方法文章

一种适用于植物FISH的快速空气干燥滴片染色体制备方法

DOI：

10.3791/53470

⸱

2015年12月16日

 ,  , 
1Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London

本文内容

摘要

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本文描述了一种通过快速空气干燥滴片法制备高质量有丝分裂植物染色体铺展的实验方案，该方法适用于单拷贝和高拷贝DNA探针的荧光原位杂交（FISH）检测。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色体玻片制备是成功进行荧光原位杂交 原位 杂交（FISH）。由于植物细胞壁较为坚硬，制备高质量的植物染色体铺展样本具有挑战性。目前公认的植物染色体制备方法之一是所谓的滴片法，也称滴片铺展法或空气干燥法。本文介绍一种快速制备适用于单拷贝和高拷贝DNA探针FISH检测的有丝分裂染色体铺展样本的实验方案。该方法是在相对湿度为50%–55%条件下进行的空气干燥滴片法的改进版本，步骤中减少了洗涤次数，使其操作简便、高效且可重复。该方法的显著优势在于能够获得铺展良好、结构完整且数量丰富的中期染色体，为成功的FISH分析提供了理想的前提条件。采用本方案，我们获得了高质量的染色体铺展样本以及可重复的FISH结果 大麦，H. bulbosum，H. marinum，H. murinum，H. pubiflorum 和 Secale cereale.

引言

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荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）是一种在染色体水平上对单拷贝和高拷贝序列进行物理定位的有效工具。其前提是制备高质量的染色体铺展样本。目前尚无一种通用的染色体制备方案可同时适用于动物和植物细胞。由于植物细胞具有刚性细胞壁以及不同物种间细胞质状态差异较大，植物染色体的制备尤为困难。其中一种较为理想的方法是所谓的滴片法，也称为滴片铺展法或空气干燥法。 1,2该方法最初于1958年由Rothfels和Siminovitch提出 体外 培养的哺乳动物细胞 3. 后来马丁 等 4 和 Kato 等 5 将该方法改良用于植物。

最近开发了一种名为“SteamDrop”的方法，利用水蒸气制备非重叠的染色体6。尽管此前已观察到高湿度的积极作用7，但“SteamDrop”提供了一种可控制的高质量染色体制备流程6。蒸汽处理可导致染色体伸展，这可能与染色体蛋白的某些修饰有关。所获得的中期展片质量非常高，但在后续进行FISH实验时，要保留足够数量的完整中期展片仍需具备较高的技术经验。

本文介绍了一种制备适合用于单拷贝和高拷贝探针FISH检测的小麦染色体有丝分裂标本的实验方案 5,8该方法是Kato所描述的空气干燥滴片法的一种改进变体。 9 在相对湿度为50%-55%的条件下进行（图1）。该方案减少了洗涤步骤的数量，使其操作简便、高效且可重复。采用本方案，我们获得了高质量的染色体铺展和FISH结果 大麦，H. bulbosum，H. marinum，H. murinum，H. pubiflorum 和 黑麦（Secale cereale）.

