新生猪肠道淋巴干的长期插管及淋巴液采集

摘要

我们介绍一种对新生仔猪的肠淋巴干进行插管的外科手术方法，以从输出淋巴液中收集大量脂质代谢成分。

摘要

新生仔猪肠淋巴干插管是一种可用于长期收集大量肠道（中枢）输出淋巴液的技术。重要的是，收集来自肠道的中枢淋巴液可使研究人员能够研究与脂质代谢、肠道炎症和癌症转移相关的机制及脂质成分，以及参与免疫功能和免疫监视的细胞。采用腹正中线手术入路可充分暴露腹前部，并相对容易地接近位于胰腺附近、门静脉右腹侧支下方、右肝叶内脏面深部的肠淋巴干。该血管需仔细分离，从周围筋膜中游离出来，随后用缝线扩张，以便将导管插入并固定于血管内。导管引出体外，可在7天期间每天收集约1升淋巴液。尽管该技术可实现长时间内大量中枢淋巴液的采集，但其成功与否取决于精细的外科解剖、组织操作以及对正确手术技术的密切注意。这一点在幼龄动物手术中尤为重要，因为淋巴管极易撕裂，可能导致手术失败或实验中断。本视频展示了一种用于采集肠道淋巴液的优秀外科技术。

引言

淋巴系统是生理学中一个研究尚不充分的领域。在不同动物物种中已建立用于前临床研究的淋巴管插管模型^1-8，制药行业和科研机构利用这些模型研究脂质^8-12和药物代谢^13-15、癌症转移¹⁶及其实验性治疗¹⁷，以及免疫功能^18-26的机制。本研究探讨在家猪模型中进行肠干淋巴管插管，以检测脂蛋白代谢相关组分。脂蛋白代谢涉及乳糜微粒的生成与分泌，以及相关脂质和总蛋白的变化。由于常用啮齿类动物模型与人类在脂质代谢方面存在显著差异，因此采用猪模型收集肠淋巴液，可能为研究人类脂质代谢提供更具可比性的信息^27-31。

有多种外科技术可用于在大型动物物种中采集肠系膜淋巴液：肩部颅侧入路（即， 胸导管插管⁵一种侧上方腰部入路^32-34以及腹侧正中或旁正中入路^22,35本视频详细描述了采用腹正中切口手术入路在猪体内进行肠淋巴干插管的外科手术操作。精细的手术技术使得该淋巴插管方法能够在较长时间内收集大量淋巴液及其组分。

该技术为研究多种生理功能的各个学科领域开辟了广泛的应用前景。其应用可能包括但不限于全身脂蛋白和脂质代谢、免疫监视、肿瘤发生与转移、肠道功能，以及肠道炎症性疾病的发病与进展。

方案

视频和文稿中描述的所有实验动物操作均经机构动物护理与使用委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南。

1. 新生仔猪的手术麻醉与手术准备

1. 在独立的前室中，于颈部基部对25 kg的猪进行肌肉注射镇静-麻醉混合药物，药物成分为：阿扎哌隆（0.3 mg/kg）、盐酸氯胺酮（10 mg/kg）、右美托咪定（15 µg/kg）。
   注意：在麻醉前用药混合物中加入布托啡诺（0.005–0.02 mg/kg），以增强术中镇痛效果。
2. 使用吸入式异氟烷气体麻醉猪（4-5% 异氟烷，氧气流速为 500 ml-1,000 ml/min）₂) 使用面罩。使用兽用喉镜（17–25 cm 长直型镜片）观察声带，并对声带局部喷洒10%利多卡因喷雾。在插管前30–60秒喷洒利多卡因，使药物与声带充分接触，以降低声带痉挛和气道阻塞的风险。
3. 通过声门插入带套囊的气管插管（5.0–7.0 mm 内径（ID））对猪进行插管，并使用异氟烷气体（0.5–2.0% 异氟烷，氧气流速 1,000–2,000 ml/min）维持麻醉₂使用密闭循环呼吸麻醉系统在整个手术过程中进行麻醉。通过下颌张力以及足底和眼睑反射反应来评估麻醉深度。呼出的麻醉气体经收集后排出手术室外。
4. 用2.0%氯己定外科洗手液清洁耳部外表面，随后用70%异丙醇冲洗。使用20 G静脉导管穿刺耳静脉，术中给予静脉输液（乳酸林格液；5–10 ml/kg/hr）。用医用胶带将脉搏血氧仪固定于舌体黏膜表面，以监测心率及外周血氧饱和度（SpO₂）。₂).
5. 将麻醉后的猪置于仰卧位，从胸部中段向尾侧至耻骨腹面区域剃除腹部腹侧的毛发。使用两种交替的2.0%氯己定外科擦洗液与无菌水清洗对该区域进行清洁。
6. 将麻醉后的猪转移至手术室，用70%异丙醇溶液进行最终手术擦洗，待其自然干燥后，为动物铺巾。
7. 将直肠温度探针插入直肠约2-4 cm以监测体温。手术过程中将猪置于循环水加热垫上，以维持正常体温（38-40 °C）。
8. 用四块毛巾以重叠的象限方式覆盖猪的腹部。第一块毛巾横跨剑突处，第二块毛巾沿腹部侧面放置，位于腹正中线外侧约5 cm处。第三块毛巾横跨骨盆的髂嵴，第四块毛巾与第二块毛巾类似（但在对侧），沿腹部侧面放置，位于腹正中线外侧约5 cm处。
9. 在下方的毛巾铺巾上放置一张带有切口开口以便接触手术部位的大型手术台铺巾，覆盖猪体及整个手术台。最后的铺巾是在大型手术台铺巾上覆盖一张一次性无菌铺巾。

