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一种半自动化制备抗体混合物用于人外周血免疫表型分析的方法

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DOI：

10.3791/53485

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2016年2月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Human Immune Monitoring Laboratory, Earle A. Chiles Research Institute, Providence Cancer Center, Providence Portland Medical Center, 2Sony Biotechnology, 3Beckman Coulter, Inc. Life Sciences, 4Bristol-Myers Squibb

本文内容

摘要

全血免疫表型分析对于监测人体免疫系统至关重要。然而，所需试剂种类繁多，且预混染色抗体组合中某些荧光染料稳定性较差，因此需要每日重新配制试剂。本文表明，采用半自动化方式配制染色抗体混合液可减少试剂分配过程中的变异，从而建立更为可靠的免疫表型分析方法。

摘要

通过流式细胞术对外周血进行免疫表型分析，可确定疾病和治疗过程中外周白细胞频率及其活化状态的变化。该方法有望预测治疗效果，并发现新的治疗靶点。全血染色采用未经处理的血液样本，可最大限度减少样本制备过程中可能产生的假象。然而，全血染色也必须使用新鲜采集的血液，以确保样本的完整性。此外，最好在当天配制抗体混合液，以避免串联染料的潜在不稳定性，并防止不同荧光素染料之间的试剂相互作用。因此，全血染色需要进行严格标准化，以控制实验内和实验间的变异性。

本文报道了一种配备二维（2D）条形码阅读器的自动化液体处理系统在流式细胞术抗体混合液制备常规流程中的应用。抗体被转移至以96孔板格式排列的2D条形码管中，并将其内容信息汇总至数据库。液体处理系统可通过查询数据库中的抗体名称，准确定位抗体来源管。该方法消除了传统操作中繁琐的抗体管位置协调工作，具有良好的灵活性：用户只需修改数据库内容，即可轻松调整抗体分装过程中的各项参数，例如所用抗体种类、体积和目标孔位，而无需为每项检测重新编写软件脚本。

一项概念验证实验通过制备11色17抗体流式细胞术检测的重复操作，实现了优异的检测间和检测内精密度。这些方法提高了流式细胞术检测的整体通量，并促进了每日制备复杂抗体混合物的流程，从而支持对新鲜采集的抗凝外周血进行详细的表型表征。

引言

人类外周血的免疫表型分析可确定免疫细胞亚群的数量和质量变化1。该技术有助于揭示作用机制与耐药机制，辅助发现预测性生物标志物，并促进联合免疫疗法的开发。因此，免疫表型分析的验证与标准化受到学术研究人员、临床实验室及工业界的广泛关注。

尽管目前临床上已采用流式细胞术对血液系统恶性肿瘤2,3和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染4,5患者的外周血进行免疫表型分析，但在免疫治疗背景下，外周血的可靠免疫表型分析在验证和标准化方面需要特别考虑，因其需要更全面地覆盖免疫细胞亚群以及活化/抑制性受体1,6-8。成功的免疫表型分析需要严格的标准化，以尽量减少与仪器设置和细胞染色步骤相关的实验间变异9,10。虽然流式细胞仪仪器参数的标准化已较为成熟，可有效解决前者的问题9,11,12，但如何在不局限免疫细胞亚群及其活化状态检测范围的前提下，降低与细胞染色相关的变异，目前仍不明确。

随着待检测抗原数量的增加，由于试剂加样不理想以及交叉污染，出错和产生变异的可能性也随之上升。针对抗凝全血进行表型分析的方法于20世纪80年代末建立，用于临床实验室检测。这些方法同样满足了研究实验室在样本制备方面的需求。重要的是，临床实验室中使用的抗体混合液通常较为简单，并且可从生产商处获得预滴定、预混合的成品，仅需一次转移预混抗体混合液即可。而在研究环境中，通常使用包含10至16种抗体的混合液。每种混合液都必须由实验室验证其稳定性，或在每次检测前新鲜配制。为一个样本配制多个抗体混合液可能需要移液50至80种单独的抗体，这一过程既繁琐又容易出错。

相比于手动配制鸡尾酒法，自动化配制鸡尾酒法具有多项优势，例如减少人为错误、提高移液准确性，甚至可能降低试剂浪费。本文报道了成功将配备二维（2D）条形码阅读器的自动化液体处理系统引入免疫表型分析的细胞染色流程中，以最大限度地减少与样本制备相关的变异。

方案

本方案中采集和使用外周血已获得 Providence Health & Services 机构审查委员会的批准。所有人类受试者均提供了书面知情同意书。

注意：遵循通用预防措施。所有人类血液均应视为具有传染性，并按照生物安全二级（Biosafety Level 2）规范进行操作。

注意：使用外周全血进行免疫表型分析时，需将抗凝全血与荧光标记的单克隆抗体孵育，以检测细胞表面抗原，随后通过低渗裂解去除红细胞。细胞经洗涤后，用流式细胞仪分析样本。本文所述方法重点在于利用配备二维条形码阅读器的自动液体处理仪来制备抗体混合液。首先分别制备用于鉴定免疫细胞亚群的"基础抗体混合液"和用于监测可诱导抗原的"激活抗体混合液"（表1）。然后将这两种混合液合并，配制成"主抗体混合液"。工作流程见图1。

