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方法文章

用于研究早期哺乳动物心脏再生的顶端切除小鼠模型

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DOI：

10.3791/53488

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2016年1月23日

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

本文内容

摘要

本研究展示了一种心尖切除的逐步视频实验方案。心尖切除是近期哺乳动物心脏再生研究中备受关注的一种外科手术方法。本研究可能推动心尖切除作为心脏再生机制研究中的标准方法得以广泛应用。

摘要

由于生活方式的剧烈变化，心血管疾病困扰着全世界。心脏再生在修复和恢复因损伤和疾病而丧失的心肌细胞方面具有巨大前景。与某些低等脊椎动物强大的心脏再生能力不同，成年哺乳动物的心脏通常表现出极有限的心脏再生与修复能力。然而，近期研究发现，在出生后第1至第7天（P1至P7）期间，新生小鼠心脏在心尖切除术（即手术性心室尖端截除并暴露左心室心尖）后仍保留显著的再生潜力，这一发现引发了广泛的科学关注。对此发现的一个主要争议可能源于在尝试重复或拓展这一重要发现时所采用的多种不同的手术相关操作流程。本说明动态呈现了小鼠模型中心尖切除术的材料与方法。该啮齿类动物存活手术的关键步骤包括低温麻醉、开胸术、心室心尖的手术切除、缝合以及小鼠的术后恢复。所述方法可拓展心尖切除小鼠模型在心血管研究中的应用。

引言

人类寿命的延长导致了多种与衰老和生活方式相关的疾病，包括作为主要死亡原因的心力衰竭。然而，由于无法替代丢失或功能失调的心肌细胞，目前的治疗方法只能暂时改善心脏功能1, 2。因此，有必要发现并开发用于心脏再生与修复的创新策略。成年哺乳动物心脏的再生能力有限。来自低等脊椎动物（如有尾两栖类和硬骨鱼类）的研究为理解心脏再生背后的分子和细胞机制提供了前所未有的见解3, 4。最近，新生小鼠心脏再生模型的建立可能有助于识别和表征在人类心脏再生过程中更为进化保守的病理生理事件5。

心尖切除是指手术切除左心室心尖部分。由于该操作在较年长的小鼠中具有很高的致死率，此操作仅限于出生后1至7天（P1至P7）的小鼠6。新生小鼠在心尖切除后的心脏再生过程预期如下：（I）迅速且有效地形成血肿以封闭心尖，防止失血；（II）心肌细胞再生并恢复收缩功能5, 7。近期研究对该模型的重要性和效率引发了争议8-11。因此，清晰且详细地呈现心尖切除操作显得尤为重要。为此，本实验方案基于先前的方案6，以视频形式生动而具体地描述了我进行心尖切除的操作过程。

阐明心脏再生的分子机制对于治疗以心肌细胞丢失和/或损伤为特征的心脏疾病（如心力衰竭1, 2）具有重要意义。鉴于心尖切除术在心脏再生研究中已取得当前进展并展现出良好前景，本研究有望推动该技术在心脏再生研究中的应用与发展。

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方案

所有小鼠实验均经美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用项目批准，方案编号为 H0083R3。 NHLBI 动物实验伦理委员会批准了该方案，无需使用镇痛剂。

1. 新生小鼠的低温麻醉

  1. 手术前将海绵和外科器械在高压灭菌器中灭菌。准备好所有外科手术材料，并在手术前15–20分钟开启干热灭菌器。 提前升温至 240°C 至 270°C。
  2. 将所有C57BL/6品系乳鼠（出生后第1天）从哺乳母鼠处转移至装有新鲜垫料和筑巢材料的清洁小鼠笼中。一旦乳鼠被带入手术室，应立即进行顶端手术，以尽量缩短其与母鼠分离的时间，并降低母鼠食仔的风险。
  3. 将海绵置于冰床上，然后将一只幼崽放在海绵上约3分钟 以实现低温麻醉。通过观察呼吸暂停和运动不能，并夹捏后肢足部来确认麻醉效果。需频繁检查新生幼崽的状态，因为麻醉时间过短会导致幼崽未达到运动不能和呼吸暂停状态，而麻醉时间过长则可能降低其存活率12.