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方案

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1. 染色体制备

  1. 种子萌发与根尖固定
    1. 将10-20粒大麦种子置于培养皿中两层湿润滤纸上，在22-24 °C黑暗条件下萌发2天。使用剃刀切取长度为1-2 cm的健壮根尖。
    2. 将装有冷水的500 ml玻璃瓶放入碎冰-水混合物中制备冰冻冷水。对冰冻冷水进行通气，并将根尖浸入其中20小时，以提高中期细胞的出现频率。
    3. 将根尖从水中转移至50 ml乙醇:乙酸（3:1）固定液中，在室温 下固定2天。之后将根尖保存于新配制的乙醇:乙酸（3:1）固定液中，置于4 °C冰箱中可保存长达一年。
  2. 洗涤与酶处理
    1. 使用50 ml玻璃烧杯，以30 ml冰冻自来水分两次、每次5分钟洗涤10-20个根尖。使用双目显微镜操作。用镊子逐个将根尖转移至30 ml 0.01 M柠檬酸缓冲液（0.01 M柠檬酸 + 0.01 M柠檬酸钠，pH 4.8）中，并轻轻振荡烧杯，洗涤两次，每次5分钟。将根尖置于滤纸上彻底去除液体，并用剃刀切除非分生组织部分。
    2. 将最多20个根尖置于表面皿中的1 ml酶混合液中，在37 °C孵育约50分钟，以软化植物组织（表1）。酶混合液包含0.7%纤维素酶R10、0.7%纤维素酶、1%果胶酶和1%细胞解离酶，溶于0.01 M柠檬酸缓冲液中。酶混合液可储存于-20 °C，最多重复使用五次。
    3. 用移液器吸除酶液，并在冰上用5 ml 0.01 M柠檬酸缓冲液洗涤根尖两次，每次5分钟，以去除残留酶液。
  3. 根尖解离
    1. 在同一个表面皿中，用1 ml 96%乙醇小心洗涤根尖两次。弃去乙醇，加入新配制的固定液（75%乙酸 : 25%乙醇），每根根尖使用10-15 µl固定液。
    2. 将根尖连同固定液转移至2 ml离心管中，用解剖针或镊子捣碎根尖分生组织。轻弹管壁20次以重悬细胞，获得细胞悬液。细胞悬液可储存于-20 °C，最长两个月。
  4. 滴片
    1. 在50 °C加热板上放置2-3层浸水滤纸。将显微镜载玻片浸入冰箱中冰冻自来水中30分钟，随后将载玻片放置在湿润滤纸上。
    2. 用移液器吸取7-10 µl细胞悬液，从20 cm高度滴加到放置在加热板上的冷却载玻片上。在同一位置再滴加10 µl乙酸-乙醇混合液，并将载玻片继续留在加热板上2分钟。随后将载玻片从湿滤纸上取下，置于加热板上干燥1分钟。
  5. 玻片质量控制与保存
    1. 使用相差显微镜检查玻片，评估染色体铺展质量。可于当日使用，或将其浸入盛有96%乙醇的柯林斯瓶（Coplin jar）中，于-20 °C保存。
  6. FISH前玻片预处理；所有步骤均在室温下进行
    1. 将玻片放入盛有50 ml 2x SSC（20x SSC含3 M NaCl和300 mM柠檬酸三钠）的柯林斯瓶中，浸泡5分钟。用镊子将玻片转移至盛有50 ml 45%乙酸的柯林斯瓶中，浸泡3-10分钟。
    2. 将玻片转移至盛有50 ml 2x SSC的柯林斯瓶中，浸泡10分钟。再将玻片转移至盛有50 ml 4%甲醛（溶于2x SSC）的柯林斯瓶中，固定染色体10分钟。
    3. 用盛有50 ml 2x SSC的柯林斯瓶冲洗玻片三次，每次4分钟，以去除甲醛。随后将玻片依次在70%、90%和100%乙醇中各脱水2分钟，最后将玻片垂直放置晾干。

2. 荧光In Situ杂交（FISH）

  1. 每张载玻片准备总共 20 µl 的杂交溶液，其中包含 10 µl 去离子甲酰胺、5 µl 4x 杂交缓冲液（200 µl 缓冲液包含 80 µl 20x SSC、8 µl 1 M Tris-HCl pH 8.0、1.6 µl 0.5 M EDTA、11.2 µl 10 µg/µl 鲑精 DNA 和 99.2 µl 无 DNase 水）、3 µl 探针以及 2 µl 无 DNase 水。
  2. 每张载玻片加入 20 µl 杂交溶液，覆盖 24 × 32 mm 盖玻片，并用橡胶胶水固定盖玻片。将载玻片与探针一同置于热板上，在 80 °C 下变性 2 分钟。
  3. 将载玻片转移至湿盒中，在 37 °C 下避光过夜孵育。用 Coplin 瓶中的 2x SSC 溶液冲洗载玻片以去除盖玻片，随后将载玻片放入盛有 55–60 °C 2x SSC 溶液的 Coplin 瓶中，孵育 20 分钟。
  4. 将载玻片置于盛有 2x SSC 溶液的 Coplin 瓶中，在室温下孵育 2 分钟。随后在 Coplin 瓶中依次用 70%、90% 和 100% 乙醇进行脱水处理，每步各 2 分钟。
  5. 将载玻片空气干燥，然后用含 1 µg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂复染，避免强光照射。