1. 标本

  1. 通过静脉穿刺采集外周血至含肝素钠抗凝剂的采血管中，轻轻倒置数次以确保充分混匀，然后在室温下保存。若样本出现凝块或溶血，则弃用13。

2. 实验器具准备

  1. 用可读标签标记二维条形码管（抗体名称、厂商、目录编号和批号）。
  2. 将供应商（列于下文）提供的抗体小瓶中的全部内容物转移至 表1) 转移至相应的二维条形码管中。
    注意：务必格外小心，避免产生气泡，因为气泡会错误触发液面感应（LLS），导致试剂转移不充分。
    注意：确保每支抗体小瓶中的抗体足以完成本次实验。
  3. 使用二维条形码阅读器读取每个试管的二维条形码。
  4. 使用电子表格软件创建一个包含抗体名称（AB）和条形码读数（BC）的电子表格，并将其保存为逗号分隔值（csv）文件 "AB_BC.csv" (表 2).
    注意：确保将细胞格式设置为 "文本" 不 "数量" 为了保持最初的 "0" 如有条形码号码（例如，0163562544）。添加 "x, 0000000000" 在末尾用于指定数据结束。
  5. 将LLS金属板用螺丝固定至自动液体处理仪平台的框架上，以启用LLS功能。

3. 自动液体处理仪的编程

注意：将在自动化液体处理仪的软件中编程两种方法：a) 在 3.1) 中配制"基础混合液"和"激活混合液"的方法，以及 b) 在 3.2) 中通过混合"基础混合液"与"激活混合液"来制备"主抗体混合液"的方法（图 1）。