2. 开胸术

  1. 将幼鼠从冰床上转移至手术台面区域，使用胶带将其四肢和尾巴固定，呈仰卧位。
  2. 使用碘伏对胸部进行消毒，并用70%酒精棉片轻轻清洁。
  3. 使用Vannas弹簧剪在胸腔第四肋间区域做横向皮肤切口，随后钝性分离第四肋间肌，以暴露心脏。
    注意：手术过程中尽量减少出血可提高存活率。

3. 心室心尖的外科截除

  1. 用手轻轻按压腹部，使心脏尖端外露。使用无菌棉签吸除手术区域周围的血液，以获得清晰的视野。对于假手术对照组的新生小鼠，直接进入第4步（缝合与小鼠恢复）。
  2. 在放大灯下，使用虹膜剪小心地分段切除左心室（LV），直至暴露左心室腔。注意尽量减少切除的左心室组织量。通常需切除约15%，以充分暴露左心室腔。
  3. 确保在暴露左心室腔后，心脏重新回纳至胸腔内。

4. 小鼠缝合与恢复

  1. 使用无菌的Proline 6-0缝合线将肋骨和肌肉缝合在一起，以封闭胸腔，然后使用皮肤胶仔细闭合皮肤切口。
  2. 将新生仔鼠置于加热灯下保暖约3 min 以促进恢复，然后使用70%酒精消毒垫清除血液和胶水残留，再将其放回同窝仔鼠中。尽量在10 min 内完成整个手术过程，因为缩短与母鼠分离的时间可提高心尖切除术后仔鼠的存活率。
  3. 每次手术后，将手术器械与热珠灭菌器中的珠子接触约20 sec 以实现彻底灭菌。每次手术前需确保手术器械冷却至室温。
  4. 完成一窝仔鼠的所有手术后，将仔鼠与其母鼠的垫料和排泄物混合，再放回母鼠巢穴中。
    注意：通常ICR/CD-1小鼠比C57BL/6小鼠更适合作为养母，但即使遗传背景相同，不同哺乳期母鼠的哺育本能也存在差异。若为降低母鼠食仔导致的死亡率而需更换哺乳母鼠，可先将P0仔鼠转移至养母，然后在P1阶段进行心尖切除术。每窝仔鼠仅应接受假手术或心尖切除术中的一种操作，因为混合假手术和手术仔鼠可能会降低手术组仔鼠的存活率6。

5. 术后分析

  1. 术后一天观察仔鼠，确保假手术组与手术组之间无明显差异，并统计仔鼠数量以计算存活率。若手术操作得当，假手术组和手术组的存活率应相近，且均应高于60%。
  2. 心脏的分离与固定。
    1. 术后第1天和第2天通过断头法处死仔鼠，术后第21天采用CO2麻醉后行颈椎脱位确认死亡，随后用70%酒精清洁胸部。
    2. 切开胸部正中皮肤和肌肉，打开胸腔。
    3. 完整取出胸腔内的整个心脏，将每份样本的全心置于5 ml 4%多聚甲醛中，室温下过夜固定。
  3. 次日将样本转移至70%乙醇中，样本可在石蜡包埋前保存最多一周。
  4. 对整个心室进行5 µm厚的石蜡切片，并进行标准苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色，以评估再生反应5, 7。其中，H&E染色用于观察心肌组织的替代情况，Masson三色染色用于评估纤维化反应5。
  5. 使用切片扫描仪手动选择感兴趣区域，并为每份样本设置至少三个焦点。根据制造商说明，采用默认参数在40×放大倍数下对染色切片进行成像与分析。

