用于组织工程的温敏型纳米结构表面的制备

摘要

采用朗缪尔-舍弗法（Langmuir-Schaefer method）制备了由热响应性嵌段共聚物组成的纳米级海-岛结构表面，用于调控细胞的自发黏附与脱离。该表面的制备过程以及细胞在其表面的黏附与脱离行为均实现了可视化观察。

摘要

通过朗缪尔-施弗特（Langmuir-Schaefer）法制备了固定有温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）的表面，用于调控细胞的黏附与脱离。采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和PIPAAm组成的两亲性嵌段共聚物（St-IPAAms）。将St-IPAAm分子的氯仿溶液轻轻滴加至朗缪尔槽装置中，并水平移动装置的两侧挡板以压缩薄膜，调节其密度。随后，利用表面固定装置将St-IPAAm朗缪尔膜水平转移至经疏水化修饰的玻璃基底上。原子力显微镜图像清晰显示了表面存在纳米级的“海-岛”结构。通过改变温度至PIPAAm分子的低临界溶解温度范围，可调控细胞在所制备表面上黏附与脱离的强度、速率及质量。此外，在优化后的表面上成功回收了二维细胞结构（细胞片）。这些独特的PIPAAm表面在调控细胞黏附与脱离强度方面具有潜在应用价值。

引言

纳米结构表面由于其在图案化、细胞培养、清洁和表面切换等方面的多种潜在应用，近年来受到了广泛关注。例如，受荷叶纳米结构及其他响应性表面启发的超疏水表面能够对外部刺激产生响应^1-4。

朗缪尔膜（Langmuir film）是研究最广泛的聚合物涂层之一。通过将两亲性分子滴加到气-水界面，可形成朗缪尔膜^5-8。随后可通过物理或化学吸附的方式将该膜转移到固体表面，并利用垂直或水平转移方法调控分子在固体表面的构象^9-12。通过压缩气-水界面，可精确调控朗缪尔膜的密度。近年来，该方法已被证明在利用两亲性嵌段共聚物制备纳米尺度的“海-岛”结构方面同样有效。这些纳米结构被认为由疏水链段构成的内核和亲水链段构成的外壳组成^13-17。此外，通过调控嵌段共聚物在界面处的分子占据面积（A_m），可控制表面纳米结构的数量。

我们专注于一种原创且独特的无支架组织工程技术——细胞片工程技术，该技术利用温度响应性培养表面。该开发技术已应用于多种器官的再生治疗¹⁸。温度响应性培养表面是通过将一种温度响应性分子——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）接枝到表面而制备的^19-27。PIPAAm及其共聚物在水性介质中表现出约32 °C的低临界溶解温度（LCST）。该培养表面也表现出在疏水性和亲水性之间随温度变化的可逆转换。在37 °C时，接枝了PIPAAm的表面呈疏水性，细胞能够像在传统组织培养用聚苯乙烯表面一样，顺利贴附并在其上增殖。当温度降低至20 °C时，表面变为亲水性，细胞则会自发地从表面脱离。因此，通过改变温度，即可将培养至融合状态的细胞以完整细胞片的形式收获。这种随温度变化的细胞贴附与脱离特性，也可通过朗缪尔膜涂覆法制备的表面在实验室演示中实现^{26, 27}。研究人员制备了由聚苯乙烯（P(St)）和PIPAAm组成的嵌段共聚物的朗缪尔膜（St-IPAAm）。具有特定A_m值的朗缪尔膜可水平转移至经疏水化修饰的玻璃基底上。此外，还评估了细胞在所制备表面上随温度变化的贴附与脱离行为。

本文描述了一种在玻璃基底上制备由热响应性两亲嵌段共聚物组成的纳米结构朗缪尔膜的实验方案。该方法可能为表面科学多个领域中的有机纳米薄膜制备提供一种有效的技术手段，并有助于更有效地调控细胞在表面的黏附以及从表面的自发脱离。

方案

1. 通过两步可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合合成聚苯乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)