  1. 创建一种制备方法 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" (图2).
    1. 使用电子表格软件创建一个电子表格，其中包含抗体名称（AB_NAME）、目标管位置（WELL-BASE 或 WELL-ACT）以及体积（VOL，单位为 μl）的信息 "基础混合液" 使用 P50 吸头（BASE_CT_P50： 表3）或 P200 吸头（BASE_CT_P200： 表4）和 "激活剂混合物" 使用 P50 吸头（ACT_CT_P50： 表5）或 P200 吸头（ACT_CT_P200： 表6）。将它们保存为 csv 文件。对于 "井底" 和 "WELL-ACT" 位置，请参考数字编号 图3.
      注意：VOL = 滴度 ×（染色孔数 + 2）μl。滴度在 表1 具有批号特异性。操作者应参照他人所述方法，针对每种抗体确定其滴度 14.
    2. 单击图标以启动计算机上自动液体处理仪的软件，创建一种制备方法 "基础混合液" 和 "激活剂混合物".
      注意：以下步骤 3.1.3–3.1.7 将定义耗材：带有二维条形码管的试管架（图 4）。测量值仅作为参考，研究人员应针对每台仪器自行确定并调整参数。
    3. 在工具栏下方 "项目"，选择 "实验器材类型编辑器". 右键单击一个用于96孔平底板的对象，选择 "复制" 和类型 "Matrix_OneML_TubeRack" 在弹出窗口中。
    4. 双击该对象 "Matrix_OneML_TubeRack" 打开对话框。选中 "基本信息"，设置 X 为 12.775 cm，Y 为 8.546 cm "跨度" 4.625 厘米 "高度". (图4A).
    5. 接下来，高亮 "运动信息"设置夹持器偏移量 X 为 0，Y 为 0，Z 为 0.3，夹持器夹紧距离 -0.1 cm，夹持器松开距离 2.6 cm，速度限制为 75%，然后检查 "使用夹持器传感器" (图4B).
    6. 然后，高亮 "孔1". 设置如下： "井眼偏移"；1.5 厘米（X）和 1.13 厘米（Y）， "孔数"；12（X）和8（Y）， "井距"；0.9（X）和0.9（Y）， "最大体积"；1,500 μl，规格"；定期， "第2列偏移量"；0，和 "默认音量"; 0 (图4C).
    7. 最后，按压一个 "“编辑…”按钮位于右侧 "孔板配置" (图4C）。在弹出窗口中，按如下设置： "形状"；圆形， "上段桡骨"；0.37 cm， "桡骨下端"；0.37 厘米，以及 "高度"；3.9 厘米。检查 "底部区域" 并设置 "形状"；圆锥体， "半径"；0.37 cm，以及 "高度"；0.4 cm（图 4D).
      注意：以下步骤3.1.8-3.1.11将定义实验耗材：带微量离心管的试管架。所提供的测量值仅作参考。研究人员应根据各自仪器情况进行确定和调整。
    8. 在工具栏下方 "项目"，选择 "实验器材类型编辑器"右键单击一个物体以选择24孔板架 "复制" 和类型 "小型离心管架_微孔离心管".
    9. 双击该对象 "小型离心管架_微孔离心管" 打开对话框。选中 "基本信息"，设置 X 为 12.75 厘米，Y 为 8.5 厘米 "跨度" 3.95 厘米 "高度".
    10. 接下来，高亮 "孔1"设置如下： "井位偏移"；1.621 厘米（X）和 1.181 厘米（Y）， "孔数"；6（X）和4（Y）， "井距"；1.9（X）和1.9（Y）， "最大体积"；1,000 μl，规格"；常规， "第2列偏移量"；0，和 "默认音量"; 0.
    11. 最后，按压一个 "“编辑…”按钮，位于右侧 "孔板配置"在弹出窗口中，按如下设置： "形态"；圆形， "上段桡骨"；0.3345 cm， "桡骨下段"；0.274 cm，以及 "高度"；3.6728 cm。检查 "底部区域" 并设置 "形状"；半球，以及 "半径"0.1575 cm
      注意：以下步骤 3.1.12–3.1.35 将解释如何编程 "新方法" 用于制备的 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" (图2).
    12. 点击 "新方法" 图标并打开。
    13. 拖动一个 "免疫荧光" 图标位于 a 之间 "开始" 和 "完成" 新方法中的图标图2）。单击并选中 "免疫荧光" 图标。在“条件”中输入以下内容：CreateObject("World.EngineObject"模拟
      注意：此操作将阻止软件执行错误检查，并使该方法得以运行。若不执行此步骤，软件会提示数据集信息缺失，因为条形码读数仅在该步骤之后才可获得 "VisionMate：读取条形码" 如3.1.20所述）。由于此步骤会禁用软件中的验证步骤，操作人员必须确认甲板上有足够的吸头和试剂以执行该方法。
    14. 插入一个 "仪器设置" 图标位于两者之间 "然后" 图标和第一个 "结束" 图标位于下方 "免疫荧光" 图标 (图2).
      注意：以下所有步骤中，将图标在 "否则" 图标和第二个 "结束" 图标位于下方 "免疫荧光" 图标，以便步骤被封装在其中 "否则".
    15. 拖动 "仪器设置" 图标位于下方 "否则" 方法中的图标图2).
    16. 点击 "仪器设置" 在方法中点击图标以打开窗口。通过拖动P50 LLS滤芯吸头、P200 LLS滤芯吸头和P1000吸头的图标来配置耗材。 "Matrix_OneML_TubeRack"，两个 "小型离心管架_微孔离心管"，将储液槽放置到图标列表中对应的甲板位置。
    17. 打开对话框以 "Matrix_OneML_TubeRack" 以及命名为 "AB方框". 打开对话框以进行 "小型离心管架_微量离心管" 并将其命名为一个 "基础CT" 用于基础鸡尾酒及其他用途 "ACT_CT" 用于激活鸡尾酒 （图5）).
    18. 拖动一个 "转移" 方法的图标图2) 将缓冲液从储液槽转移至微量离心管的步骤 "基础混合液" 和 "激活剂混合物"转移体积 = 25 μl ×（染色数 + 2） "基础混合液" 且 = 25 μl ×（染色次数 + 2）用于 "激活剂混合物".
    19. 添加移动的步骤 "Matrix_OneML_TubeRack" 到二维条码阅读器上。拖动一个 "VisionMate Move" 方法的图标图2）并指定从初始板位到甲板上条形码读取器位置的移动。
    20. 拖动一个 "VisionMate：读取条形码" 方法的图标图2）。打开对话框，选择 "VisionMate" 设备并将其数据集命名为 "BC_Read".
    21. 拖动一个 "用户暂停" (图2），选择 "暂停整个系统并显示此消息" 在字段中输入一条备注，提醒用户在进入下一步之前确认所有条形码均已读取。
      注意：以下步骤 3.1.22–3.1.26 将利用条形码信息关联孔位位置与抗体名称。这将使自动化液体处理系统能够根据抗体名称定位特定抗体所在的位置。 "AB".
    22. 拖动一个 "报告步骤" 方法的图标图2).
    23. 使用文本程序创建一个文本文件，并将其保存为 "BC_Readout" 在计算机的文档文件夹中。
    24. 打开对话框 "报告步骤"，选择 "文本文件" 报告样式，并选择 "BC检测读数" 通过浏览文件。
      注意：最终结果 "BC_Readout" 文件将包含除吸头外所有甲板上实验耗材的信息，具体配置见3.1.16，包括2D条形码管的条码读取信息及孔位位置信息 "Matrix_OneML_TubeRack".
    25. 添加一个 "创建数据集" 将条形码与孔位信息关联的步骤。拖动 "创建数据集" 方法的图标图2），单击它以打开对话框，选择 "从文件中读取" 并选择 "AB_BC.csv" (表 2 在2.4中创建的，检查 "逗号分隔" 和 "文件包含标题行".
      注意：在文件预览窗口中，应看到抗体名称（AB）和条形码读数（BC）。
    26. 在同一个对话框中 "创建数据集" 在 3.1.25 中，选择 "VM1" 实验耗材的位置 "0" 选择堆栈深度 "匹配样本编号"，并使用该字段 "BC" 与数据集匹配 "BC_Read"选择 "AB" 和 "BC" 用于 "待创建的数据集" (图6).