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结果

小鼠仔鼠在心尖切除术后1天、2天和21天被实施安乐死，取其心脏进行苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色。马松三色染色中的蓝色区域表示心外膜细胞外基质的沉积5。成功实施心尖切除术后，左心室在术后1天即形成有效血凝块以封闭创面，如图1A所示。随后可观察到血凝块逐渐被吸收并出现早期心脏纤维化，之后由心肌组织逐步替代，至术后21天完成心肌的完全再生（图1B和C）。形态学分析显示，在手术后21天，切除组与假手术组心脏之间无明显差异（图1C和D）。

组织学分析，心脏组织，H&E染色，Masson三色染色，术后不同时间点比较。
图1. 典型的H&E染色和Masson三色染色结果。 新生小鼠心脏在心尖切...

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讨论

心脏再生在治疗和预防心力衰竭方面展现出巨大潜力1, 2。动物模型对于理解心脏再生机制至关重要，不可或缺3-6。许多两栖动物和鱼类在心脏受损后能够再生心肌组织，这为研究人类心血管疾病提供了重要线索13, 14。然而从进化角度看，小鼠模型与人类之间的心脏病理生理过程应更为保守。哺乳动物模型中心脏再生的研究是一个相对较新但迅速发展的领域，为心力衰竭的治疗提供了新的方向3-6。

近期，心尖切除和心肌梗死两种手术方法已被确立用于研究新生小鼠的心脏再生6。尽管心尖切除提供了相对简便且直接的心肌细胞丢失和/或损伤模型，但与心肌梗死相比，其主要局限在于由于术后高死亡率，该手术无法在出生后第7天（P7）之后实施6。然而，有多种方法可降低该手术的死亡率。对于P7幼鼠的心尖手术，可通过将幼鼠冷却至16°C以实现最佳低温麻醉效果。通常，无菌条件和熟练的手术操作对于成功实施心尖切除手术至关重要。为提高存活率，手术应尽可能快速而轻柔地进行，且采用微创操作可减少出血。此外，ICR/...

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披露

本文的出版费用由Fine Science Tools向侯健博士捐赠资助。

致谢

作者们 感谢美国国立心肺血液研究所（NHLBI）的James Hawkins博士、Zu-Xi Yu博士和Xuan Qu博士在小鼠手术以及石蜡切片的制备与染色方面提供的帮助。作者为 感谢 NIH 学者编辑委员会提供的编辑协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 毫米带剪刀的 Olsen-Hegar 持针器Fine Science Tools12002-12
2 毫米切割刃 Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15000-03虹膜切除剪
热珠灭菌器Fine Science Tools18000-45
直齿虹膜镊，直头Fine Science Tools11064-07
弯齿虹膜镊，弯头Fine Science Tools11065-07
Shea 剪刀 - 弯头/钝头-钝头/12 厘米Fine Science Tools14105-12
圆柄缝合打结镊，直头Fine Science Tools18025-12
圆柄 Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15400-12
精细止血钳Fine Science Tools13007-12
放大照明灯Luxolamp CorpIM120 
加热灯Brandt Equipment llc51152/3
6-0 Prolene 缝线Ethicon8889H
皮肤胶-Vetbond 组织粘合剂 3M 1469
无菌棉签Dynarex4305
WEBCOL 酒精消毒垫Covidien6818中号 2 层，每盒 200 片，含 70% 异丙醇
Curity 多用途海绵Covidien9024无纺布 4 层，4"×4"（10.2 厘米×10.2 厘米）
台面保护垫KIMTECH SCIENCE754618" × 19.5"（45.72 厘米 × 49.53 厘米）× 50 片
0.9% 氯化钠溶液，250 毫升Hospira Inc.NDC 0409-6138-22
碘伏消毒液棉签Purdue Products L.P.NDC 67618-153-03
高压灭菌器TOMY Digital BiologySX-700高压蒸汽灭菌器
切片扫描仪HAMAMATSUNanoZoomer 2.0-RS

参考文献

  1. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
  2. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
  3. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
  4. Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
  7. Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
  8. Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
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  10. Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
  11. Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
  12. Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
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