光照射。
光毒性	低	高（参见上文光漂白）
采集速度	快速	缓慢
xy分辨率	阿贝定律	阿贝定律（使用极小的针孔可将其提高约40%；然而，在大多数情况下，这种改进并无实际应用价值）
光学切片	较差	是（可通过针孔大小进行调节）
组织穿透	仅限于浅层结构（例如，Rohon-Beard 细胞或肌纤维）	受限于 < 距胚胎表面100 mm

表1. 宽场显微镜与点扫描共聚焦显微镜的一般比较

1. 宽场显微镜技术
   注意： 本文提供了使用配备长工作距离水浸锥形物镜的直立式宽场显微镜对斑马鱼胚胎进行成像的操作指南。显微镜配置有冷却CCD相机，以及安装在自动滤光轮上的多种滤光片组，可用于快速采集多个荧光通道的图像。图像采集由 μManager，一个开源显微镜软件包⁴⁸. 提供了一个在 RB 感觉神经元中成像线粒体的具体示例。RB 细胞通过膜靶向 YFP 进行遗传标记，其线粒体则标记有 CFP（参见 1.1 如上所述。
   1. 将胚胎侧向固定于低熔点琼脂糖中，具体步骤如前所述 4 上述。
   2. 让载有鱼的培养皿在28.5℃下平衡 ^o在开始成像前，将样品置于显微镜载物台上的加热腔室内，于37°C环境下孵育。
   3. 使用低倍水浸锥形物镜，通过显微镜目镜观察，选择胚胎表面待成像的区域。
      注意： 如果稳定转基因 MitoFish 报告基因品系，Tg(UAS-E1b:mYFP,mitoCFP)^mde6，与 HuC:Gal4 等驱动品系联用时，大多数 RB 神经元会被标记，在胚胎表面呈现出致密的神经突分支网络。若通过显微注射 DNA 构建体实现稀疏标记（例如， 感觉神经元：Gal4-VP16 与 UAS:mitoCFP 和 UAS:MA-YFP，筛选胚胎以鉴定双标记细胞。
   4. 打开显微镜软件（μManager 1.4）后，点击“配置设置”下的“照明”以定义目标波长的正确滤光片组（本示例中为YFP或CFP）。在“相机设置”中输入获取合适图像所需的曝光时间。
      注意： “照明设置”由用户在软件安装时预先设定，并在打开时加载 μMana如果软件未设置为控制滤光轮，请手动将物镜转盘上的滤光轮移至适当位置。
   5. 更换为工作距离较长的40–100倍水浸锥形物镜。选择数值孔径（NA）最高且经过色差校正（复消色差）的物镜。
   6. 单击“Live”以选择视野：对于RB神经元，可在从细胞体发出的主轴突或外周分支中观察线粒体运输。
      注意： 胚胎尾鳍褶中RB神经元的周围分支为成像提供了一个理想的视野，该区域较为平坦，可利用宽场显微镜在单幅图像中完整捕获。因此，将胚胎侧向尽可能平放固定至关重要，以确保尾鳍褶与培养皿底部平行。
   7. 选择视野后，点击 ImageJ 菜单中的“矩形选择”按钮，定义一个感兴趣区域（ROI），然后点击“ROI” µMana选择成像的感兴趣区域（ROI）后，点击“停止”和“保存”，获取YFP通道的图像，以记录神经突的局部形态。
   8. 要对线粒体运输进行成像，请点击“Multi-D Acq.”按钮。观察弹出的附加窗口（“Multi-dimensional Acquisition”），在该窗口中设置时间点的数量以及时间点之间的间隔。采用0.3–1 Hz的帧率。持续记录至少10分钟，以尽可能收集更多的数据点。
   9. 在“多维采集”窗口中，点击“通道”，添加并定义成像的波长（本示例中为线粒体的CFP）以及曝光时间。成像线粒体运输时，曝光时间应保持在400毫秒以下。
   10. 在“多维采集”窗口中，点击“保存图像”选项，以自动将文件保存至“目录根路径”中指定的文件夹。点击右上角的“采集”按钮，开始延时成像。
   11. 在延时记录过程中手动重新调整焦距，以补偿 z 轴方向的任何漂移。
       注意：使用这些参数，可对RB神经元中的线粒体运输进行长达4小时的成像。
2. 共聚焦显微镜
   注意： 本文提供了使用 upright Olympus FV1000 共聚焦显微镜及长工作距离水浸式锥形物镜进行成像的操作指南。该显微镜配备多条激光谱线和多种检测器（包括常规光电倍增管和更灵敏的砷化镓磷化物检测器），可实现多通道成像。文中特别参考了 Olympus Fluoview 软件，但所描述的成像参数可便捷地适用于其他共聚焦系统。
   1. 将胚胎以适合待成像器官/结构的方向固定在低熔点琼脂糖中，具体方法如所述 4 上述。