    27. 拖动一个 "VisionMate Move" 方法的图标（图2）并指明从条形码读取器位置的移动 "VM1" 回到甲板上的初始位置。
      注意：以下步骤 3.1.28-3.1.33 将定义转移步骤 "基础混合液".
    28. 拖动一个 "工作列表" 图标 (图2）并浏览以选择工作列表文件 "Base_CT_P50" (表3）在 3.1.1 中创建。检查 "循环遍历整个工作列表".
    29. 拖动 "转移" 图标正下方 "工作列表" 图标 (图2).
    30. 点击 "转移" 单击图标以打开规格字段。选择其中一个探针，P50 LLS 过滤吸头，选择 "卸载它们" 转移完成后，进行检查 "转移之间更换移液枪头". 通过点击添加来源 "单击此处以添加来源"，选择 "Matrix_OneML_TubeRack" 作为实验耗材，并通过名称选择其在工作台上的位置 "AB方框".
    31. 在规格字段中 "转移", "放大" 在96孔板图上右键单击并选择 "AB" 紧随其后 "使用数据集" 并选择其数值所在的位置 "等于" 和 "= AB_NAME"选择合适的转移技术。
      注意：强烈建议使用LLS，以避免底部附近出现沉淀物。
    32. 在规格字段中 "转移"，通过点击选择目标位置 "单击此处以添加目标位置"，右键单击以放大并选择 "小型离心管架_微型离心管" 作为实验耗材，体积为 "=VOL"，以及按名称在甲板上的位置 "基础CT"缩小后，再次右击，勾选 "将选择指定为文本"，并检查 "使用以下表达式指定目标：" 和类型 "=WELL_BASE" 作为目标板位的变量。
    33. 参照 3.1.29-3.1.32 步骤重复操作 "基础混合液" 使用 P200 吸头，通过选择 csv 文件 "Base_CT_P200" (表4然后选择P200 LLS滤芯吸头，并采用适用于P200 LLS滤芯吸头的正确移液技术。
      注意：以下步骤 3.1.34 和 3.1.35 将定义转移步骤 "激活剂混合物".
    34. 参照 3.1.29-3.1.32 步骤重复操作 "激活剂混合物" 使用 P50 吸头，通过选择 csv 文件 "ACT_CT_P50" (表5）并选择 "ACT_CT" 作为目标位置。右键单击目标位置并检查 "将选择指定为文本"检查 "使用以下表达式指定目标：" 和类型 "WELL_ACT" 作为目标位置的一个变量。
    35. 参照 3.1.34 步骤重复操作 "激活剂混合物" 使用 P200 吸头，通过选择 csv 文件 "ACT_CT_P200" (表6）以及 P200 LLS 滤芯吸头。
      注意：制备方法 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" 保存后可关闭。
  2. 创建一种新的制备方法 "抗体混合液配制" 通过结合 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" 到 5 ml 圆底聚苯乙烯管中（图7).
    注意：以下步骤 3.2.1–3.2.6 将定义实验耗材：装有 5 ml 圆底聚苯乙烯试管的试管架。所列编号仅作参考。研究人员应根据所用仪器进行确定和调整。
    1. 在工具栏下方 "项目"，选择 "实验器材类型编辑器". 右键单击24孔架上的对象，选择 "复制" 和类型 "BiocisionCoolRack_XT" 在弹出窗口中。
    2. 双击该对象 "BiocisionCoolRack_XT" 打开对话框。
    3. 重点 "基本信息"，设置 X 为 12.78 cm，Y 为 8.57 cm "跨度" 和 7.93 cm "高度".
    4. 重点 "孔1"设置如下： "井眼偏移"；1.55 厘米（X）和 1.33 厘米（Y）， "孔数"；6（X）和4（Y）， "井距"；1.95（X）和1.97（Y）， "最大体积"；2,000 μl，规格"；定期， "第2列偏移量"；0，和 "默认音量"; 0.
    5. 开放 "孔板配置" 进行编辑。设置如下： "形状"；圆形， "上段桡骨"；0.5375 厘米， "桡骨下段"；0.48 厘米，以及 "高度"；7.07 厘米。检查 "底部区域" 并设置 "形状"；半球，和 "半径"；0.45 厘米。
      注意：以下步骤 3.2.6–3.2.7 将定义转移步骤，并在步骤 3.2.14 中使用。
    6. 创建一个 csv 文件 "AB_MACT" (表7用于配制抗体混合液的以下标题：a) "SRC_BASE"；一种用于实验室器皿的名称 "基础混合液"，b） "井底"；实验耗材中的孔位位置 "基础混合液"，c） "VOL_BASE"转移体积为 "基础混合液" 以 μl 为单位，d) "SRC活化"；一种用于实验室器皿的名称 "激活鸡尾酒"，e） "WELL_ACT"；实验耗材中的孔位位置 "激活剂混合物"，f） "VOL_ACT"转移体积为 "激活剂混合物" 以 μl、g 为单位 "DEST_MACT"；用于甲板位置信息的 "抗体混合液制备"，以及 h） "WELL_MACT"；试管架中孔位的信息 "主抗体混合液".
    7. 填写 3.2.6 节中创建的标题下的信息表7）如下：a）使用 "基础CT" 在 SRC_BASE 下，b) 列出孔位位置信息 "孔板基部" 如图所示 图3A，c）在单染色中，列出抗体总体积（25 μl 缓冲液 + 所有基础抗体滴度之和） "VOL_BASE"，d）使用 "ACT_CT" 在 SRC_ACT 下，e) 列出孔位位置信息 "井底" 如图所示 图3B，f）在单染色条件下，列出抗体总体积（25 μl 缓冲液 + 所有活化抗体滴度之和） "VOL_ACT"转移25 μl T细胞FM3缓冲液。参考 表1 用于测试1-3，g）使用 "SPL_TUBES_1" （参见 3.2.10） "DEST_MACT"以及 h）列出孔位位置信息 "WELL_MACT" 如图所示 图8.
      注意：以下步骤 3.2.8-3.2.15 将设置用于制备的方法程序 "抗体混合液制备"
    8. 新建一个方法（图7).
    9. 拖动 "仪器设置" 新方法的图标（图7).
    10. 在规格字段中 "仪器设置"，拖动 P1000 吸头图标，两个 "小型离心管架_微孔离心管"，以及 "BiocisionCoolRack_XT" 到甲板图上。打开这两个的对话框 "小型离心管架_微量离心管" 并命名为 "基础CT" 和 "ACT_CT"，具体步骤见3.1.17。打开对话框以 "BiocisionCoolRack_XT" 并命名为 "SPL_TUBES_1" 如3.2.7节所述（图9).
    11. 添加新的 "组" 通过拖动一个 "组别" 方法的图标（图7).
    12. 拖动 "从文件传输" 图标正下方 "组" 图标用于转移 "基础混合液" 用于制备 "主抗体混合液" (图7).
    13. 在规格字段中 "从文件传输"，选择正在使用的 P1000 吸头，选择 "卸载它们" 转移完成后，进行检查 "转移之间更换移液枪头".
    14. 在规格字段中 "从文件传输"，选择文件 "AB_MACT" (表7）通过浏览进行检查 "文件包含标题行"选择 "SRC_BASE" 用于源实验耗材的位置和 "井底" 选择源耗材中的孔位信息 "DEST_MACT" 目标实验耗材 "WELL_MACT" 目标耗材中的孔位信息，并选择 "VOL_BASE" 有关体积信息（图10）。为 P1000 吸头选择合适的转移技术。
      注意：此步骤可能无需使用激光扫描显微镜（LLS）。
    15. 添加另一个 "从文件转移" 通过直接将其拖动到下方 "组" 转移 "激活剂混合物" 需要与之混合的 "基础混合液" 用于制备 "主抗体混合液" (图7）类似地按照3.2.13和3.2.14步骤设置转膜步骤，例外情况如下：a）选择 "SRC活化" 用于源实验器具位置，b) "WELL_ACT" 关于源实验耗材中孔位信息的说明，以及 c) "VOL_ACT" 以获取体积信息。