2. 腹部手术与肠淋巴干插管

1. 使用手术刀片做一条20 cm的皮肤切口，以暴露下方的腹肌。使用单极电凝（设定为20瓦）切开腹肌各层，暴露壁层腹膜。用梅岑鲍姆剪刀切开一段20 cm长的线性壁层腹膜，以进入腹腔脏器并暴露淋巴管。
2. 在手术切口的头侧放置牵开器，以在整个手术过程中保持腹腔开放。
3. 在整个手术过程中，用温热（37 °C）的无菌生理盐水润湿所有组织。轻柔地提起包含结肠、盲肠、回肠和空肠的大段肠管，将其从腹腔移出并置于猪的左侧 flank 区，以暴露上腹部、肝脏和淋巴管。使用额外的布巾单固定外置的肠管，形成吊带以轻柔支撑肠管。
4. 定位淋巴管：其位置大约在右肾静脉头侧内侧约4 cm处，腔静脉孔尾侧内侧腹侧约6 cm处，并位于右肝叶脏面下方靠近胰腺的位置^22,36,37。将淋巴管识别为与门静脉右腹侧段相邻的透明结构^36,37。
5. 使用棉签轻轻分离附着的组织，将淋巴管从周围筋膜中游离出来。当血管的两侧已与周围组织分离后，使用精细钝头镊子在血管下方创建一个"隧道"开口。
6. 使用精细镊子将三根2-0丝线缝合线穿过淋巴管下方。首先结扎最尾侧的缝线，以闭塞、扩张并使淋巴管充满淋巴液。有意将此缝线的末端留得相对较长（4 cm），以便将导管固定在淋巴管上。另外两根缝线彼此相距1.0 cm，位于已固定的尾侧缝线头侧约1.0–1.5 cm处。将这两根缝线以“单个松结”方式留置，以便更快地将导管固定于血管内。
   注意：位于最尾侧结扎缝线与上方两根缝线中段缝线之间的淋巴管节段，即为导管插入部位。如需要，可用2-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin）缝线替代2-0丝线。
7. 使用虹膜剪在血管上剪开一个小孔，并用精细钝头镊子扩张血管。将一根带有斜面端的特制导管（外径4.06 mm × 内径2.31 mm）插入血管约1.0–1.5 cm，然后结扎上方两根缝线以固定导管位置。使用尾侧缝线的长端将导管牢固固定在血管上。
8. 用大量温热生理盐水冲洗外置的肠管，并轻柔地将其还纳回腹腔，确保肠道处于正确的解剖位置。
9. 将导管从左侧中 flank 区（腰 fossa 腹侧5–10 cm处）引出体外。使用手术刀做皮肤切口，并将套管针从腹腔穿至皮肤表面，以创建导管引出通道。使用大型凯利钳通过套管针开口将导管从腹腔内引出体外。
10. 使用带圆针（锥形针）的2-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线，以连续单纯缝合法关闭壁层腹膜。使用带圆针的2-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线，以间断单纯缝合法关闭腹肌各层。
11. 使用带角针的2-0聚乳酸羟基乙酸共聚物缝线，以皮下连续缝合法关闭皮肤。使用带角针的2-0尼龙缝线，以荷包缝合法将外置的导管固定于皮肤上。
12. 在猪仍处于麻醉状态时为其穿上特制背心，以便于穿戴，并减少其在恢复期间的应激反应。

3. 术后恢复与淋巴液采集

1. 在停止吸入麻醉前约10分钟，肌肉注射布托啡诺（0.1 mg/kg）以提供术后即时镇痛。术后继续每12小时给予布托啡诺（0.1 mg/kg），持续24-48小时，以维持术后镇痛效果。
2. 术后7天内，每8-12小时监测一次猪的术后并发症。
3. 使用涂有乙二胺四乙酸（EDTA）并添加抗生素（青霉素6,000 IU、链霉素6 mg和两性霉素B 3 mg）的500 ml聚丙烯冲洗瓶，每12小时收集一次淋巴液，持续7天。

4. 淋巴液中载脂蛋白B48、甘油三酯、胆固醇和总蛋白的定量分析

1. 将淋巴液样品在 4 °C 条件下以 1,800 × g 离心 5 分钟。收集上清液，用于甘油三酯、胆固醇和总蛋白的定量分析。
2. 将上清液分为三个样品：未稀释样品、用蒸馏水 1:20 稀释的样品，以及用蒸馏水 1:100 稀释的最终样品。
3. 使用未稀释的上清液，采用市售试剂盒测定胆固醇水平。
4. 使用 1:20 稀释的样品通过市售试剂盒测定甘油三酯水平，使用 1:100 稀释的样品通过二辛可宁酸-总蛋白测定法（bicinchoninic acid-total protein assay）测定总蛋白水平。