   2. 让载有鱼的培养皿在28.5℃下平衡 ^o在开始成像前，将样品置于显微镜载物台的加热腔内，温度为 C。
   3. 使用长工作距离水浸式锥形物镜，配合正置构型的共聚焦显微镜。选择数值孔径（NA）尽可能高的物镜，以最大限度收集荧光信号并获得最佳分辨率。多通道成像时，应选用经过色差校正的物镜（复消色差物镜）。
   4. 打开显微镜软件，点击“Trans Lamp”或“Epi Lamp”，分别使用透射光或荧光照明，通过显微镜的目镜识别目标区域。
   5. 使用软件设置以下扫描参数以获取图像序列：
      1. 在“采集设置”窗口中，确认用于成像的物镜与可用物镜下拉菜单中显示的物镜相匹配。
         注意： 这是为了确保特定物镜的任何预设参数（例如， 横向和轴向分辨率、共焦孔径大小等参数均成立且可可靠使用。
      2. 选择合适的激光线、激发光和发射光二向色镜滤光片以成像特定的荧光蛋白。可通过点击“图像采集控制”窗口中的“染料列表”按钮并选择适当的荧光染料来完成设置。或者，点击“光路与染料”按钮以手动设定这些参数。
         注意： 当选择“染料列表”按钮选项时，软件会自动选择合适的激光线、激发和发射二向色滤光片，并适当调整共聚焦针孔的大小。
      3. 在“采集设置”窗口中，调整“缩放”倍数和“尺寸纵横比”（即，512×512，1024×1024等）以获得能够最佳分辨成像结构所需的像素大小。将像素大小设置为物镜理论分辨率的约一半，以满足奈奎斯特采样标准。要确定所获取图像的像素大小，请点击“图像采集控制”窗口中信息符号（“i”）按钮。
      4. 将扫描速度设置为尽可能最快（2 μs/pixel) 在“采集设置”窗口中。
      5. 在“图像采集控制”窗口中，点击卡尔曼行平均以减少噪声，通常设置为2到3倍即可。
      6. 当对光谱重叠的荧光染料进行成像时，选择逐行扫描模式。为此，请在“图像采集控制”窗口中点击“逐行”和“线”选项。
      7. 调节相关激光谱线的输出功率（通常低于5%），具体数值需通过实验确定。
      8. 单击“XY 重复”或“聚焦 ×2”或“聚焦 ×4”按钮，以在调整各通道检测器设置的同时连续扫描选定区域。调节每个通道的“HV”、“增益”和“偏移”，以获取具有最宽灰度值动态范围的图像。
         注意： 这些参数的具体数值需通过实验经验确定。“HV”调节探测器上的电压以改变其灵敏度，“Offset”调节探测器的输出信号，“Gain”则将探测器的输出信号乘以一个常数因子。
      9. 按 Ctrl + H 键，通过查找表（HiLo）可视化所获取的图像，该表可识别欠饱和（呈蓝色）和过饱和像素（呈红色），通常应避免这两种情况。重新评估相关激光谱线的输出功率及检测器设置。
         注意： 使用较高的激光功率和探测器“HV”水平会获得更强的信号。然而，较高的激光功率会导致更严重的荧光漂白和光毒性。提高“HV”值会增加噪声。因此，在设置激光功率和“HV”时需要权衡，以在避免光损伤的同时获取噪声水平可接受的图像（另见 表1).
      10. 通过聚焦于感兴趣区域的上下边界，从定义的体积中采集图像。在“采集设置”窗口中，点击 z 层扫描窗口的“结束设置”和“开始设置”按钮，分别对应待成像体积的上边界和下边界。选择步长为所用物镜 z 分辨率的一半。例如，如果z轴分辨率是 2 µm 选择 1 µm)。要确定物镜的轴向分辨率，请在“图像采集控制”窗口中点击带有信息符号（“i”）的按钮。
      11. 设置时间序列，以适合所成像亚细胞结构动态变化的时间频率采集z轴层扫图像。在“TimeScan”子窗口中，输入z轴层扫图像的采集频率（“Interval”）以及图像采集的次数（“Num”）。
      12. 在“图像采集控制”窗口中，单击“深度”和“时间”按钮，以确认将采集z轴序列图像（z-stack）和时间序列图像。最后单击“XYZT”按钮，开始采集延时成像图像。
      13. 图像采集完成后，在软件界面上观察到“Series Done”提示。点击该提示，将图像以“oib”格式保存，以记录图像及其相关元数据。
          注意： 使用 FIJI 等免费开源图像处理软件，可对宽场显微镜和共聚焦显微镜获取的图像进行可视化与分析。