1. 将苯乙烯（153.6 mmol）、4-氰基-4-(乙基硫代羰基)硫代戊酸（ECT；0.2 mmol）和4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)（ACVA；0.04 mmol）溶于40 ml 1,4-二氧六环中。在真空条件下将溶液置于液氮中冷冻15–20分钟以去除活性物质，随后在室温下缓慢解冻。确保溶液完全解冻后，重复此冷冻-抽真空-解冻除气循环三次。
2. 在油浴中于 70 °C 下聚合 15 小时，制备分子量（Mw）为 13,500 的聚苯乙烯（PSt）作为大分子 RAFT 试剂。
3. 用800 ml乙醚沉淀PSt大分子RAFT试剂，并干燥 在真空中.
4. 将IPAAm单体（4.32 mmol）、PSt大分子RAFT试剂（0.022 mmol）和ACVA（0.004 mmol）溶解于4 ml 1,4-二氧六环中。
5. 按照步骤1.1中所述，通过冷冻-抽气-解冻脱气循环去除溶液中的氧气。
6. 在脱气后，于油浴中70 °C条件下进行15小时聚合反应。以与合成PSt大分子RAFT试剂相同的方法获得合成的St-IPAAm分子（Mw: 32,800）。

2. 硅烷化疏水改性玻璃基底的制备

1. 用过量的丙酮和乙醇清洗玻璃基底（24 mm × 50 mm），并超声处理5分钟，以去除表面污染物。
2. 将基底在65 °C的烘箱中干燥30分钟。然后在室温下使用氧气等离子体（400 W，3分钟）活化基底表面。
3. 将基底浸入含有1%己基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，在室温下过夜，以实现基底的硅烷化。
4. 用甲苯清洗硅烷化后的基底，并将其浸入丙酮中30分钟，以去除未反应的试剂。
5. 在110 °C下退火处理基底2小时，以充分固定表面。
6. 使用玻璃切割刀将硅烷化基底切割为25 mm × 24 mm，以适配细胞培养皿（培养皿尺寸：φ35 mm）。

3. 朗缪尔膜及膜转移表面的制备

1. 将朗缪尔膜天平仪器置于柜子中，以防止灰尘积聚。
2. 用蒸馏水和乙醇清洗朗缪尔槽（尺寸：580 mm × 145 mm）及挡板，以去除污染物。
3. 用无绒布擦拭槽体和挡板使其干燥。然后向槽中加入约110 ml蒸馏水，并将挡板置于槽的两侧。注意，在后续步骤3.5至3.13中添加蒸馏水时应避免洒出。
4. 用气体燃烧器加热用于监测表面张力的铂金威尔赫米板（周长：39.24 mm），直至其变红，随后用蒸馏水清洗以去除污染物。将威尔赫米板悬挂在连接至表面压力测量仪器的金属丝上。
5. 根据制造商的操作规程将表面压力测量仪器归零。通过槽体两侧的挡板压缩空气-水界面，使界面面积压缩至约50 cm²，此时不加入任何聚合物液滴。
6. 吸除少量污染物，直至表面压力接近0 mN/m。
7. 重新调整两侧挡板的位置，并添加蒸馏水以补偿步骤3.6中损失的水量。
8. 将5 mg合成的St-IPAAm分子溶解于5 ml氯仿显影液中。
   注意：二氯甲烷或甲苯也可作为溶剂使用。
9. 使用微量注射器或移液枪，将27 µl溶于氯仿的St-IPAAm溶液轻轻滴加到槽面上。
10. 静置5分钟，使氯仿完全蒸发后，水平移动两侧挡板以压缩界面处的St-IPAAm分子。保持挡板压缩速率为0.5 mm/sec，直至达到目标面积50 cm²。
    注意：过快的压缩速率会导致朗缪尔膜出现缺陷。
11. 在压缩过程中，根据制造商的操作规程，使用连接在表面压力测量仪器上的铂金威尔赫米板测量表面压力（π）-A_m等温线。
12. 达到目标面积后，保持界面稳定5分钟，使St-IPAAm分子得以松弛；分子在压缩后不会立即达到平衡状态。
13. 使用转移装置将朗缪尔膜转移至疏水改性的玻璃基底上，持续5分钟，以牢固吸附成膜。将疏水性玻璃基底平行固定在装置上。将装置连接至对准平台并垂直移动。
14. 用转移装置将基底水平提起，并在干燥器中干燥1天。

