我们开发了一种快速、灵敏且可重复的病原体基因表达谱分析方案，用于感染过程中的基因表达研究。
本文内容
摘要
摘要
对于大多数哺乳动物病原体而言，由于技术上的困难，从感染组织中准确量化病原体基因转录本的基因表达谱研究一直受到限制。病原体RNA仅占从感染组织样本中分离的总RNA的极小部分。无论是微阵列还是RNA测序技术，在检测低丰度表达的病原体基因时均难以获得可靠的读数。基因表达水平降低的突变病原体菌株 体内 增殖构成了更大的挑战。本文中，我们描述了一种 体内 一种快速、极高灵敏度且高度可重复的基因表达谱分析方案。我们在研究真菌病原体时开发了该方案。 白色念珠菌 在血源性播散性念珠菌病的小鼠模型中。利用本方案，我们记录了动态调控的时间过程 C. albicans 肾脏感染期间的基因表达，以及抗真菌药物治疗下基因表达反应的意外特征 体内.
引言
基因表达动态蕴含了细胞如何响应环境变化的重要信息。对于感染性微生物而言，基因表达数据可提供具有临床意义的见解，揭示病原体如何适应感染环境并对宿主造成损伤。在过去二十年中，体外（in vitro）和体内（in vivo）的基因表达研究已产生大量数据，为理解感染生物学奠定了基础1-3。然而，当前的表达谱分析技术（包括微阵列和RNA测序）在分析感染过程中病原体基因表达时并不理想。宿主RNA占据了从感染组织样本中提取的总RNA的绝大部分（通常>99%）。宿主RNA会导致微阵列背景信号过高，并在RNA测序中占据绝大多数序列读长。理论上，从感染组织中分离病原体细胞有助于富集病原体RNA，但这会带来额外问题：需要大量感染组织；操作过程繁琐；最重要的是，在漫长的处理过程中难以保持RNA的天然状态或完整性。为了在真实感染过程中获得更全面且准确的病原体基因表达数据，我们着手开发一种能够在混合RNA群体中实现对低丰度RNA物种进行可靠且经济高效的定量分析的实验方案。
NanoString nCounter 是一种近期开发的平台，可利用数字条形码探针对直接进行多重基因表达检测4, 5。该平台的灵敏度与定量逆转录聚合酶链式反应（QRT-PCR）相当，但无需酶促扩增步骤。该技术并非全基因组范围，每次检测最多可检测800个不同基因。因此，选择具有信息价值的基因为探针进行表达谱分析至关重要。本文以人类主要病原真菌Candida albicans在侵袭性感染过程中的基因表达谱研究为例，展示以下内容：1）实验操作的技术细节（实验方案）；2）该方法的灵敏度、重复性及动态范围（代表性结果）；3）基于本方案设计和实施实验时的重要注意事项（讨论）。本实验方案可轻松适用于多种病原体，并已在多个感染模型中成功应用6-9。
方案
所有动物实验均经洛杉矶生物医学研究学院机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 011000），并依照美国国立卫生研究院（NIH）关于动物伦理治疗的指南进行。小鼠饲养于位于Harbor-UCLA研究与教育研究所校园内的AAALAC认证设施中。专职兽医（专长为实验动物医学）负责监督其护理工作。饲养管理严格按照美国公共卫生署出版物"实验动物护理与使用指南"中的规定执行。所有操作均尽可能人道地对待小鼠。每日三次监测小鼠的存活状况和健康情况。明显患病或精神萎靡的小鼠被隔离出群体，并实施安乐死以减轻痛苦。安乐死采用戊巴比妥过量法（210 mg/kg），该方法由美国兽医协会安乐死专家组推荐。
1. 组织、试剂和仪器的准备
- 所有实验均使用体重为20-22 g的雄性Balb/c小鼠。每个实验组通过静脉注射1 × 106个酵母相的C. albicans细胞，接种三只小鼠。在感染后的特定时间点处死动物并采集肾脏。将每只小鼠的肾脏放入螺口管中，液氮速冻后于-80 °C保存，用于后续RNA提取6。
注意：动物实验操作详见Xu et al.6中的描述。 - 在从-80 °C冰箱取出肾脏前，准备好以下试剂和仪器：
- 打开总RNA提取试剂盒，向RLT缓冲液中加入2-巯基乙醇（终浓度为1% v/v），充分混匀（每份样品准备2 ml）。
