采用朗缪尔-舍弗法（Langmuir-Schaefer method）制备了由热响应性嵌段共聚物组成的纳米级海-岛结构表面，用于调控细胞的自发黏附与脱离。该表面的制备过程以及细胞在其表面的黏附与脱离行为均实现了可视化观察。
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摘要
摘要
通过朗缪尔-施弗特（Langmuir-Schaefer）法制备了固定有温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）的表面，用于调控细胞的黏附与脱离。采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和PIPAAm组成的两亲性嵌段共聚物（St-IPAAms）。将St-IPAAm分子的氯仿溶液轻轻滴加至朗缪尔槽装置中，并水平移动装置的两侧挡板以压缩薄膜，调节其密度。随后，利用表面固定装置将St-IPAAm朗缪尔膜水平转移至经疏水化修饰的玻璃基底上。原子力显微镜图像清晰显示了表面存在纳米级的“海-岛”结构。通过改变温度至PIPAAm分子的低临界溶解温度范围，可调控细胞在所制备表面上黏附与脱离的强度、速率及质量。此外，在优化后的表面上成功回收了二维细胞结构（细胞片）。这些独特的PIPAAm表面在调控细胞黏附与脱离强度方面具有潜在应用价值。
引言
纳米结构表面由于其在图案化、细胞培养、清洁和表面切换等方面的多种潜在应用，近年来受到了广泛关注。例如，受荷叶纳米结构及其他响应性表面启发的超疏水表面能够对外部刺激产生响应1-4。
朗缪尔膜（Langmuir film）是研究最广泛的聚合物涂层之一。通过将两亲性分子滴加到气-水界面，可形成朗缪尔膜5-8。随后可通过物理或化学吸附的方式将该膜转移到固体表面，并利用垂直或水平转移方法调控分子在固体表面的构象9-12。通过压缩气-水界面，可精确调控朗缪尔膜的密度。近年来，该方法已被证明在利用两亲性嵌段共聚物制备纳米尺度的“海-岛”结构方面同样有效。这些纳米结构被认为由疏水链段构成的内核和亲水链段构成的外壳组成13-17。此外，通过调控嵌段共聚物在界面处的分子占据面积（Am），可控制表面纳米结构的数量。
我们专注于一种原创且独特的无支架组织工程技术——细胞片工程技术，该技术利用温度响应性培养表面。该开发技术已应用于多种器官的再生治疗18。温度响应性培养表面是通过将一种温度响应性分子——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）接枝到表面而制备的19-27。PIPAAm及其共聚物在水性介质中表现出约32 °C的低临界溶解温度（LCST）。该培养表面也表现出在疏水性和....
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方案
1. 通过两步可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合合成聚苯乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)
- 将苯乙烯（153.6 mmol）、4-氰基-4-(乙基硫代羰基)硫代戊酸（ECT；0.2 mmol）和4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)（ACVA；0.04 mmol）溶于40 ml 1,4-二氧六环中。在真空条件下将溶液置于液氮中冷冻15–20分钟以去除活性物质，随后在室温下缓慢解冻。确保溶液完全解冻后，重复此冷冻-抽真空-解冻除气循环三次。
- 在油浴中于 70 °C 下聚合 15 小时，制备分子量（Mw）为 13,500 的聚苯乙烯（PSt）作为大分子 RAFT 试剂。
- 用800 ml乙醚沉淀PSt大分子RAFT试剂，并干燥 在真空中.
- 将IPAAm单体（4.32 mmol）、PSt大分子RAFT试剂（0.022 mmol）和ACVA（0.004 mmol）溶解于4 ml 1,4-二氧六环中。
- 按照步骤1.1中所述，通过冷冻-抽气-解冻脱气循环去除溶液中的氧气。
- 在脱气后，于油浴中70 °C条件下进行15小时聚合反应。以与合成PSt大分子RAFT试剂相同的方法获得合成的St-IPAAm分子（Mw: 32,800）。
2. 硅烷化疏水改性玻璃基底的制备
- 用过量的丙酮....
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结果
通过RAFT自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)（St-IPAAm）组成的嵌段共聚物，其具有特定的分子量。如Moad et al.28所述，采用ECT作为链转移剂。合成了两种具有不同PIPAAm链长度的St-IPAAm分子，并通过1H核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）对所得嵌段聚合物进行了表征。St-IPAAm的分子量分别为32,800和67,900，分子量分布较窄（1.31和1.50）。聚苯乙烯大分子RAFT试剂和PIPAAm的单体转化率分别为17.4%和超过85.0%。所合成的St-IPAAm分别命名为St-IPAAm170和St-IPAAm480。
通过将溶于氯仿溶液中的St-IPAAm分子滴加到气-水界面，制备了具有不同分子面积（Am）的Langmuir膜（图1A）。滴加St-IPA.......
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讨论
通过朗格缪尔-许弗尔（Langmuir-Schaefer）方法制备了一种温度响应性表面，并对细胞黏附/脱附及细胞片层回收的表面性能进行了优化。采用该方法制备表面时，多个步骤至关重要。St-IPAAm 分子的分子组成对表面结构、表面稳定性以及细胞黏附与脱附行为具有显著影响。特别是，St-IPAAm 分子应具有较窄的分子量分布。在本方法中，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法合成了两种具有不同 PIPAAm 链长的 St-IPAAm 分子，从而实现了对分子量及分子量分布的精确调控。
在制备 St-IPAAm 表面时，应采取措施防止气-水界面受到污染，以避免纳米结构出现缺陷。在将聚合物分子滴加到界面前，应抽吸污染物，直至表面压力降至约 0 mN/m。污染物容易在槽体边缘和威尔赫尔米（Wilhelmy）板周围积聚。由于威尔赫尔米板表面存在部分污染，已对其进行退火处理。当使用滤纸制成的威尔赫尔米板时，应在界面处重复抽吸步骤至少两次。π-Am 等温线曲线也受气-水界面污染状况的影响。我们建议在成膜前至少重复测量一次等温线曲线。由于疏水性修饰的玻璃基底也可能被污染，应.......
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披露
所有作者均同等程度地参与了论文的撰写，并已批准最终版本。作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究由日本文部科学省（MEXT）“先进跨学科研究计划创新中心创建项目”资助，项目名称为“细胞片组织工程中心（CSTEC）”。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| N-异丙基丙烯酰胺 | Kohjin | 无目录编号 | |
| 偶氮二(4-氰基戊酸) | 和光纯药工业 | 016-19332 | |
| 苯乙烯 | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-三氧六环 | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-二氧六环 | 和光纯药工业 | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | 中野 | 11482-15 | |
| 链霉素 | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| 青霉素 | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | 日本生物血清公司 | JBS-11501 | |
| BAECs | 健康科学研究中心资源库 | JCRB0099 | |
| 盖玻片 | 松内玻璃工业 | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | 东曹 | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | 东曹 | ||
| Langmuir-Blodgett 沉积槽 | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA 中型槽 |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | 尼康 |
参考文献
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al.
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