侧根诱导系统（LRIS）可实现侧根的同步诱导，本文介绍了该系统在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米中的应用。
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本文内容
摘要
摘要
侧根发育对根系的形成具有重要贡献，因此对植物生长至关重要。然而，侧根起始的研究较为繁琐，因其仅发生在根内少数细胞中，且发生方式难以预测。为解决这一问题，已开发出一种侧根诱导系统（Lateral Root Inducible System, LRIS）。通过连续使用生长素运输抑制剂和人工合成的生长素处理幼苗，可在主根中实现高度可控且同步的侧根起始，从而能够大量获取特定发育阶段的样本。该LRIS最初是为 拟南芥，但也可应用于其他植物。因此，该方法已针对玉米（maize）进行了调整和应用。玉米（Zea mays））。本文详细介绍了该系统在两种植物中的不同操作步骤。将此系统与比较转录组学相结合，可实现对功能同源基因的鉴定 拟南芥 其他物种中的侧根起始基因，如此处所示 CYCLIN B1;1 (CYCB1;1 玉米中的细胞周期基因。最后，讨论了在为其他植物物种开发LRIS时需要考虑的原则。
引言
根系对植物生长至关重要，因为它能够固定植株并从土壤中吸收水分和养分。由于根系的扩展主要依赖于侧根的产生，因此侧根的起始与形成过程已被广泛研究。侧根起始于中柱特定的一类细胞亚群，称为起始细胞1。在大多数双子叶植物（如Arabidopsis thaliana）中，这些细胞位于原生木质部极2，而在单子叶植物（如玉米）中，则位于韧皮部极3。起始细胞的特征是生长素响应增强4，随后表达特定的细胞周期基因（例如 CYCLIN B1;1 / CYCB1;1），接着进行第一轮不对称的垂周分裂5。经过一系列协调的垂周分裂和平周分裂后，形成侧根原基，最终发育为独立的侧根。然而，侧根起始的位置和时间难以预测，因为这些事件既不频繁也不同步，这限制了转录组学等分子研究方法在该过程研究中的应用。
为解决这一问题，已开发出一种侧根诱导系统（Lateral Root Inducible System, LRIS）6, 7在此系统中，先用以下方法处理幼苗 N-1-萘基邻苯二甲酰胺酸（NPA），可抑制生长素的运输与积累，从而阻断侧根的起始发生8随后将幼苗转移至含有合成生长素1-萘乙酸（NAA）的培养基中，整个中柱鞘层对升高的生长素水平产生响应，从而大量诱导侧根起始....
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方案
1. 拟南芥 LRIS 实验方案
注意：本文涉及 "小" 或 "大" 小规模实验。小规模实验，例如标记谱系分析和组织学染色6, 14，仅需少量样品。大规模实验，如定量实时qRT-PCR、微阵列9-11 或RNA测序需要较大量的样本，因此Vanneste等人每个样本使用了约1000株幼苗 等.11 在根段解剖后进行微阵列实验。
第1天
- 灭菌 拟南芥 种子
注意：请选择以下种子灭菌方法之一。任一方法均适用于本实验方案的后续步骤。与液体灭菌法（1.1.1）相比，气体灭菌法（1.1.2）具有两个主要优势：在处理大量种子时耗时更短，因为无需对各个样品进行移液操作；且灭菌后的种子可保存更长时间。然而，该方法需要使用干燥器，并需谨慎操作。- 液体灭菌
- 将所需数量的种子倒入微量离心管中。每管使用不超过 20 mg（约 800 粒种子）置于 1.5 毫升 管或2 ml中40 mg（约1600粒种子） 微型离心管
- 加入1 ml 70%乙醇，倒置或轻轻振....
- 液体灭菌
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结果
应用LRIS技术对侧根起始过程进行比较转录组学分析
LRIS 的一个应用是在不同物种中比较和关联侧根形成过程中的基因表达谱。比较转录组学方法使得鉴定在不同物种侧根发育过程中发挥作用的同源基因成为可能。侧根起始由已形成的根轴内特定细胞亚群形成新器官的过程组成，是被子植物调控根系结构所共有的主要机制。因此，该过程很可能起源于共同祖先中存在的已有通路，并在进化过程中得以保留。事实上，已在不同物种中发现了一些共同的侧根起始潜在调控因子17, 18。
使用LRIS进行采样 拟南芥 和玉米，以及转录组分析
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讨论
在 拟南芥 LRIS 实验方案中，必须仅转移那些完全在含有 NPA 的培养基中生长的幼苗。这可确保在整个根系长度上抑制侧根起始。为防止转移过程中损伤幼苗，可将弯头镊的镊臂钩住幼苗子叶下方。转移时，需确保幼苗根部与含有 NAA 的琼脂培养基充分接触。可通过将根在琼脂表面短距离轻扫来实现这一点。这将确保在整个根系长度上高效且同步地诱导侧根起始。根可在光照条件下生长，且不会对根的生长及侧根诱导产生不利影响。
在玉米侧根诱导系统（LRIS）实验方案中，必须确保籽粒的胚根朝下并紧贴滤纸，以保证根系向下生长并从正确的一侧附着于滤纸上16。经过三天NPA处理后，幼苗应已从籽粒中萌发，长出短小的茎叶、一条主根和若干胚根16。 在进行侧根起始诱导前，主根长度应约为2 cm。本实验方案采用B73玉米自交系建立，若使用生长速率不同的其他玉米品系，需相应调整培养时间。请确保纸卷始终保持湿润，定期补充50 µM NPA溶液以补偿随时间蒸发的液体，否则NPA处理效果可能不足，导致非预期的早期侧根发育。该系统本身可防止根部暴露于光照，但即便.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Davy Opdenacker 提供的技术支持与摄影协助。我们非常感谢 Annick Bleys 博士对改进稿件提出的宝贵建议。本工作由比利时联邦科学政策办公室的大学间吸引计划项目 IUAP P7/29 “MARS”、FWO 基金项目 G027313N 以及科技创新署 IWT（IR）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 拟南芥侧根诱导系统 | |||
| 种子 | |||
| 拟南芥种子 | 生态型 Col-0 | ||
| 种子气体灭菌 | |||