4. 操作步骤

  1. 首先，双击软件图标以启动计算机上的二维条形码阅读器。
  2. 然后，双击软件图标以在计算机上启动自动化液体处理仪。
  3. 下 "仪器"，选择 "首页 所有分类" 为自动液体处理仪的注射器进行预灌注。确保所有注射器中无可见气泡。
    注意： "首页 所有分类" 还将为仪器提供一个参考点，以便执行后续移动。
  4. 打开制作该方法的 "基础混合液" 以及 "激活剂混合物" (图2在自动化液体处理仪软件中。
  5. 将微量离心管放入 "小型离心管架_微型离心管" 用于 "基础CT" 和 "ACT_CT" 根据数量 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" 待制备图3）。然后根据 "仪器设置" (图5).
  6. 将装有缓冲液的储液槽按缓冲液在甲板上的位置放置 "仪器设置".
  7. 使用8通道螺旋盖脱盖器打开含有抗体的2D条形码管。将管盖按原始顺序放置在盖子存放托盘中，以避免交叉污染。将 "Matrix_OneML_TubeRack" 在甲板上，按照 "仪器设置" (图5).
  8. 根据实验要求，将 P50 LLS 滤芯吸头、P200 LLS 滤芯吸头和 P1000 吸头放置在甲板上 "仪器设置" (图5).
  9. 点击绿色三角形开始图标以启动方法。根据弹出窗口的提示，确保甲板上的所有物品与 "仪器设置" 如方法中所定义。请勿放置任何未在清单中列出的物品 "仪器设置" 在甲板上时，应避免挤压样本舱和/或夹持器。按压 "好的" 继续进行。
  10. 在……之后 "Matrix_OneML_TubeRack" 被移至二维条码阅读器上并读取条码后，另一个弹出窗口将询问是否所有条码均已读取。按下以继续 "好的" 一旦确认。
  11. 自动化液体处理仪完成转移后，使用8通道螺旋盖去盖仪重新盖上二维条形码管的管盖，并将其放回4 °C保存。
  12. 剧烈涡旋所有微量离心管20秒，并将其放回试管架中。
    注意：涡旋振荡不充分可能导致细胞染色效果不佳。
  13. 关闭制作方法 "基础混合液" 和 "激活剂混合物"然后打开制作方法 "抗体混合液配制".
  14. 将预先标记的5 ml圆底聚苯乙烯管放置于 "BiocisionCoolRack_XT" (图8）并将其放置在台面上。标签应注明内容物 "基础混合液" 和 "激活剂混合物" 混合，以及相应的患者编号。
  15. 放置试管架于 "基础混合液", "激活剂混合物"以及甲板上的 P1000 吸头（图9）。开始实验方法（图7）。根据弹出窗口的提示，确保仪器台面上的物品与方法中的仪器设置一致（图9）。按压 "好的" 继续进行。
  16. 当上述步骤完成后，手动向每个含有抗体混合液的5 ml圆底聚苯乙烯管中加入50 μl血液样本。
  17. 在II级生物安全柜内涡旋混匀样本管，室温避光孵育15分钟。注意避免血液在管壁形成条痕，否则会导致染色不均。使用蘸有流式洗涤缓冲液的棉签小心去除管壁上的血液条痕。
  18. 手动加入1 ml红细胞裂解缓冲液，室温避光孵育15分钟。
  19. 加入2 ml流式洗涤缓冲液（0.1%叠氮化钠，1% BSA，10 U/ml肝素溶于1×HBSS中），在400 × g条件下离心5分钟。在II级生物安全柜内弃去上清液。重复此洗涤步骤一次。将染色后的细胞重悬于0.5 ml流式洗涤缓冲液中。
  20. 设置配备荧光激光器和适当滤光片的流式细胞仪，并使用5 ml圆底聚苯乙烯管上样。采用标准的细胞仪校准和荧光补偿方法进行数据采集12,15. 收集所列的全部参数 "荧光团" 在 表1.
    注意：每次实验均应使用适当的对照材料，以确保检测性能正常。
  21. 运行样本后，将获取的数据导出为 fcs 文件。
  22. 使用适当的软件分析数据。根据人类免疫学项目提出的设门策略鉴定T细胞亚群1.

结果

全血免疫表型分析的目标是获取有关免疫细胞的定量信息（免疫细胞亚群的界定）和定性信息（活化状态检测）。我们对人类免疫学项目（Human Immunology Project）提出的T细胞免疫表型分析方案1进行了轻微修改，以提高本方法的整体性能（表1）。我们的T细胞检测方案旨在识别初始T细胞、中央记忆T细胞（CM）、效应记忆T细胞（EM）和效应T细胞。简而言之，我们根据FSC-A和FSC-H区分双联体。然后根据侧向散射和CD45水平对淋巴细胞设门。通过CD3的表达鉴定T细胞。CD3+ T细胞进一步分为γδ T细胞和αβ T细胞。αβ T细胞再分为CD4+和CD8+ T细胞。随后根据CD45RA和CCR7的表达分析CD4+和CD8+ T细胞的亚群：CD45RA-CCR7+为中央记忆T细胞（CM），CD45RA+CCR7+为初始T细胞，CD45RA+CCR7-为效应T细胞，CD45RA-CCR7-为效应记忆T细胞（EM）1。此外，我们还检测其活化标志物如CD38、HLA-DR、ICOS、PD-1、GITR、4-1BB、CD69、NKG2D和OX40的表达，以获取定性信息。

为了展示该方法的精确性，我们对4名健康供体的外周全血样本在同一天内重复染色5次。图11展示了门控淋巴细胞中T细胞亚群百分比与变异系数百分比（%CV）之间的关系。每个亚群在门控淋巴细胞中的T细胞亚群百分比及%CV的详细数据见表8。为简化起见，图11和表8中未包含测试2和测试3的数据。已有文献建议，用于研究目的的表型生物标志物检测，其批间变异系数（inter-assay precision）应低于25%作为可接受标准10。除ICOS+ γδ T细胞（26.64–46.39%，表8）和ICOS+ CD8 T细胞（14.64–58.39%，表8）外，其余所有测量值均符合该标准。这些数值仅用于演示目的。我们并未采用这些测量结果，因为ICOS主要在CD4 T细胞的活化过程中发挥重要作用16。此前已有研究观察到，占总体比例较低的细胞群体其%CV较高的趋势7。若研究人员关注稀有事件的监测，则需增加检测的细胞数量，以克服更高的不精确性17。综上所述，我们的数据表明自动化技术已成功应用于全血免疫表型分析的样本制备过程。

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图1. 使用外周全血进行免疫表型分析的工作流程。 图中展示了免疫表型检测的逐步操作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. 制备“基础混合液”和“激活混合液”方法的概述。 图中展示了在自动化液体处理仪软件中制备“基础混合液”和“激活混合液”的操作步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

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图3. BACE_CT 和 ACT_CT 试管架的布局。 （A）显示试管架“BACE_CT”的布局。（B）显示试管架“ACT_CT”的布局。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4. 带二维条码管的试管架耗材定义。 逐步定义带二维条码管的试管架的操作流程。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图5. 制备“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”方法的仪器设置。 该图显示了制备“基础鸡尾酒”和“激活鸡尾酒”方法的甲板布局。请点击此处查看此图的放大版本。

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图6. “创建数据集”设置。展示“创建数据集”的详细设置。请点击此处查看此图的放大版本。

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图7. 制备“主抗体混合液”方法的概览。 显示了在自动化液体处理仪软件中制备“主抗体混合液”的操作步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8. 含5 ml圆底聚苯乙烯管的试管架布局。图中显示的是试管架“SPL_TUBES_1”的布局。FM3表示荧光减3（即 Brilliant Violet 421、藻红蛋白和别藻蓝蛋白）。请点击此处查看此图的放大版本。

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图9. 制备“主抗体混合液”方法的仪器设置。该图显示了制备“主抗体混合液”方法的甲板布局。请点击此处查看此图的放大版本。

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图10. “从文件转移”设置示意图。 该图展示了“从文件转移”的详细设置。请点击此处查看此图的放大版本。

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图11. 半自动全血免疫表型分析的低变异性。 来自四位健康供体的所有分析细胞群的单个变异系数（CV）值以蓝色空心圆圈表示。回归曲线以蓝色实线表示。红色虚线表示95%置信带，绿色虚线表示95%预测带。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图12. 次优染色的一个示例。 使用对“BACE_CT”和“ACT_CT”的微离心管进行充分或不充分涡旋震荡后进行染色。在B图中可见两个设门的细胞群，其中CD45染色较弱的次要细胞群代表未获得最佳染色效果的细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

组别标记物荧光素克隆号滴定浓度（µl/染色）
基础抗体混合液T细胞CD45FITC2D10.4
CD3Alexa700UCHT11
CD8APC-H7SK10.4
CD4PerCP-CY5.5SK32
CCR7PE-CF5941505031
CD45RAPE-Cy7L481
TCRabBV786T10B9.1A-311
TCRgdBV650B15
激活抗体混合液-1测试1HLA-DRBV421G46-65
CD278(ICOS)PEDX295
CD38APCHB71
激活抗体混合液-2测试2CD279(PD1)BV421EH12.12.5
CD357(GITR)PEeBioAITR5
CD137(41BB)APC  4B4-110
激活抗体混合液-3测试3CD69BV421FN501
CD314(NKG2D)PE1D112
CD134(OX40)APCACT355

表1. 改良T细胞检测抗体列表。

ABBC
CD45_FITC0163562388
CD3_Alexa7000163562110
CD4_PerCP_CY5.50163562364
CD8_APC-H70163562363
CCR7_PE-CF5940163562387
CD45RA_PE-Cy70163562091
TCRab_BV7860163562069
TCRgd_BV6500163562108
A_HLA-DR_BV4210163562339
A_CD278(ICOS)_PE0163562082
A_CD38_APC0163562317
A_CD279(PD1)_BV4210163562340
A_CD357(GITR)_PE0163562093
A_CD137(41BB)_APC0163562315
A_CD69_BV4210163562341
A_CD314(NKG2D)_PE0163562314
A_CD134(OX40)_APC0163562316

表2. 带有二维条形码编号的抗体名称。

组别孔底抗体名称体积
TCELL1CD8_APC-H77.2
TCELL1CD45_FITC7.2
TCELL1CD3_Alexa70018
TCELL1CCR7_PE-CF59418
TCELL1CD45RA_PE-Cy718
TCELL1TCRab_BV78618

表3. 文件“BASE_CT_P50”：抗体名称及体积信息。

组别孔板基底抗体名称体积
TCELL1CD4_PerCP_CY5.536
TCELL1TCRgd_BV65090

表4. 文件“BASE_CT_P200”：抗体名称及体积信息。

组别孔位_ACT抗体名称体积
测试17A_HLA-DR_BV42130
测试17A_CD278(ICOS)_PE30
测试17A_CD38_APC6
测试213A_CD279(PD1)_BV42115
测试213A_CD357(GITR)_PE30
测试319A_CD314(NKG2D)_PE12
测试319A_CD69_BV4216
测试319A_CD134(OX40)_APC30

表5. 文件“ACT_CT_P50”：抗体名称及体积信息。

组别孔位_激活抗体名称体积
测试213A_CD137(41BB)_APC60

表6. 文件“ACT_CT _P200”：抗体名称及体积信息。

供体编号#SRC_
BASE		基础混合液孔
BASE		VOL_
BASE		SRC活化ACTI-
VATION
鸡尾酒		孔
ACT		VOL_ACTDEST_MACT孔
MACT
HD001基础CTTCELL136.8ACT_CTFM3125SPL_TUBES_11
HD001基础CTTCELL136.8ACT_CTTEST1736SPL_TUBES_17
HD001BASE_CTTCELL136.8ACT_CTTEST21342.5SPL_TUBES_113
HD001BASE_CTT细胞136.8ACT_CTTEST31933SPL_TUBES_119
HD002BASE_CTTCELL136.8ACT_CTFM3125SPL_TUBES_12
HD002BASE_CTTCELL136.8ACT_CTTEST1736SPL_TUBES_18
HD002BASE_CTT细胞136.8ACT_CTTEST21342.5SPL_TUBES_114
HD002基础CTTCELL136.8ACT_CTTEST31933SPL_TUBES_120
HD003BASE_CTT细胞136.8ACT_CTFM3125SPL_TUBES_13
HD003基础CTTCELL136.8ACT_CT测试1736SPL_TUBES_19
HD003基础CTTCELL136.8ACT_CTTEST21342.5SPL_TUBES_115
HD003BASE_CTTCELL136.8ACT_CTTEST31933SPL_TUBES_121
HD004BASE_CTTCELL136.8ACT_CTFM3125SPL_TUBES_14
HD004BASE_CTT细胞136.8ACT_CTTEST1736SPL_TUBES_110
HD004BASE_CTTCELL136.8ACT_CTTEST21342.5SPL_TUBES_116
HD004基础CTT细胞136.8ACT_CTTEST31933SPL_TUBES_122

表7. 文件“AB_MACT”：“主抗体混合液”的来源与目标信息。

图1中的群体编号iiiiiiivv
群体名称CD3+ab T细胞gd T细胞CD3+CD4+CD3+CD8+
淋巴细胞百分比 (%)健康供者 #179.8075.202.7049.6022.30
健康供者 #269.4061.905.8544.4016.20
健康供者 #375.8069.604.7542.0023.50
健康供者 #477.2073.501.9852.7018.90
变异系数 (%)健康供者 #11.421.583.702.501.56
健康供者 #22.482.395.742.822.41
健康供者 #31.151.406.321.422.72
健康供者 #40.810.945.451.201.44
平均值1.471.585.301.992.03
标准差0.720.611.130.790.63

表8. 图4中各亚群淋巴细胞百分比及其变异系数（% CV）的原始数据。 为简化数据展示，测试2和测试3的数据未在图5和表8中显示。

讨论

外周血免疫表型分析对于深入了解个体对免疫治疗的反应至关重要。其中的挑战在于实验方法的标准化，以控制实验间的变异性1,14。变异性的主要来源之一是样本的人工操作。因此，部分或完全自动化样本处理有望显著降低实验间的变异性1,14。在本方案中，我们报告了通过引入配备二维条形码阅读器的自动化液体处理系统，用于全血免疫表型分析中的样本染色，成功减少了检测变异性的努力。

在设计上，我们的方法具有多功能性，可通过添加额外的"基础混合液"来监测其他免疫细胞亚群。这些亚群包括辅助性T细胞、调节性T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞和单核细胞（相关论文正在准备中）18。我们通过引入额外的标记物，对联盟推荐的抗体组合进行了优化调整1。细胞群体的鉴定采用与荧光染料偶联的"基础混合液"，其发射光在 brilliant violet 421 (BV421)、藻红蛋白 (PE) 和别藻蓝蛋白 (APC) 检测通道中的干扰最小，以便保留这三个通道用于可诱导抗原的检测。这一设计不仅确保了对免疫细胞活化状态监测的最高灵敏度，还能够灵活地兼容新的活化标志物，因为这三种荧光染料最常与针对可诱导标志物的抗体进行偶联。因此，本方法不仅适用于全血免疫表型分析的抗体混合液制备，也可用于其他样本的染色，包括外周血单个核细胞以及从解离组织（例如，肿瘤组织）中获得的细胞。

成功实施本方法需特别注意耗材准备、程序编写及方法执行中的各个步骤。二维条形码管的准备包括贴上可读标签，并将抗体转移至指定管中。为防止引入错误，建议由两人共同完成此步骤。每次更换电子表格时，研究人员都应验证方法是否正常运行。在编程过程中选择合适的移液方法，可确保液体转移的成功。使用液体液面传感（LLS）技术可在移液时避免吸入抗体管底部的沉淀物，对此我们建议使用P50或P200导电吸头。LLS对于P1000吸头可能不是理想选择，因为LLS在P1000吸头上更为敏感，有时会因气泡的存在而被误触发。在定义耗材高度时，应针对每台仪器进行调整，否则可能导致液体转移不理想，例如吸头边缘与管底之间空间不足时。如图12所示，若"基础混合液"和/或"激活混合液"未充分涡旋混匀，则可能导致染色效果不理想。

