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方法文章

小鼠原位下肢移植

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DOI：

10.3791/53483

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2016年2月12日

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

这种新型的小鼠原位下肢移植模型采用无缝合套管技术进行超显微血管吻合，为 在 体内 与带血管复合组织异体移植（VCA）相关的机制性免疫学研究

摘要

体内 动物模型系统，尤其是小鼠模型，已发展成为强大且多用途的科学工具，是移植医学领域基础研究和转化研究不可或缺的部分。在此体系中，有大量试剂可供使用，包括用于诊断和干预应用的单克隆和多克隆抗体。此外，众多经过基因分型的近交系、转基因系和基因敲除小鼠品系，使得研究人员能够深入探究体液免疫和细胞免疫各组分在复杂免疫应答相互作用中的独立贡献，从而使小鼠成为免疫学研究的金标准。

带血管复合组织异体移植（VCA）是一个新兴的移植领域，通过同种异体移植物实现对因创伤或先天性组织缺损患者的“以类似换类似”修复。本手术方法学方案展示了在原位小鼠后肢移植模型中，采用无缝合套管技术进行超显微血管吻合的操作过程。该模型可特异性地将实体器官移植中的既定范式与由多种不同组织成分构成的新型移植形式进行比较。尤为独特的是，该模型能够实现具有活性的带血管骨髓腔室及其微环境的移植，这些结构可能对免疫接受与排斥之间的平衡产生有益影响。该技术为研究同种抗原识别、移植物排斥与接受机制提供了有效工具，同时也推动了功能性神经再生研究，从而进一步促进这一新兴移植领域的发展。

引言

20世纪90年代末标志着重建性移植的开创性时代，1998年在法国成功完成了首例手部移植手术。自此以后，血管化复合组织移植（VCA）已被成功应用于广泛患者群体中，用于修复严重的组织缺损。截至目前，全球已有76名患者接受了112例上肢移植，以及31例面部移植1-3。此外，还开展了其他多种类型的VCA移植，包括腹壁4、喉5、气管6、血管化关节7，甚至阴茎8移植。最近，子宫移植后成功实现活产婴儿的案例也已有报道9。全球日益积累的临床经验表明，对于那些因严重功能组织缺损而无法通过传统重建和修复手术及治疗手段改善病情的患者而言，重建性移植已成为一种有效的治疗选择。

尽管“以同类替代同类”的理念激发了临床热情，但对于维持同种异体移植物及其功能所需的传统高剂量免疫抑制治疗所带来的副作用，目前仍普遍存在质疑10,11。然而，正如Lee et al.的开创性研究所表明的，这些复合移植物相较于其各个独立组分更不易发生排斥反应；此外，某些组织组分（如带血管的骨组织）可能对免疫接受与排斥的平衡产生独特的免疫学影响，这进一步增强了人们的乐观预期12。

本课题组率先建立了多种用于实体器官移植以及血管化复合组织异体移植的显微外科动物模型13-19。本文介绍了一种新型外科手术方法，采用无缝线套管技术，在原位小鼠后肢移植模型中实施超显微血管吻合。该移植模型为研究免疫接受与排斥机制，以及在免疫学特性多样性的小鼠物种背景下，各组织成分（如血管化骨髓腔室）在诱导免疫耐受中的作用，提供了有力工具。此外，肢体的原位移植为神经再生及功能结局研究创造了条件，这对血管化复合组织移植（VCA）领域具有重要意义。

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方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会（JHUACUC）批准。具体实验操作均在批准的ACUC方案MO13M108下进行。 