| 微量离心管 1.5 ml | SIGMA-ALDRICH | 0030 125.215 | Eppendorf 微量离心管 3810X，PCR 级洁净 |
| 微量离心管 2 ml | SIGMA-ALDRICH | 0030 120.094 | Eppendorf Safe-Lock 微量离心管 |
| 盐酸 | Merck KGaA | 1,003,171,000 | 37%（发烟）分析纯 EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu |
| 玻璃干燥器 | SIGMA-ALDRICH | Pyrex | |
| 玻璃烧杯 | |||
| 塑料微量离心管盒或支架 | |||
| 种子漂白灭菌 | |||
| 乙醇 | Chem-Lab nv | CL00.0505.1000 | 乙醇，绝对纯 100% a.r.，稀释至 70% |
| 次氯酸钠 (NaOCl) | Carl Roth | 9062.3 | 12% |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | |
| 无菌水 | |||
| 培养基 | |||
| MS 盐混合物（Murashige 和 Skoog） | DUCHEFA Biochemie B.V. | M0221-0050 | |
| 肌醇 (myo-inositol) | SIGMA-ALDRICH | I5125-100G | |
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) | DUCHEFA Biochemie B.V. | M1503.0100 | |
| 蔗糖 | VWR, Internation LLC | 27483.294 | D(+)-蔗糖 Ph. Eur. |
| KOH | Merck KGaA | 1050211000 | 分析纯颗粒（Na 含量 ≤ 0.002%）EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| 植物组织培养琼脂 | LabM Limited | MC029 | |
| 侧根诱导化学试剂 | |||
| N-1-萘基邻苯二甲酸 (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0926.0250 | 10 µM（拟南芥） |
| 1-萘乙酸 (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0903.0050 | 10 µM（拟南芥） |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| 制作转移用筛网 | |||
| 尼龙筛网 | Prosep byba | 合成尼龙筛网 20 µm | |
| 播种与幼苗处理 | |||
| 方形培养皿 | GOSSELIN | BP124-05 | 12 x 12 cm |
| 50 ml DURAN 管 | SIGMA-ALDRICH | CLS430304 | Corning 50 ml 离心管 |
| Drigalski 涂布棒 | Carl Roth | K732.1 | |
| 移液器 | |||
| 剪切移液器吸头 | Daslab | 162001X | 通用 200，灭菌前剪去 5 mm 尖端 |
| 透气胶带 | 3M Deutschland GmbH | cat. no. 1530-1 | |
| 镊子 | Fiers nv/sa | K342.1; K344.1 | Dumont 镊子 a 型编号 5；Dumont 镊子 e 型编号 7 |
| 生长条件 | |||
| 生长室 | 21 °C，持续光照 | ||
| 材料 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 玉米侧根诱导系统 | |||
| 种子 | |||
| 玉米籽粒 | B-73 | ||
| 籽粒漂白灭菌 | |||
| 玻璃烧杯 | |||
| 磁力搅拌器 | Fiers nv/sa | C267.1 | |
| 次氯酸钠 (NaOCl) | Carl Roth | 9062.3 | 12% |
| 无菌水 | |||
| 侧根诱导化学试剂 | |||
| N-1-萘基邻苯二甲酸 (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0926.0250 | 50 µM（玉米主根），25 µM（玉米不定根） |
| 1-萘乙酸 (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0903.0050 | 50 µM（玉米） |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| 播种与幼苗处理 | |||
| 纸制手巾 | Kimberly-Clark Professional* | 6681 | SCOTT 手巾卷 - 白色；单张尺寸 (24 x 46 cm) |
| 种子发芽纸 | Anchor Paper Company | 10 X 15 38# 种子发芽纸 | |
| 镊子 | Fiers nv/sa | K342.1; K344.1 | Dumont 镊子 a 型编号 5；Dumont 镊子 e 型编号 7 |
| 250 ml（离心）管 | SCHOTT DURAN | 2160136 | 直径约 5.6 cm，高 14.7 cm |
| 700 ml 管 | DURAN GROUP | 213994609 | 圆柱形带底座管，D 60 x 250 |
| 支架 | 用于玉米管，自制 | ||
| 无菌水 | |||
| 生长条件 | |||
| 生长箱 | 27 °C，持续光照，相对湿度 70% |
参考文献
- Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
- Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development.....
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重印与许可