我们考虑使用冻干试剂进行细胞染色，作为一种替代方案，以减少与试剂分配相关的变异性19然而，已知亮紫染料的聚合物偶联物之间会发生相互作用，导致非特异性信号。因此，添加超过两种聚合物偶联物（例如， BV421 和 BV650 等等。)在冻干试剂中可能导致非特异性信号传导例如， BV421中BV650背景信号的增加+ 群体20此外，冻干试剂在添加新的染色方案方面缺乏灵活性，通常价格较高，且需要大批量订购。基于上述原因，我们选择使用配备二维条形码试管的自动化液体处理系统。尽管该系统在初期设置上耗时，并需要投入资金购买仪器，但从长远来看，实验通量和重复性的提升将弥补这些不足。事实上，已有多个研究团队报道过成功将自动化液体处理系统整合到免疫表型分析或其他类似应用的工作流程中。21,22用于流式细胞术分析的自动化解决方案也可从商业渠道获得（如 FACS SPA III、Automated Cocktail Preparation Workstation 和 FlowStainer）。这进一步表明，免疫表型分析对自动化抗体混合液制备存在巨大需求。

掌握该技术后，我们预计全血免疫表型分析的全自动化发展将进一步减少实验间的变异性，甚至可能使全血免疫表型分析在多中心临床试验环境中也具备可行性23。我们已开始使用裂解洗涤辅助仪来自动化完成裂解和洗涤步骤。我们还预计，通过自动确定二维条形码管中抗体的体积以及试剂分配过程的追踪，将分别显著改善抗体库存管理和我们方法的质量控制。

披露

YK、ILG、TLM、WLM、DPH 和 KSB：无竞争性财务利益。ANT 是贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc.）的员工。本视频文章的出版由贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc.）赞助。

致谢

感谢 Hannah Puzas 在系统设计与配置方面的协助，以及 Kevin Khovananth 提供的技术建议。本工作的经费由 The Hearst 基金会和 Providence Portland 医学基金会提供。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD LSRFortessaBD Biosciences流式细胞仪
NXp Span-8 实验室自动化工作站 Beckman CoulterA31839实验室自动化工作站 
插入件，管，11 mm，白色，用于 1.5 ml 微量离心管（每箱 25 个）Beckman Coulter373696用于 24 孔管架以容纳微量离心管的配件 
LLS 套件Beckman Coulter719262安装在实验室自动化工作站台架底部以实现液面感应
24 孔管架Beckman Coulter373661用于盛放抗体混合液或血液样本的微量离心管管架
生物危害高压灭菌袋 12 x 24 英寸 红色LabMartM111416用于实验室自动化工作站的一次性高压灭菌袋
VisionMate 高速 2D 条形码读取器Thermo ScientificAB-18502D 条形码读取器
8 通道手持式螺旋盖盖合/去盖器Thermo Scientific4105MAT用于 2D 条形码管的去盖和盖合 
微量离心管Fisher Scientific02-681-335用于配制混合液或向实验室自动化工作站提供血液样本
CoolRack XT CFT24biocisionBCS-534用于盛放样本管
1.0 ml Matrix 螺旋盖琥珀管，带卡扣式管架Thermo Scientific3741AMB用于储存荧光染料偶联抗体的 2D 条形码管
Biomek Span-8 P1000 吸头，导电型，预灭菌带屏障，1,025 µlBeckman Coulter987925用于实验室自动化工作站的吸头 
Biomek Span-8 P50 吸头，导电型，预灭菌带屏障，50 µl（每箱 10 架）Beckman CoulterB01091用于实验室自动化工作站的吸头 
Biomek Span-8 P250 吸头，导电型，预灭菌带屏障（每箱 10 架）Beckman Coulter394627用于实验室自动化工作站的吸头 
BD FACS 溶血液 10x 浓缩液BD Biosciences349202红细胞裂解
Falcon 圆底聚苯乙烯管Fisher Scientific14-959-5样本管
抗 CD45 FITCBD Biosciences347463效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 CD3 Alexa Fluor 700eBioscience56-0038-42效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 CD4 PerCPCy5.5BD Biosciences341654效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 TCRgd BV650BD Biosciences564156效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 TCRab BV786BD Biosciences563825效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 CD8 APC-H7BD Biosciences560179效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 CCR7 PE-CF594BD Biosciences562381效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 CD45RA PE-Cy7BD Biosciences337167效应 T 细胞检测组合（基础）
抗 HLA-DR BV421BD Biosciences562804效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD278(ICOS) PEBD Biosciences557802效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD38 APCBD Biosciences340439效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD279(PD1) BV421BD Biosciences562516效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD357(GITR) PEeBioscience12-5875-42效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD137(41BB) APCBD Biosciences550890效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD69 BV421BD Biosciences562884效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD314(NKG2D) PEBD Biosciences557940效应 T 细胞检测组合（活化）
抗 CD134(OX40) APCBioLegend350008效应 T 细胞检测组合（活化）
BD Vacutainer 塑料采血管，含肝素钠：常规塞Fisher Scientific02-689-6用于采集血液
白蛋白，牛血清，第五组分，RIA 和 ELISA 级EMD Millipore126593用于流式洗涤缓冲液
叠氮化钠Sigma-AldrichS8032用于流式洗涤缓冲液
肝素，钠盐Affimetrix16920用于流式洗涤缓冲液
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)，1x，含钙、镁，不含酚红GE Healthcare Life SciencesSH30588.02用于流式洗涤缓冲液

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