1. 供体手术

  1. 在手术前，根据每种药物制剂的特点，在适当的时间点给予镇痛处理。按照批准的动物护理与使用方案，在皮肤切口前1小时，皮下注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡。
  2. 通过连接异氟烷挥发器的麻醉舱以4%异氟烷对供体动物进行镇静诱导，并通过鼻罩以2%异氟烷维持镇静与麻醉状态。在手术开始前，通过脚趾夹捏回缩反射评估麻醉深度。
  3. 佩戴口罩、一次性隔离衣和手套。
  4. 剃除手术区域毛发，特别是后肢和腹股沟区域，并使用10%聚维酮-碘进行皮肤消毒。
  5. 使用无菌手术巾、经高压灭菌的器械以及高倍显微镜（40倍）。
  6. 使用剪刀从腹股沟区域向大腿中部做皮肤切口，并环绕切口连接，以将后肢与小鼠其余身体部分分离。
  7. 识别并分离股动脉、股静脉和神经。使用镊子和显微剪刀将这三种结构完全分开。
  8. 在完成血管蒂的解剖后，使用显微剪刀在腹股沟韧带水平切断血管。
  9. 接着，继续使用剪刀在大腿中段水平向上切断个体腹侧（缝匠肌和大腿内侧肌群）和背侧肌群20，以将移植物从供体动物上完全分离。
  10. 横断股骨，并使用剪刀在股骨干中点处切断。
  11. 通过过量异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死动物，确认心跳和呼吸停止。
  12. 使用安装在注射器上的33G灌注针（见材料表），以2 ml 含肝素（30 I.E.）的冷（4 °C）生理盐水灌注肢体。
  13. 分别在股静脉和股动脉上各放置一个聚酰亚胺套管。
  14. 将移植物包裹于湿润的棉纱布中，置于培养皿内，并在4 °C保存直至植入。

2. 受体操作

  1. 后肢切除
    1. 手术前，根据每种药物制剂的适当时间点给予镇痛。按照批准的动物护理和使用方案，在皮肤切口前1小时皮下注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡。
    2. 通过连接异氟烷挥发器的密闭舱室以4%异氟烷对供体进行镇静，并通过鼻罩以2%浓度维持镇静和麻醉状态。在操作开始前，通过脚趾夹捏回缩反射监测麻醉深度。
    3. 在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹小鼠眼部，防止角膜干燥。
    4. 剃除手术区域毛发，特别是后肢和腹股沟区域，并用10%聚维酮-碘进行消毒准备。
    5. 使用剪刀从腹股沟开始向上至大腿中段做皮肤切口，并环绕切开，以明确分离后肢与小鼠其余身体部分。
    6. 识别并解剖股动脉、股静脉和神经，使用镊子和显微剪刀将这三种结构分离。
    7. 一旦完成血管蒂的解剖，于腹股沟韧带水平夹闭股动静脉。
    8. 在浅表腹壁上动脉水平远端切断血管。
    9. 接着，继续使用剪刀在大腿中段水平近端切断腹侧（缝匠肌和大腿内侧肌群）和背侧肌群20，以将供体后肢与受体动物分离。
    10. 使用剪刀在股骨干中段横断股骨。
    11. 对先前已横断的大腿肌肉进行电凝止血，以防止解剖部位出血，从而减少受体失血。
  2. 移植植入
    1. 通过使用温热生理盐水（37 °C）冲洗手术区域，并在术前和术后各注射0.3 ml温热生理盐水，以尽量减少体液流失。
    2. 将移植物放置于准确反映原生后肢解剖位置的方向，对齐受体与移植物的股骨，并使用20 G脊髓穿刺针作为髓内钉连接两者。
    3. 使用可吸收缝线材料（6-0 Polysorb）吻合腹侧和背侧肌群。
    4. 采用无缝合套环技术连接股血管；具体操作为将受体侧血管拉过先前安装在移植物血管末端的套环上。使用10-0尼龙缝线行环形结扎，将受体血管固定于套环上。
    5. 随后松开血管夹。此时应目视确认套环旋转情况及位置是否理想，以避免血管扭转或成角。
    6. 使用电凝设备仔细止血，特别关注肌肉供体-受体交界面及骨断端区域。
    7. 使用不可吸收尼龙缝线（6-0 Ethilon）缝合皮肤。
    8. 通过将动物置于加热灯下的笼中恢复，建立正常体温环境。在送回饲养设施前，持续常规监测至少4小时。
    9. 术后给予丁丙诺啡镇痛，剂量为0.1 mg/kg，皮下注射，每6–8小时一次 ，持续3天。