结果

此处直接比较并对比了宽场显微镜与共聚焦显微镜在活体斑马鱼胚胎中对线粒体和中心体成像的应用。根据待观察细胞器动态变化的细胞所在位置以及特定亚细胞事件的固有频率，通常选择宽场显微镜或共聚焦显微镜更为合适。我们对位于胚胎表面的RB神经元以及位置更深的视网膜细胞中的细胞器进行了成像。由于RB神经元位置表浅且具有二维几何结构，因此适合采用宽场显微镜和共聚焦显微镜进行成像图 2）。然而，使用共聚焦显微镜获取图像的速度显著较慢，可能导致对特定亚细胞事件动态变化的低估（例如， 线粒体的运动， 图2C,D）。通过宽场显微镜获取的视网膜细胞图像由于来自大体积组织的荧光信号干扰，导致焦平面内的细节对比度较差。而共聚焦显微镜的光学切片能力显著提高了图像对比度（图3).

为了实现细胞器与细胞膜...

讨论

在此，我们展示了Gal4-UAS表达系统在斑马鱼胚胎体内对特定细胞类型的线粒体、中心体以及细胞膜进行荧光标记的多功能性。in vivo 许多用于标记其他细胞器或亚细胞结构的荧光融合蛋白已在已发表的文献中报道，可从相应实验室、商业来源或非营利性质粒库（例如 Addgene）获得。设计新的荧光融合蛋白时，需考虑多个参数，包括选择何种荧光蛋白（FP），以及将FP融合至目标蛋白的氨基末端还是羧基末端。关于荧光融合蛋白构建的更深入讨论，读者可参考该主题的详细综述文章^49-51。

我们强调了三种利用UAS驱动的转基因实现融合蛋白共表达的策略。使用多个独立的UAS报告基因构建体，可以在无需额外克隆的情况下组合不同的现有报告基因构建体，且报告基因的表达水平也可独立调节。然而，当在单个构建体中使用多个UAS表达盒或双向UAS表达盒时，可实现更高水平的共表达。由于荧光蛋白（FPs）被用作标签，因此验证共表达相对容易。需要注意的是，其他多顺反子表达方法也存在，包括使用内部核糖体进入位点（IRES）。⁴⁰ 和病毒2A肽

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖（2-羟乙基琼脂糖）	Sigma-Aldrich	A4018-10G	低凝胶温度VII型
加热块	Eppendorf		Thermomixer compact
Ca(NO3)2 硝酸钙水合物，99.996%	Aldrich	202967-50g	制备30倍浓度的Danieau溶液
CCD相机	Qimaging	Retiga Exi Fast 1394
陶瓷涂层杜蒙特#5镊子	杜蒙特 - 精密科学工具	11252-50	#5 镊子
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV1000 Fluoview
培养皿加热器	Warner Instrument Corporation	DH-35	加热环
三氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	PharmaQ	Tricaine PharmaQ-25g	三卡因（麻醉剂）
荧光解剖显微镜	Leica	M205 FA
GeneClean试剂盒	MP Biomedicals	111001200
玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0-14-C	35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 0 盖玻片
玻璃针	World Precision Instruments Inc.	TW100F-4	用于显微注射
HEPES	Sigma	H3375-250g	制备30倍浓度的Danieau溶液
高真空润滑脂	道康宁	DCC000001242 150克	二氧化硅油脂
KCl 99%	Sigma-Aldrich	S7643-5kg	制备30倍浓度的Danieau溶液
MgSO₄4.7H2O   七水合硫酸镁 98+% A.C.S 试剂	Sigma-Aldrich	230291-500g	制备30倍浓度的Danieau溶液
显微注射仪	Eppendorf		FemtoJet
显微注射尖端	Eppendorf	930001007	0.5-20 μl
显微操作仪	Maerzhaeuser Wetzlar	MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
微移液管夹持器	细胞内	P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒	Ambion	AM1340	转录 PCS-转座酶
NaCl BioXtra >99.5%	Sigma-Aldrich	P9541-1kg	制备30倍浓度的Danieau溶液
Nano分光光度计			测量 DNA/RNA 浓度
拉针仪	Sutter Instrument	P-1000	弗莱明/布朗
NIR Apo 40x/0.80W	尼康		水浸锥形物镜
N-苯基硫脲 Ⅰ级，约98%	Sigma	P7629-10G	PTU（抑制色素形成）
培养皿	Sarstedt AG	821472	92 x 16mm
塑料模具	自适应科学工具	TU-1	用于显微注射
有机玻璃盖板（带孔）	定制		Plexiglas 盖板上的孔应比水浸锥形物镜的直径大 3 mm
茶漏（塑料）			收集斑马鱼卵
温度控制器	Warner Instrument Corporation	TC-344B	双自动温度控制器
移液管	Sarstedt AG	86.1171	3.5 mL 塑料移液管
UMPlanFI 100x/1.00W	Olympus		水浸锥形物镜
UMPlanFLN 20x/0.50W	奥林巴斯		水浸锥形物镜
宽场显微镜	Olympus	BX51WI
PTU（50倍浓缩液）			将76 mg PTU溶解于50 ml蒸馏水中 室温下剧烈搅拌  -20℃保存 oC，每份1 ml分装 以1倍工作液浓度使用
Tricaine（20倍浓缩液）			将200 mg Tricaine溶于48 ml蒸馏水中 加入 2 ml 1 M Tris 碱（pH 9） 调节至 pH 7  -20℃保存 oC，每份1 ml分装 以1倍工作液浓度使用
Danieau's 溶液（30倍浓缩液）			1,740 mM  NaCl  21 mM      KCl  12 mM      MgSO₄4.7H2O  18 mM      Ca(NO₃)₂3)2 150 mM    HEPES缓冲液  蒸馏水加至 1 L  4°C 保存 oC  使用0.3倍工作浓度的溶液