用于研究早期哺乳动物心脏再生的顶端切除小鼠模型

摘要

本研究展示了一种心尖切除的逐步视频实验方案。心尖切除是近期哺乳动物心脏再生研究中备受关注的一种外科手术方法。本研究可能推动心尖切除作为心脏再生机制研究中的标准方法得以广泛应用。

摘要

由于生活方式的剧烈变化，心血管疾病困扰着全世界。心脏再生在修复和恢复因损伤和疾病而丧失的心肌细胞方面具有巨大前景。与某些低等脊椎动物强大的心脏再生能力不同，成年哺乳动物的心脏通常表现出极有限的心脏再生与修复能力。然而，近期研究发现，在出生后第1至第7天（P1至P7）期间，新生小鼠心脏在心尖切除术（即手术性心室尖端截除并暴露左心室心尖）后仍保留显著的再生潜力，这一发现引发了广泛的科学关注。对此发现的一个主要争议可能源于在尝试重复或拓展这一重要发现时所采用的多种不同的手术相关操作流程。本说明动态呈现了小鼠模型中心尖切除术的材料与方法。该啮齿类动物存活手术的关键步骤包括低温麻醉、开胸术、心室心尖的手术切除、缝合以及小鼠的术后恢复。所述方法可拓展心尖切除小鼠模型在心血管研究中的应用。

引言

人类寿命的延长导致了多种与衰老和生活方式相关的疾病，包括作为主要死亡原因的心力衰竭。然而，由于无法替代丢失或功能失调的心肌细胞，目前的治疗方法只能暂时改善心脏功能^{1, 2}。因此，有必要发现并开发用于心脏再生与修复的创新策略。成年哺乳动物心脏的再生能力有限。来自低等脊椎动物（如有尾两栖类和硬骨鱼类）的研究为理解心脏再生背后的分子和细胞机制提供了前所未有的见解^{3, 4}。最近，新生小鼠心脏再生模型的建立可能有助于识别和表征在人类心脏再生过程中更为进化保守的病理生理事件⁵。

心尖切除是指手术切除左心室心尖部分。由于该操作在较年长的小鼠中具有很高的致死率，此操作仅限于出生后1至7天（P1至P7）的小鼠⁶。新生小鼠在心尖切除后的心脏再生过程预期如下：（I）迅速且有效地形成血肿以封闭心尖，防止失血；（II）心肌细胞再生并恢复收缩功能^{5, 7}。近期研究对该模型的重要性和效率引发了争议^8-11。因此，清晰且详细地呈现心尖切除操作显得尤为重要。为此，本实验方案基于先前的方案⁶，以视频形式生动而具体地描述了我进行心尖切除的操作过程。

阐明心脏再生的分子机制对于治疗以心肌细胞丢失和/或损伤为特征的心脏疾病（如心力衰竭^{1, 2}）具有重要意义。鉴于心尖切除术在心脏再生研究中已....

方案

所有小鼠实验均经美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用项目批准，方案编号为 H0083R3。 NHLBI 动物实验伦理委员会批准了该方案，无需使用镇痛剂。

1. 新生小鼠的低温麻醉

1. 手术前将海绵和外科器械在高压灭菌器中灭菌。准备好所有外科手术材料，并在手术前15–20分钟开启干热灭菌器。 提前升温至 240°C 至 270°C。
2. 将所有C57BL/6品系乳鼠（出生后第1天）从哺乳母鼠处转移至装有新鲜垫料和筑巢材料的清洁小鼠笼中。一旦乳鼠被带入手术室，应立即进行顶端手术，以尽量缩短其与母鼠分离的时间，并降低母鼠食仔的风险。
3. 将海绵置于冰床上，然后将一只幼崽放在海绵上约3分钟 以实现低温麻醉。通过观察呼吸暂停和运动不能，并夹捏后肢足部来确认麻醉效果。需频繁检查新生幼崽的状态，因为麻醉时间过短会导致幼崽未达到运动不能和呼吸暂停状态，而麻醉时间过长则可能降低其存活率¹².