- 配制苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合液（每份样品需600 µl）。
- 标记M型匀浆管（M-tube），并置于冰上预冷。
- 标记2 ml螺口管，每管加入约300 µl氧化锆珠。
- 检查所需仪器是否齐备：组织解离仪、振荡研磨仪、配有50 ml离心管和96孔板转子的台式离心机、分光光度计。
2. 从感染组织中提取RNA
- 从 -80 °C 冰箱中取出含有肾脏的离心管，置于冰上。向每份肾脏样品中加入 1.2 ml 含 2-巯基乙醇的 RLT 缓冲液。将肾脏与缓冲液一同转移至 M 型匀浆管中。
- 使用组织解离仪，按照预设程序 RNA_02.01 对肾脏组织进行匀浆处理。
- 在室温下，将样品于台式离心机中以 1,000 × g 离心 1 分钟。
- 将 600 µl 匀浆液转移至含有氧化锆珠的螺口管中。剩余匀浆液保存在冰上。
- 向上述步骤的离心管中加入 600 µl 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇（25:24:1）。
- tightly 封盖后，在 4 °C 冷室中使用珠磨振荡器涡旋震荡 3 分钟。
- 在 4 °C 冷室中，以 15,000 × g 离心 5 分钟。
- 小心将水相转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，加入等体积的 70% 乙醇并充分混匀，然后加载至离心柱中（分两次加载）。
- 先用 700 µl RW 缓冲液洗涤离心柱一次，再用 500 µl RPE 缓冲液洗涤两次。将离心柱置于干燥的收集管中额外离心 1 分钟，以去除残留液体。所有离心步骤均在 8,000 × g 下进行。
- 用 50 µl H2O 洗脱 RNA。使用分光光度计在 OD260 处测定 RNA 浓度。
3. 使用数字条形码技术进行基因表达谱分析
- 将报告探针集（绿色盖离心管）和捕获探针集（灰色盖离心管）置于冰上解冻。
- 向报告探针集中加入 130 µl 杂交缓冲液，轻轻颠倒混匀后短暂离心。
- 将 20 µl 混合液加入至 12 个反应管中，每管各加一份。
- 向每管中加入 10 µg 总组织 RNA（体积为 5 µl），用移液器吹打混匀。
- 向每管中加入 5 µl 捕获探针集，通过翻转混匀后短暂离心。
- 将反应体系置于带加热盖的 PCR 仪中，65 °C 孵育过夜（约 18 小时）。
- 从 -20 °C 取出一个样品芯片，使其升至室温。
- 从 4 °C 取出两个试剂板，在台式离心机中以 670 × g 离心 2 分钟。
- 按照屏幕上的逐步说明设置预处理工作站，并选择高灵敏度选项。
- 从 PCR 仪中取出反应产物，立即加载至预处理工作站，选择运行高灵敏度程序（3 小时）。
- 当预处理工作站程序完成后，取出芯片，用透明胶带密封各通道；在芯片底部加入矿物油（仅适用于第一代 nCounter 系统，后续型号无需此步骤），然后将芯片装入数字分析仪中。
- 按照屏幕上的逐步说明设置数字分析仪，并选择高分辨率扫描选项。
- 选择高分辨率（600 个视野）选项，运行扫描程序（约 4.5 小时）。
- 扫描程序完成后，下载结果（或选择通过电子邮件接收结果），并将原始数据导入厂商提供的软件。软件将自动检查数据质量，若数据质量超出正常范围则会发出警示。可使用内置功能进行技术性调整（可选，遵循软件内说明），然后将数据导出为 Excel 文件。
- 使用以下方法之一对数据进行标准化：探针集中所有基因的总读数；一个或少数几个内参基因；高表达基因的几何平均值（参见讨论部分）。
- 计算每个基因的平均表达值（若实验设置了重复或三重复），然后计算不同实验组之间的表达水平比值。
- （可选）使用 nSolver 软件内置功能或聚类分析程序（如 MultiExperiment Viewer10）对表达谱结果进行分析和可视化。
结果
病原体基因表达谱分析的一个主要挑战 体内 是获得足够的病原体RNA测序读长。鉴于病原体转录本在总RNA中所占比例较低，需要使用大量的总RNA（>10 µg) 必须为每个反应使用。该平台在此方面具有独特优势：它同时使用捕获探针和报告探针以提高特异性，从而避免大量宿主RNA产生显著的背景噪声。如图所示 图1 （改编自参考文献6），未感染组织样本的背景原始计数（红点）均低于10，而两个感染组织样本的原始计数（蓝点）均高于10。采用本方案生成的表达数据具有高度可重复性。如图所示 图1 （改编自参考文献6），两个生物学重复的原始计数（蓝色圆点，感染后48小时肾脏样本）具有极好的相关性，R平方值为0.945。该平台还提供了足够的动态范围，可涵盖天然的生物学表达水平图1，原始计数范围在10之间1 和 106).
利用一组特异性针对248个环境应答基因的探针，我们能够区分出病原菌基因表达的两个阶段（图2，改编自参考文献6）：早期基因表达反应包括在接种物与感染后12小时样本之间RNA水平存在显著差异的基因（P<0.05，且表达变化>2倍）；晚期基因表达反应则包括在感染后12小时与48小时时间点之间RNA水平存在显著差异的基因（P<0.05，且表达变化>2倍）。这些结果表明，C. albicans 在哺乳动物宿主的侵袭性感染过程中，其基因表达受到动态调控。
图 1. 来自感染与未感染肾组织的原始计数（改编自参考文献 6）。 两个感染样本（感染后 48 小时，蓝色数据点）和一个未感染样本（红色数据点）的探针计数以散点图形式展示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 侵袭性感染过程中 C. albicans 环境响应基因的表达（改编自参考文献6）。 以热图形式展示了小鼠肾脏侵袭过程中 248 个 C. albicans 基因在表达水平上的变化。图中显示了感染后 12、24 和 48 小时相对于接种物均值（0 小时）的基因上调（黄色）和下调（蓝色）的生物学重复实验的平均值。颜色饱和度表示表达变化的程度，完全饱和对应 10 倍及以上的上调或下调。热图的部分区域被放大，以展示代表性早期上调基因（顶部）、晚期基因（中部）和早期下调基因（底部）。在这些放大区域中，各个样本被单独列出，以说明结果的可重复性。我们将早期表达变化定义为接种物与感染后 12 小时样本之间存在显著差异；晚期表达变化定义为感染后 12 小时与 48 小时样本之间存在显著差异。显著性指变化倍数 >2 倍且 p 值 <0.05。在计算均值前，各样本数据均已根据对照基因 TDH3 的 RNA 水平进行归一化处理。根据我们的分类标准，部分动态调控的基因可能同时属于早期和晚期表达类别。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
本方案旨在利用 nanoString nCounter 平台优化感染性微生物的转录谱分析。整个流程从组织采集到获得表达数据，耗时少于 48 小时。12 个样本的手动操作时间约为 4 小时。本方案中的一个关键变量是在第一步向组织中加入的 RLT 缓冲液体积。缓冲液过多会稀释匀浆液，导致 RNA 浓度降低；而缓冲液过少则可能在苯酚-氯仿抽提步骤后形成黏稠凝胶，导致无水相可用于 RNA 回收。根据经验确定的小鼠组织 RLT 缓冲液最佳用量（假设为典型组织大小）如下：肾脏（1.2 ml）、舌（1.0 ml）和肺（2.0 ml）。对于微生物病原体，尤其是以丝状形式生长的微生物，珠磨步骤有助于破坏厚实的细胞壁，充分释放细胞内容物。在洗脱步骤中，为提高最终 RNA 浓度，可将第一轮洗脱液重新加回到柱子上，进行第二次洗脱。每个 RNeasy 离心柱可回收约 100 µg 总组织 RNA（约 2 µg/µl × 50 µl）。如果需要更多 RNA，可利用剩余的组织匀浆液进行第二次提取。在测定 RNA 浓度之前，请勿丢弃剩余的匀浆液，以防需要补做。