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结果

在小鼠模型中采用无缝线套管技术进行带血管复合组织异体移植，可实现优异且长期的移植物和动物存活率，如图1所示。此外，该方法可稳定地获得带血管复合组织异体移植中移植物逐渐排斥的可重复结果，如图2所示图像所证实。发生排斥反应动物组织的H&E染色组织学结果进一步印证了该小鼠模型中异体移植物排斥反应的可重复动态过程（图3）。

卡普兰-迈耶生存曲线，同基因型与异基因型VCA，术后天数（POD）的生存率，实验结果。
图1. 完全H2不相容小鼠品系组合中的异体移植物存活情况 [Balb/c (H2Kd...

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讨论

血管化复合组织异体移植（Vascularized Composite Allotransplantation），例如用于重建严重组织缺损的上肢移植和面部移植，已成为无法通过常规重建手术治疗的患者的一种有效治疗选择。得益于重建显微外科领域的技术进步，以及在实体器官移植中长期积累的强效免疫抑制和免疫调节治疗经验，如今已能够实现此类特殊患者群体的长期异体移植物存活3,21。然而，为维持移植物存活所必需的长期免疫抑制治疗仍存在显著副作用，这限制了这些能够改善生活质量但非挽救生命的重建手段的广泛应用3,22,23。此外，与实体器官移植相比，血管化复合组织移植（VCA）的成功还依赖于受体神经及时再生进入移植物，以重新支配肌肉实现运动功能，以及恢复感觉成分以感知触觉和温度，从而全面恢复功能。从免疫学角度来看，如同所有移植医学领域一样，重建性移植的最终目标是实现“操作性耐受”状态，即在无需长期维持性免疫抑制的情况下接受异体移植物23。在这方面，小鼠已成为移植免疫学研究中最主要的in vivo模型系统，用于探索在完整免疫系统中实现同种异体抗原特异性耐受的方法。此...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本研究工作由陆军、海军、美国国立卫生研究院（NIH）、空军、退伍军人事务部（VA）以及卫生事务部门资助，以支持AFIRM II项目，资助编号为W81XWH-13-2-0053。美国陆军医学研究采购机构（820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014）为本项目的授奖与管理采购办公室。文中观点、解释、结论和建议均为作者意见，不一定代表美国国防部的立场。

作者谨此感谢 Jessica Izzi（兽医学博士）、Caroline Garrett（兽医学博士）和 Julie Watson（兽医学博士）在本研究期间提供的出色兽医支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
缝线，6-0 尼龙MWI31849
缝线，6-0 PolysorbMWI72667
缝线，10-0 尼龙Aero SurgicalTK-107038
聚酰亚胺导管，25 规格Vention Medical141-0023
聚酰亚胺导管，27 规格Vention Medical141-0015
微血管夹（单个）Synovis00396
微血管夹（双个）Synovis00414
显微剪刀SynovisSAS-18
显微镊SynovisFRS-15 RM-8
显微扩张器SynovisFRS-15 RM-8d.1
显微持针器SynovisC-14
显微钳夹施放器SynovisCAF-4
显微冲洗针头Hamilton10MM, 30°, 33G
乳酸林格液Fisher ScientificNC9968051
丁丙诺啡需 DEA 编号；从医院药房获取
恩诺沙星；BaytrilBayer Health Care186599
肝素从医院药房获取

参考文献

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小鼠模型带血管复合组织异体移植无缝线套环技术超显微血管吻合股动脉静脉解剖聚酰亚胺套环应用股骨骨端对位肌肉群对接移植物排斥反应分析
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