5. 来自淋巴液收集的载脂蛋白B48脂蛋白的定量³⁸

1. 采用改良的免疫印迹法测定载脂蛋白ApoB48的浓度³⁸。使用3-8% Tris-乙酸-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总淋巴液。
2. 将分离的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜（0.45 µm），用羊抗ApoB多克隆抗体（1:4,000）孵育，然后与抗山羊二抗结合。
3. 利用化学发光法，通过与纯化的啮齿类ApoB48蛋白标准品进行线性密度比较，定量脂蛋白ApoB48。

结果

对新生仔猪肠淋巴干进行淋巴管插管，可在7天内收集到约1升/24小时的中心淋巴液。本实验收集的淋巴液含有脂质代谢相关成分，主要包括总淋巴蛋白、ApoB48脂蛋白、甘油三酯、总蛋白和胆固醇。表1列出了来自三只仔猪混合淋巴样本中这些脂质成分的代表性含量。值得注意的是，淋巴流量及脂质成分的数值与其他研究者在对肠淋巴管插管后报道的中心淋巴液数据一致（淋巴流量：570 ± 158 至 979 ± 284 ml/24 hr²⁵，360 ± 120 ml/24 hr 至 1080 ± 720 ml/24 hr²⁶；甘油三酯：687 ± 110 mg/dL⁹；胆固醇：63.1 ± 5.6 mg/dL⁹），表明导管已正确置入淋巴管内。

讨论

在多种实验动物模型中，收集肠系膜淋巴液是研究脂质^8-12和药物^13-15代谢、癌症转移^16,17、细胞迁移及免疫功能^18-26机制的优良方法。事实上，能够在较长时间内采集大量外周（传入）和中枢（传出及主干血管）淋巴液，对于理解免疫调节剂刺激后细胞群体发生的时间动态变化尤为重要^18-22,25,26。同样，中枢淋巴液的收集有助于阐明脂蛋白代谢相关的过程^8-12。淋巴液采集的有效性取决于导管插入手术的成功率以及导管在淋巴管内保持通畅的能力。

在大型动物中，对参与肠道淋巴引流的主要淋巴管进行插管通常采用三种手术入路之一。第一种技术采用肩部前侧入路，经覆盖于颈总静脉上方的胸导管进入（牛的胸导管）⁵。第二种技术采用右侧肾脏中侧部上方的腰部入路^32,33。第三种技术如本视频所述，采用腹正中或旁正中^22,35剖腹切口，以暴露位于胰腺附近、紧邻门静脉右腹侧的肠道淋巴主干^22,36,37

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Miller 喉镜片	Welch Allyn	68044	182 mm 长度
Surgivet 顾问：生命体征监护仪	Surgivet	V9203
直肠温度探头	Surgivet	V3417
单极电外科发生器	Valley Lab
Metzenbaum 剪刀	Fine Science	14518-18
Tuffier 拉钩	Stevens	162-11-676
蚊式止血钳	Stevens	162-7-10
Kelly 止血钳（弯头，14 cm）	Stevens	162-7-38
Allis 组织钳	Stevens	162-7-38
敷料钳（带眼，10.2 cm）	Stevens	162-18-780
敷料钳（Adison 型，12.1 cm）	Stevens	162-17-2510
持针器	Stevens	162-V98-42
虹膜剪刀	Fine science	14058-11
循环水泵	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl 保温毯	Jorvet	J-784C
棉签涂抹器	Fisher Scientific	22-037-960
导管插入 管路（4.06 外径 × 2.31 内径）	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane 植入管路
2-0 丝线缝合线	Ethicon	LA556
2-0 聚乳酸-羟基乙酸共聚物缝合线	Ethicon	J443H	2-0 Vicryl
大型动物背心	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
聚丙烯洗瓶	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
青霉素-链霉素	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
两性霉素 B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
盐酸右美托咪定	Zoetis	6295	Dexdomitor
异氟烷	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
盐酸氯胺酮	Zoetis	2626	Ketaset
盐酸丁丙诺啡	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm 气管插管	Jorvet	J-165d
10% 利多卡因喷雾	AstraZeneca		DIN:02003767
4% 氯己定外科洗手液	Partnar Animal Health	PCH-011	稀释后：2.0% 溶液
3M 外科无菌巾	3M Health Care	1040
SDS-PAGE 凝胶	Invitrogen	EA0375BOX	3-8% Tris-乙酸盐
聚偏二氟乙烯膜	Millipore	IPVH00010	0.45 μm 孔径
ApoB 抗体	EMD Millipore	AB742	1:4000 稀释
驴抗山羊 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime 西部印迹检测试剂	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
甘油三酯检测试剂盒	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
总胆固醇检测试剂盒	Wako Pure Chemicals	439-17501
总蛋白	Pierce	23225	双辛可宁酸法测定