根据感染模型、接种量和病原体菌株的不同，病原体RNA占总组织RNA的比例在0%–2%之间变化，通常处于0.05%–0.5%范围内。例如，从10 µg总组织RNA中 C. albicans 感染的肾脏可产生相当于10 ng纯样的原始计数 C. albicans RNA 来自一个 体外 培养（10 ng/10 µg = 0.1%）。由于病原体RNA占总组织RNA的比例变化范围较大，因此很难确定在给定量的总RNA中病原体RNA的实际含量。为了避免在病原体RNA含量低于检测限的样本上浪费探针集（针对250个基因×192个反应，每个反应的成本约为200美元），可在实验前进行RNA质量控制步骤，以确定每个样本中的病原体RNA水平。该步骤可通过定量逆转录PCR（Q-RTPCR）或包含少数看家基因的小型探针集来完成。
使用病原体基因进行标准化是在不同样本间比较表达谱之前的关键步骤。常用的标准化方法有三种：1. 使用基因编码集（codeset）中所有基因的总读数；2. 使用一个或少数几个“看家基因”（housekeeping genes）；3. 使用几何平均值（Nth N个数乘积的几何平均根）的高表达基因。对于大型代码集（>100个基因）且探针为随机选择时，使用总读数进行标准化可能是一个较好的选择，因为大量无关基因的总读数能够较真实地反映RNA输入量。对于小型基因集（<100 个基因）包含针对特定过程（例如菌丝生长，因为菌丝生长相关基因往往共调控）的探针时，选择一个或少数几个看家基因作为标准化对照至关重要。TDH3 是一个表达稳定的代谢基因，已在许多实验中被成功用作对照。第三种方法是方法 1 和方法 2 的结合，强调高表达基因的贡献应均等。
尽管nCounter平台并非全基因组范围的检测方法，但它能够在单次实验中对多达800个基因的表达水平进行定量。因此，选择最具信息价值的基因进行分析对于表达谱研究的成功至关重要。目前已有两种探针筛选策略被采用。第一种策略是 "基于知识"结合已发表的基因表达和功能数据，筛选出可能与本研究相关的基因，例如环境响应基因。6-9这种方法便于比较 体内 将谱型数据与大量现有数据集进行比对，从而为数据解读提供背景信息。第二种方法是 "基于探索的"选择微生物基因组中某一类基因，例如所有编码转录因子、激酶或细胞壁蛋白的基因作为探针。该方法可基于此识别新的毒力因子，并发现新的调控关系。 体内 分析数据6.
披露
本实验方案由卡内基梅隆大学 Aaron P. Mitchell 博士实验室开发。本文的发表由 NanoString Technologies 公司赞助。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R21 DE023311（APM）、R56 AI111836（APM & SGF）、R01 AI054928（SGF）和R01 DE017088（SGF）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| gentleMACS 组织解离仪 | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS M 管 | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | QIAGEN | 74104 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M-3148 | |
| 苯酚:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| 氧化锆珠 | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 高通量组织研磨器 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter 分析系统 | nanoString Technologies | ||
| nCounter 基因表达检测探针组 | nanoString Technologies | ||
| nSolver 分析工具 | nanoString Technologies |
参考文献
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