3. 显微镜分析与保存

  1. 使用落射荧光显微镜分析载玻片。滤光片的选择取决于探针标记所用的荧光染料。如有必要，可将载玻片在4 °C避光条件下保存长达一年。

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结果

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采用上述快速空气干燥滴片染色体制备方法制备含有有丝分裂中期染色体展布的显微载玻片补充图1）。FISH分析使用了重复序列和单拷贝序列。图像通过落射荧光显微镜获取，显微镜配备可激发相应荧光染料的滤光片组，并由高灵敏度CCD黑白相机采集。图像采集使用配备图像采集软件的计算机完成。采用5S rDNA和[CTT]对有丝分裂中期染色体进行FISH实验的结果10，且单拷贝探针清晰且质量较高 大麦 (图2A、B)，H. bulbosum (图2C), H. marinum，H. murinum，H. pubiflorum 和 黑麦（Secale cereale） (图2D）。这种方法的显著优势在于能够获得分布均匀、形态完整且数量丰富的中期染色体，为成功的FISH分析提供了理想的前提条件。细胞悬液可在-20 °C保存长达两个月，并在FISH实验当天制备染色体铺片。新制备的载玻片也可保存于-20 °C的96%乙醇中，但我们观察到，...

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讨论

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染色体标本制备实验采用禾本科（Poaceae）谷类作物的幼根进行。所有分析的物种在二倍体基因组中均具有14条相对较长的有丝分裂中期染色体（11-15 µm），且均属于大基因组物种（5.1-7.9 Gbp）。

为获得最大量的分生组织，萌发根的长度不超过2 cm。通过持续20小时的冰水处理使分裂细胞同步化，从而提高了有丝分裂中期 spreads 的数量10。

制备高质量染色体标本有两个关键步骤：（I）相对湿度为50%-55%，以及（II）酶处理时间。第一个条件通过在载玻片附近热板上放置湿润的纸巾来实现，相对湿度使用湿度计进行测量。植物染色体标本制备的最佳湿度与Kirov et al. 6 报道的湿度相似。在最佳相对湿度下，细胞质膨胀和细胞壁水解有助于提高染色体质量。

酶解处理的时间取决于物种（表1）。酶解处理的时间还受根部在乙醇/乙酸中固定时间以及根部大小的影响。根部在固定液中保存...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们衷心感谢德国研究基金会（DFG）提供的经费支持（项目编号：HO 1779/21-1），并感谢卡特琳·库姆克（Katrin Kumke）和维特·舒伯特博士（Dr. Veit Schubert）（IPK，加特斯莱本）提供的技术指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
加热板MEDAX GmbH12603
纤维素酶 R10DuchefaC8001
纤维素酶 CalBioChem219466
果胶酶SigmaP3026
细胞溶解酶SigmaC8274
Texas Red-12-dUTPInvitrogenC3176直接荧光染料 
Fluor488-5-dUTPInvitrogenC11397直接荧光染料 
荧光显微镜Olympus BX61BX61
CCD 相机Orca ER, HamamatsuC10600
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) Vector LaboratoriesH-1200荧光染料

参考文献

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  1. Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
  2. Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
  3. Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
  4. Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
  5. Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
  6. Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).
  7. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
  8. Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
  9. Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
  10. Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
  11. Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
  12. Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
  13. Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).

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