跟踪和量化的发育过程℃。线虫使用开源工具

Summary

这里展示了如何跟踪和量化秀丽隐杆线虫的发育过程。所介绍的方法基于可以轻松实现的开源工具。它演示了如何重建 3D 细胞形状模型，如何手动跟踪亚细胞结构，以及如何分析皮质收缩流。

Abstract

定量捕捉发育过程是非常重要的衍生机理模型和关键识别和描述突变表型。在这里，协议提出了准备胚胎和成人C.线虫动物的短期和长期的时间推移显微镜和用于跟踪发育过程和定量的方法。提出的方法都是基于C.线虫菌株可从线虫遗传学中心和开源软件，可以在任何实验室可以轻松实现使用的显微系统的独立。一个三维细胞形状模型的使用建模软件IMOD甲重建，使用多功能图像分析程序Endrov，和皮质收缩流的使用PIVlab分析荧光标记的亚细胞结构的手动跟踪（时间分辨数字粒子图像测速显示了MATLAB工具）。它是讨论如何将这些方法也可以部署吨Ø定量捕捉不同的模型 ，例如，细胞跟踪和谱系等发育过程跟踪，跟踪囊泡流动。

Introduction

用荧光蛋白质，基因组工程，光学显微镜，和计算机软，硬件的稳步提高，现在有可能在一个前所未有的时空分辨率来记录的多模式生物发展。这使研究人员询问了无法事先解决问题或重新已知的发育过程，以寻找忽视的方面。这一进展已经引发了定量发育生物学，其目的是改变定性的，非正式的模型转化为定量模型被彻底的测量和统计分析领域。

跟踪细胞和亚细胞结构使得有可能导出胚胎发育，神经系统的活动，或细胞分裂^1-12的定量模型。到了C的早期发育过程中追踪细胞分裂残部线虫胚胎，我们可以最近发现，他们遵循一个立体类型化的道路，构成了重要的偏光因素^13,14。

在这里，协议提出，使定量发育生物学的方法对非专业人士访问。重点在于三个直接的，免费的工具，是可实现的，有访问标准共聚焦显微镜和计算机的任何实验室。这些包括一个协议，以产生三维细胞形状，一个协议来跟踪细胞分裂残余，和协议来定量描述皮质肌动球蛋白动力学。线虫C.线虫用作示例性情况下，然而，这里讨论的方法和工具适于多种其他生物模型 ，例如，培养的细胞，组织外植体，组织体或球状体，其它胚胎等问题

一般情况下，一些这里显示的分析也可以用流行的开源工具的Imag....

Protocol

1.编写C的线虫胚胎时间推移显微镜使用微球

1. 通过使用蠕虫拾取（铂丝）成一滴M9的缓冲区传送妊娠成虫和由第一剧烈搅拌，然后用眼睛睫毛安装到牙齿拾取/枪头将每个蠕虫的M9相邻滴擦去菌或用尖锐的玻璃毛细管。
2. 稀释包含20微米直径的聚苯乙烯珠10倍于M9缓冲液（1升M9缓冲液含有3克KH _{2 PO 4，6}克_的 Na 2 _HPO 4，5克NaCl的分散性，和，高压灭菌（20分钟，120°后C）中，添加额外的1毫升的1M _硫酸镁溶液）。
3. 做一个口吸管从任何类型的薄玻璃毛细管（ 例如，熔化用来拉注射针点毛细管或毛细管），大致0.5米长的一块橡胶，硅树脂或类似材料管（最好是透明的）中，200微升枪头，200μl的PCR管的盖子，疏水性过滤器为小的注射器（例如，一个0.2-0.45微米孔径和15-50毫米直径的尼龙，聚四氟乙烯或类似材料过滤器），和一个1000微升枪头。这种类型的嘴吸管确保没有生物材料可以与实验者接触得到。
4. 通过首先插入200μl的移液管尖的尖端插入管子组装吸管和用PCR管具有中央穿孔，所用的毛细管的直径相匹配的盖将其插入。一个非常尖锥子或制剂的针可以用于产生穿孔。
5. 画一条细细的毛管，将其插入穿孔。插入过滤器进入软管的另一端，并插入一个1000微升枪头作为口形件（ ....

Results

通过使用协议2，3和4中，在野生型C.性腺延时成像线虫的成人进行（株OD58（UNC-119（ED3）III; ltIs38 [PAA1;馅饼-1 :: GFP :: PH（PLC1delta1）+ UNC-119（+）]），从一个种系的启动子表达的膜标记物）。着眼于性腺的转弯，从显微镜数据（图2）产生的生殖细胞的3D模型。此模型允许的变化来分析细胞大小而细胞中转形成远端到近端臂，揭示了脊柱的组织和个体细胞对脊柱触点的大小（也见的http://www.wormatlas。组织/雌雄同体/生殖％20LINE / Germframeset.html）。

接着，协议1，3和5被用于执行C的长期时间推移显微镜线虫的胚胎（株CHP52这是应变RW10226的横（UNC-119（ED3）III; itIs37 [馅饼-1P :: mCherry :: H2B ::饼1 3'UTR + UNC-119（+）]; stIs10226 [他-72启动HIS-24 :: mCherry翻译融合让-.......

Discussion

通过对象跟踪的发展，特别是核跟踪，已经能够阐明C.中央构图机制线虫胚胎发育^1,23,24。扩展这一战略提供更高的吞吐量，它最近已经可以发现更多的构图规则，并提出一种方法如何演绎构图规则从头 ^10。对于许多突变体，但是，精确的构图缺陷，还是一个未知数。此处描述的方法的工具，可有助于其澄清。重要的是，现在已经很清楚，近年来，虽然许多其他模型系统不遵循像C.一个不变的发展线虫 ，目标跟踪和量化的跟踪数据的分析是确定发展机制和疾病的机制的一个重要工具。

此处示出的方法特别适合于这种情况:要么太有挑战性实现更复杂和/或自身产生的软件解决方案，或简单地太昂贵实现商业软件工具，分别。重要的是，这里所讨论的工具使研究者加载和独立地在其上仪器他们已经记录分析的任何数据。此外，如果专有的图像采集软件的使用，ImageJ的提供生物格式插件，可以在专有格式读取数据，然后将它们保存在标准格式（JPEG，TIFF）。

在依.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
体视显微镜	Motic/VWR	OT4005S	用于解剖和封片
聚苯乙烯微球的体视显微镜，	Polysciences	18329	胚胎安装
20 µm
Polybead 聚苯乙烯微球，	Polysciences	876	成年动物支架
0.1 µm
显微镜载玻片	VWR	631-0902	成年动物安装
盖玻片 18x18 mm	VWR	631-1331	胚胎/成人安装
盖玻片 24x60 mm	VWR	631-1339	胚胎安装
手术刀	VWR	233-5455	胚胎解剖
硅胶管	VWR	228-1501	口腔移液器
30 mm PTFE 膜过滤器	NeoLab	Jul-01	口腔移液器过滤器
毛细管	VWR	621-0003	口腔移液器吸头
凡士林	Roth	E746.1	胚胎/成人安装
琼脂	Roth	5210.5	成年动物安装
磷酸二氢钾	Roth	P018.2	M9 缓冲液
磷酸二钠	Roth	P030.2	M9 缓冲液
氯化钠	Roth	3957.1	M9 缓冲液
VisiScope 转盘共聚焦系统	Visitron Systems	n/a	共聚焦显微镜