4. 在朗缪尔膜转移表面上培养细胞并优化细胞黏附与解离

1. 制备细胞悬液时，将牛颈动脉内皮细胞（BAECs）在含10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO₂和95%空气条件下，在组织培养用聚苯乙烯（TCPS）表面培养至约三分之一汇合度。
2. 当细胞达到汇合状态后，在37 °C、5% CO₂和95%空气条件下，用3 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA处理BAECs 3分钟。
3. 加入10 ml含10% FBS的DMEM以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用，并将细胞悬液收集至50 ml锥形管中。
4. 以120 × g离心5分钟，吸除上清液，再用10 ml DMEM重悬细胞。
5. 将St-IPAAm表面置于洁净台内的紫外灯下照射5分钟，进行灭菌处理。
6. 使用一次性血细胞计数板计数，以1.0 × 10⁴ cells/cm²的浓度将回收的细胞接种到St-IPAAm表面，并在配备培养箱的显微镜下于37 °C、5% CO₂和95%空气条件下观察细胞在表面的生长情况。
   注意：使用洁净台配备的紫外灯对St-IPAAm表面进行灭菌。
7. 在37 °C条件下，使用10倍放大倍率的相差显微镜连续拍摄贴壁BAECs的延时图像约24.5小时；BAEC贴壁后，再于20 °C条件下记录BAECs从St-IPAAm表面脱落的过程，持续约3.5小时。

5. 在朗格缪尔膜转移表面上制备细胞片

1. 以第4节所述相同方式培养BAECs。
2. 在St-IPAAm表面接种总量为1.0 × 10⁵ cells/cm²的细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。当温度降至20 °C时，融合的BAECs自发脱落。

结果

通过RAFT自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)（St-IPAAm）组成的嵌段共聚物，其具有特定的分子量。如Moad et al.²⁸所述，采用ECT作为链转移剂。合成了两种具有不同PIPAAm链长度的St-IPAAm分子，并通过¹H核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）对所得嵌段聚合物进行了表征。St-IPAAm的分子量分别为32,800和67,900，分子量分布较窄（1.31和1.50）。聚苯乙烯大分子RAFT试剂和PIPAAm的单体转化率分别为17.4%和超过85.0%。所合成的St-IPAAm分别命名为St-IPAAm170和St-IPAAm480。

通过将溶于氯仿溶液中的St-IPAAm分子滴加到气-水界面，制备了具有不同分子面积（A_m）的Langmuir膜（图1A）。滴加St-IPA...

讨论

通过朗格缪尔-许弗尔（Langmuir-Schaefer）方法制备了一种温度响应性表面，并对细胞黏附/脱附及细胞片层回收的表面性能进行了优化。采用该方法制备表面时，多个步骤至关重要。St-IPAAm 分子的分子组成对表面结构、表面稳定性以及细胞黏附与脱附行为具有显著影响。特别是，St-IPAAm 分子应具有较窄的分子量分布。在本方法中，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法合成了两种具有不同 PIPAAm 链长的 St-IPAAm 分子，从而实现了对分子量及分子量分布的精确调控。

在制备 St-IPAAm 表面时，应采取措施防止气-水界面受到污染，以避免纳米结构出现缺陷。在将聚合物分子滴加到界面前，应抽吸污染物，直至表面压力降至约 0 mN/m。污染物容易在槽体边缘和威尔赫尔米（Wilhelmy）板周围积聚。由于威尔赫尔米板表面存在部分污染，已对其进行退火处理。当使用滤纸制成的威尔赫尔米板时，应在界面处重复抽吸步骤至少两次。π-A_m 等温线曲线也受气-水界面污染状况的影响。我们建议在成膜前至少重复测量一次等温线曲线。由于疏水性修饰的玻璃基底也可能被污染，应...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N-异丙基丙烯酰胺	Kohjin		无目录编号
偶氮二(4-氰基戊酸)	和光纯药工业	016-19332
苯乙烯	Sigma-Aldrich	S4972
1,3,5-三氧六环	Sigma-Aldrich	T81108
1,4-二氧六环	和光纯药工业	045-24491
DMEM	Sigma	D6429
PBS	中野	11482-15
链霉素	GIBCO BRL	15140-163
青霉素	GIBCO BRL	15140-122
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4174
FBS	日本生物血清公司	JBS-11501
BAECs	健康科学研究中心资源库	JCRB0099
盖玻片	松内玻璃工业	C024501
AFM NanoScope V	Veeco
1H NMR INOVA 400	Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700	Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC	东曹
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000	东曹
Langmuir-Blodgett 沉积槽	KSV Instruments	KN 2002	KSV NIWA 中型槽
Nikon ECLIPSE TE2000-U	尼康