2. 开胸术

1. 将幼鼠从冰床上转移至手术台面区域，使用胶带将其四肢和尾巴固定，呈仰卧位。
2. 使用碘伏对胸部进行消毒，并用70%酒精棉片轻轻清洁。
3. 使用Vannas弹簧剪在胸腔第四肋间区域做横向皮肤切口，随后钝性分离第四肋间肌，以暴露心脏。
   注意：手术过程中....

结果

小鼠仔鼠在心尖切除术后1天、2天和21天被实施安乐死，取其心脏进行苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色。马松三色染色中的蓝色区域表示心外膜细胞外基质的沉积⁵。成功实施心尖切除术后，左心室在术后1天即形成有效血凝块以封闭创面，如图1A所示。随后可观察到血凝块逐渐被吸收并出现早期心脏纤维化，之后由心肌组织逐步替代，至术后21天完成心肌的完全再生（图1B和C）。形态学分析显示，在手术后21天，切除组与假手术组心脏之间无明显差异（图1C和D）。

图1. 典型的H&E染色和Masson三色染色结果。 新生小鼠心脏在心尖切.......

讨论

心脏再生在治疗和预防心力衰竭方面展现出巨大潜力^{1, 2}。动物模型对于理解心脏再生机制至关重要，不可或缺^3-6。许多两栖动物和鱼类在心脏受损后能够再生心肌组织，这为研究人类心血管疾病提供了重要线索^{13, 14}。然而从进化角度看，小鼠模型与人类之间的心脏病理生理过程应更为保守。哺乳动物模型中心脏再生的研究是一个相对较新但迅速发展的领域，为心力衰竭的治疗提供了新的方向^3-6。

近期，心尖切除和心肌梗死两种手术方法已被确立用于研究新生小鼠的心脏再生⁶。尽管心尖切除提供了相对简便且直接的心肌细胞丢失和/或损伤模型，但与心肌梗死相比，其主要局限在于由于术后高死亡率，该手术无法在出生后第7天（P7）之后实施⁶。然而，有多种方法可降低该手术的死亡率。对于P7幼鼠的心尖手术，可通过将幼鼠冷却至16°C以实现最佳低温麻醉效果。通常，无菌条件和熟练的手术操作对于成功实施心尖切除手术至关重要。为提高存活率，手术应尽可能快速而轻柔地进行，且采用微创操作可减少出血。此外，ICR/.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 毫米带剪刀的 Olsen-Hegar 持针器	Fine Science Tools	12002-12
2 毫米切割刃 Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-03	虹膜切除剪
热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
直齿虹膜镊，直头	Fine Science Tools	11064-07
弯齿虹膜镊，弯头	Fine Science Tools	11065-07
Shea 剪刀 - 弯头/钝头-钝头/12 厘米	Fine Science Tools	14105-12
圆柄缝合打结镊，直头	Fine Science Tools	18025-12
圆柄 Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15400-12
精细止血钳	Fine Science Tools	13007-12
放大照明灯	Luxolamp Corp	IM120
加热灯	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Prolene 缝线	Ethicon	8889H
皮肤胶-Vetbond 组织粘合剂	3M	1469
无菌棉签	Dynarex	4305
WEBCOL 酒精消毒垫	Covidien	6818	中号 2 层，每盒 200 片，含 70% 异丙醇
Curity 多用途海绵	Covidien	9024	无纺布 4 层，4"×4"（10.2 厘米×10.2 厘米）
台面保护垫	KIMTECH SCIENCE	7546	18" × 19.5"（45.72 厘米 × 49.53 厘米）× 50 片
0.9% 氯化钠溶液，250 毫升	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
碘伏消毒液棉签	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-03
高压灭菌器	TOMY Digital Biology	SX-700	高压蒸汽灭菌器
切片扫描仪	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS